Yöntem makalesi

İmmünokompetan Bir Glioblastoma Kök Hücre Benzeri Hücre Modelinde Tümör İçi İmmün Hücre Antijenlerinin Substrat Tabanlı İmmünohistokimya Kullanılarak Tespiti

70 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72193

⸱

21 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, 2Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, formalinle fikse edilmiş parafin gömülü (FFPE) glioblastoma kök hücre türevli tümör doku kesitlerinde tekli ve ikili antijenlerin tutarlı tespiti için ayrıntılı ve tekrarlanabilir, substrat tabanlı bir immünohistokimya iş akışı sunmaktadır. Protokol, teknik zorlukları giderirken çeşitli immün ve tümör belirteçlerinin tanımlanmasını desteklemekte ve diğer tümör modellerinde kullanım potansiyeli taşımaktadır.

Özet

Glioblastoma (GBM), etkili tedavilerin eksik olduğu, en yaygın ve ölümcül primer beyin malignitesidir. Kısmen tedaviye dirençli GBM kök hücre benzeri hücreler (GSC'ler) tarafından yönlendirilen, derinlemesine immünsüpresif bir tümör mikroçevresi ile karakterize edilir. Burada, formalinle fikse edilmiş, parafine gömülmüş (FFPE) beyin tümörü kesitlerinde tümöre infiltre olan immün hücrelerle ilişkili yüzey ve hücre içi antijenlerin saptanması için tekrarlanabilir substrat tabanlı tek ve çift renkli immünohistokimya (IHC) protokollerini tanımlıyoruz. Beyin tümörleri, immünokompetan farelere ortotopik olarak implante edilen fare GSC'lerinden türetilmiştir. Tek renkli IHC iş akışı, bireysel immün hücre antijenlerinin görselleştirilmesi için yaban turpu peroksidaz (HRP) tabanlı kromojenik bir saptama sistemi kullanırken; çift renkli IHC iş akışı, aynı konakçının primer antikorlarını kullanan iş akışları da dahil olmak üzere, aynı doku kesiti içinde iki immün hücre antijeninin eş zamanlı saptanması için ardışık bir alkali fosfataz (AP) tabanlı boyama stratejisi uygular. Bu yöntemler, GBM dokularındaki tümöre infiltre olan immün hücre ilişkili antijenlerin kromojenik analizi için pratik ve tekrarlanabilir bir çerçeve sunmakta olup diğer preklinik tümör modellerine ve potansiyel olarak insan FFPE örneklerine uyarlanabilir.

Giriş

Glioblastoma (GBM); mevcut standart bakım tedavilerine rağmen hastaların düşük sağkalım oranlarıyla ilişkilendirilen, agresif, oldukça invaziv ve heterojen bir primer malign beyin tümörüdür1. GBM'nin belirleyici bir özelliği, immünoterapötik stratejilere karşı direnç oluşmasına katkıda bulunan, derinlemesine immünosüpresif tümör mikroçevresidir (TME)2,3. Efektör T hücrelerinin azalmış infiltrasyonu ile T hücresi disfonksiyonu ve tükenmişliğinin indüksiyonu dahil olmak üzere birçok mekanizma GBM'de immünosüpresyonu tetikler4. Ayrıca, GBM hücrelerinin bir alt popülasyonu olan GBM kök benzeri hücreler (GSC'ler), sınırlı sitotoksik immün aktivite ile karakterize olan immünolojik olarak "soğuk" bir TME'yi sürdürerek immün kaçışı daha da teşvik eder5. Bu özellikler, GBM TME'sindeki tümörle ilişkili infiltre immün hücre popülasyonlarının ve bunların fonksiyonel durumlarının doğru şekilde karakterize edilmesinin önemini vurgulamaktadır.

İmmünohistokimya (IHC), doku mimarisini korurken hücresel belirteçlerin in situ görselleştirilmesine, lokalizasyonuna ve yarı nicel değerlendirmesine olanak tanıdığı için tümör dokularındaki immün hücre infiltrasyonunu değerlendirmede en yaygın kullanılan yöntemlerden biri olmaya devam etmektedir6,7,8,9,10,11,12. Önceki immünohistokimyasal ve immünoprofilleme çalışmaları, GBM immün manzarasına dair anlayışımızı önemli ölçüde geliştirmiş ve tümör progresyonu ile terapötik yanıtla ilişkili immün hücre popülasyonlarını tanımlamıştır12,13,14,15,16. Tek renkli kromojenik IHC, formalinle fikse edilmiş, parafine gömülmüş (FFPE) doku kesitlerinde bireysel immün belirteçlerin saptanması için özellikle kullanışlıdır12,13,15,17,18,19,20. Buna karşılık, çift renkli kromojenik IHC, aynı doku kesitinde iki belirtecin eş zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayarak hücresel fenotipin, proliferasyonun veya aktivasyon durumunun değerlendirilmesini kolaylaştırır12,19,21.

Bu ilerlemelere rağmen, immünokompetan GSC kaynaklı GBM modellerine uygulanabilir, pratik ve standartlaştırılmış substrat tabanlı kromojenik IHC protokolleri sınırlı kalmıştır. Ayrıca, seyrek ve heterojen immün hücre infiltrasyonu, geniş intratümöral heterojenite ve oldukça immünsüpresif ve kompleks TME nedeniyle; aynı doku kesiti içindeki birden fazla hücresel popülasyonun doğru şekilde görselleştirilmesini ve yorumlanmasını zorlaştıran faktörler sebebiyle kromojenik IHC, GBM'de birçok diğer solid tümöre göre daha zorlayıcıdır2,3,4. Çift kromojenik IHC, özellikle her iki primer antikorun aynı konak türde üretildiği durumlarda ek teknik zorluklar sunmakta; bu durum antikor uyumluluğunun dikkatli optimizasyonunu, aynı doku kesiti içinde iki antijenin eş zamanlı tespiti için ardışık bir boyama stratejisini ve ışık mikroskobu altında net marker ayrımı sağlamak için uygun bir kromojenik substrat seçimini gerektirmektedir.

Burada, immünokompetan ortotopik 005 GSC kaynaklı GBM modelinde22,23,24 temsili tümöre sızan immün hücrelerle ilişkili yüzey ve hücre içi antijenleri başarıyla tespit eden, tekrarlanabilir substrat tabanlı tek ve çift renkli IHC protokollerini tanımlıyoruz. Bu substrat tabanlı kromojenik IHC protokolleri, diğer preklinik tümör modellerine ve potansiyel olarak insan FFPE tümör örneklerine de uyarlanabilir. Hasat edilen fare beyin dokuları, daha önce açıklandığı üzere19 rutin doku işleme ve parafin gömme işlemlerinden önce %10 nötr tamponlu formalin içinde gece boyunca (~12 h) fikse edilmiştir. FFPE blokları, pozitif yüklü mikroskop cam lamlarına kesilmiş (5 µm kalınlık19) ve kullanıma kadar oda sıcaklığında saklanmıştır. Tek renkli IHC, ışık mikroskobu altında bireysel antijenlerin görüntülenmesi için kahverengi bir sinyal oluşturmak amacıyla substrat olarak 3,3′-diaminobenzidine (DAB) kullanan horseradish peroxidase (HRP) tabanlı bir kromojenik tespit sistemi kullanır. Bu iş akışı, FFPE doku kesitlerinde hem membranla ilişkili hem de hücre içi antijenlerin tespiti için uygundur.

Çift renkli IHC, aynı doku kesiti içinde iki antijenin eş zamanlı tespitine olanak tanır ancak antikor uyumluluğunu ve net kromojenik sinyal ayrımını sağlamak için ek optimizasyon gerektirir. Primer antikorlar farklı konak türlerde üretildiğinde, türe özgü sekonder antikorların kullanımına izin verildiği için çift renkli IHC boyaması nispeten kolaydır. Bununla birlikte, her iki primer antikor aynı konak türden geldiğinde eş zamanlı tespit teknik olarak daha zor hale gelir. Bu zorluğu gidermek için, burada açıklanan çift renkli IHC iş akışı, ışık mikroskobu altında iki antijen sinyali arasında net bir görsel ayrım sağlamak amacıyla farklı substratlar kullanan ardışık bir alkali fosfataz (AP) tabanlı kromojenik boyama stratejisi kullanır.

Her iki iş akışı da doku deparafinizasyonu, rehidrasyon, antijen geri kazanımı, bloklama, boyama, dehidrasyon, şeffaflaştırma ve montaj adımlarını içerir. Reaktiflerin hazırlanması, boyama kalitesi ve tekrarlanabilirlik açısından kritik öneme sahiptir (bkz. Ek Dosya 1). Benzer şekilde, primer antikorların uygun dilüsyonları da başarılı bir boyama protokolü için kritiktir ve bu işlem, ilgili sekonder antikorun konakçı türüne bağlı olarak, kullanımdan hemen önce %2,5 normal at veya keçi serumu ile gerçekleştirilir (bkz. Tablo 1). Tek ve çift renkli boyama için kullanılan türe özgü sekonder antikorların bir listesi Tablo 2'de sunulmuştur. Tek renkli IHC, ksilen bazlı şeffaflaştırma ve montaj reaktifleri kullanırken; substrat kısmen ksilen içinde çözünür olduğundan, çift renkli IHC ksilen içermeyen alternatifler (örneğin, Histo-Clear) gerektirir (substrat listesi için bkz. Tablo 3).

Protokol

Bu protokol, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) dahil olmak üzere tüm ilgili düzenleyici ve kurumsal kılavuzlara uygun olarak yürütülmüştür (IACUC protokol numaraları: 2004N000067 ve LA24-0045).

NOT: Hem tek renkli hem de çift renkli IHC protokollerindeki birçok adım, etanol ve doku şeffaflaştırma ajanları dahil olmak üzere yanıcı reaktifler içerir. Buna göre; deparafinizasyon, rehidrasyon, dehidrasyon, şeffaflaştırma ve mount işlemi dahil olmak üzere yanıcı kimyasallar içeren prosedürler, uygun laboratuvar güvenlik uygulamaları kullanılarak sertifikalı bir kimyasal çeker ocakta gerçekleştirilmelidir. Yanıcı reaktifler, kurumsal güvenlik yönergelerine uygun olarak, belirlenmiş yanıcı madde depolama dolaplarında, uygun şekilde etiketlenmiş, vidalı kapaklı cam kaplarda hazırlanmalı ve saklanmalıdır. Materyaller ve reaktif hacimleri, iş akışı deneysel ihtiyaçlara göre kolayca ölçeklendirilebilse de, en fazla 48 mikroskop lamının (her biri 24 lam içeren iki boyama rafı) toplu işlenmesine göre yapılandırılmıştır.

1. FFPE beyin tümörü kesitleri için tek renkli İHK

NOT: Aşağıdaki protokol, ortotopik 005 GSC modelinden türetilen FFPE beyin tümörü kesitlerinde temsilci yüzey ve hücre içi antijenlerin saptanması için substrat tabanlı tek renkli IHC yöntemini açıklamaktadır.

  1. Deparafinizasyon (20 dk):
    1. Slaytları bir polioksimetilen (POM) slayt rafına yerleştirin ve slayt rafını sırasıyla Xylene I ve ardından Xylene II boyama kaplarına daldırarak, her birinde 10 dakika boyunca bir çeker ocak içerisinde bekletin. Deparafinizasyon sırasında doku kesitlerinin ksilen içinde tamamen daldırılmış olduğundan emin olun.
      DİKKAT: Bu adımı; laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük, yüz maskesi ve eldiven dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu donanım (KKD) kullanarak bir kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirin. Doku hasarına ve kesit kaybına yol açabileceği için bu aşamada veya sonraki adımların herhangi birinde kesitlerin kurumasına izin vermeyin. Ksilen çözeltilerini hava sızdırmaz cam kaplarda saklayın ve temiz görünüyorlarsa yeniden kullanın.
  2. Kademeli rehidrasyon (15 dk):
    1. Kesitleri sırasıyla %100, %90 ve %70'lik etanol içerisinde 5'er dakika boyunca rehidre edin. Bunun için lamları boyama kabındaki %100'lük etanola 5 dakika boyunca daldırın (ardından %100'lük etanolü yeniden kullanmak üzere cam şişeye geri boşaltın), ardından 5 dakika boyunca %90'lık etanola (sonra şişeye geri boşaltın) ve son olarak 5 dakika boyunca %70'lik etanola (sonra şişeye geri boşaltın) daldırın.
      DİKKAT: Bu adımı kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirin ve adım 1.1'de belirtilen kişisel koruyucu donanımı (KKD) kullanın. Bu etanol çözeltileri, temiz göründükleri sürece hava sızdırmaz cam kaplarda saklanarak farklı deneylerde yeniden kullanılabilir.
  3. Su ile durulama (5 dk):
    1. Slaytları 5 dakika boyunca distile suda bekletin; böylece rehidrasyon işlemi tamamlanmış olur.
      NOT: Bu adım gerçekleştirilirken, 1 lam rafı için 600 mL veya 2 lam rafı için 800 mL 1 hazırlayın.× listelenen talimatlara uygun olarak, 2 L'lik mikrodalgaya uygun cam beherin içerisine antijen geri kazanım tampon çözeltisi (10 mM sodyum sitrat tamponu) Ek Dosya 1'de.
  4. Antijen geri kazanımı (~20 dk):
    1. Taze hazırlanmış 10 mM sodyum sitrat antijen geri kazanım tamponu içeren 2 L'lik beherin ağzını, ön ısıtma ve uzun süreli mikrodalga ısıtması sırasında aşırı buharlaşmayı önlemek için streç filmle kapatın.
    2. Doku kesitleri kaynatılırken oluşan aşırı basınç nedeniyle tampon çözeltinin dışarı püskürmesini önlemek için streç filme birkaç delik açın.
      NOT: Adım 1.1'deki gibi kişisel koruyucu donanım kullanın.
    3. Taze hazırlanmış 10 mM sodyum sitrat antijen geri kazanım tampon çözeltisini 3 dakika boyunca ön ısıtmaya tabi tutun. Rehidre edilmiş doku kesitlerinin bulunduğu lam rafını, önceden ısıtılmış antijen geri kazanım çözeltisinin içine yerleştirin.
    4. Ardından doku kesitlerini, en yüksek mikrodalga gücünde (örneğin, P10) 15 dakika boyunca mikrodalgada işleyin; bu sırada kesitlerin batık kaldığından ve buharlaşma nedeniyle kurumadığından emin olmak için beheri dikkatle izleyin.
      NOT: Alternatif olarak, daha az izleme gerektiren ve daha yumuşak bir ısıtma yöntemi sunan, bir buhar pişirici içine yerleştirilmiş plastik bir boyama teknesinde yaklaşık 15 dakika boyunca antijen geri kazanımı gerçekleştirin. Sodyum sitrat tamponu (10 mM, pH 6,0), aşağıda listelenen tüm primer antikorlar için antijen geri kazanım tamponu olarak başarıyla valide edilmiş ve kullanılmıştır. Tablo 1. Birincil antikora ve üretici tavsiyelerine bağlı olarak, bu çalışmada değerlendirilmeyen antikorlar için EDTA veya Tris-EDTA gibi diğer tamponlar gerekebilir. 
  5. Soğutma (10–20 dk):
    1. Beheri mikrodalga fırından çıkarın, çalışma tezgahına yerleştirin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Soğutmayı hızlandırmak için beheri yaklaşık 10 dakika boyunca buz gibi soğuk musluk suyunda bekletin.
      DİKKAT: Aşırı sıcak olacaktır; tutmak için uygun ısıya dayanıklı eldivenler veya beher maşası kullanın. Adım 1.1'deki gibi kişisel koruyucu donanım (KKD) kullanın.
  6. Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) ile yıkama (~10 dk):
    1. Slayt rafını beherden çıkarın ve slaytları 1'e daldırın× Boyama kabındaki DPBS çözeltisi.
    2. Kesitleri 1 içerisinde iki kez durulayın× dokuların ayrılmasını önlemek için nazik ve statik yıkamalarla, her biri 5 dakika boyunca DPBS ile yıkayın.
  7. Hidrofobik Bariyer (<1 dk/lam):
    1. DPBS yıkaması sırasında (adım 1.6), her bir lamı dikkatlice tek tek çıkarın ve doku kesitiyle temas etmemeye özen göstererek, doku kesitinin çevresini tüy bırakmayan mendillerle (örneğin Kim Wipes) nazikçe silin.
    2. Her bir doku kesitinin etrafına, peroksidaz-antiperoksidaz (PAP) kalemi gibi hidrofobik bir bariyer kullanarak sıvı itici bir çerçeve çizin ve ardından lamı boyama kabındaki DPBS yıkama çözeltisine geri koyun. Bu adımları tüm lamlar için tekrarlayın.
      NOT: Dokunun etrafındaki hidrofobik bariyer, kesitler arasında reaktif taşmasını önler ve antikorların doku üzerinde tutunmasına yardımcı olur.
  8. Endojen peroksidazı bloke edin (5 dk):
    1. Atık haline getirin 1× boyama kabındaki DPBS'yi boşaltın, ardından %3 H₂O₂ lamların veya doku kesitlerinin 5 dakika boyunca tamamen daldırıldığından emin olarak çözeltiye yerleştirin.
      NOT: %3'lük H2O2 içerisinde uzun süreli inkübasyon₂O₂ dokulara zarar verebilir. Endojen peroksidaz aktivitesinin bloke edilmesi, renk gelişimi sırasında endojen peroksidazın neden olduğu arka planı önlemek için kritik bir adımdır. Adım 1.1'de olduğu gibi KKD kullanın.
  9. DPBS ile yıkama (~12 dk):
    1. %3'lük H2O2'yi atın₂O₂ solüsyon ve lamları tekrar 1 içinde durulayın× 5'er dakika olmak üzere iki kez DPBS ile yıkayın.
    2. İkinci yıkamanın ardından lamları lam rafından çıkarın, nemlendirme kabına düz bir şekilde yerleştirin ve nemlendirme kabının kenarlarına distile su ekleyin.
    3. Kesitlerin kurumasına izin vermeyin, bu nedenle hemen adım 1.10'daki bloklama işlemine geçin.
      NOT: Listelenen her nemlendirilmiş oda Materyal Tablosu 30 lam için yer ayrılmıştır ve 30 lam kapasitesine sahiptir.
  10. Serum bloklama (~70 dk):
    1. 50 ekleyin µkesit başına L %5 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi ekleyin ve doku kesitlerinden bloklama tamponunun buharlaşmasını önlemek için nemlendirilmiş hazne kapağı kapalı halde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
    2. 30 dakika sonra, BSA'yı uzaklaştırmak için lamlara, tezgah üzerine yerleştirilmiş tüy bırakmayan mendiller üzerinde hafifçe vurun.
    3. Ardından, sekonder antikorun konakçı türüyle eşleşen %2,5'lik normal at veya keçi serumu ekleyin (kesit başına bir damla) ve kesitleri nemlendirilmiş oda kapağı kapalı halde, oda sıcaklığında 30 dakika daha inkübe edin; serumu uzaklaştırmak için lamların üzerine emici kağıt veya tüy bırakmayan mendillerle hafifçe vurun ve vakit kaybetmeden adım 1.11'e geçin.
      NOT: Kesitlerin kurumasına izin vermeyin. Primer antikorları uygun bloklama tamponunda seyrelterek hazırlayın (bakınız Tablo 1bloke etme adımı tamamlandığında 1.11 adımında kullanıma hazır olacakları için, bloke etme işleminin sonuna doğru...
  11. Birincil antikor inkübasyonu (~16 sa):
    1. ~50 uygulayın µuygun bloklama tamponunda optimum şekilde seyreltilmiş primer antikorların L miktarı (bkz. Tablo 1), doku kesitlerine uygulayın ve 4°C'de gece boyunca (~16 sa) inkübe edin °nemlendirilmiş bir oda içerisinde C.
      NOT: Nemlendirme odasının belirlenmiş alanlarının, odanın gece boyunca nemli kalmasını sağlamak için distile su ile doldurulduğundan emin olun. Ayrıca, doku kesitlerinin su altında kalmasına neden olabileceğinden, doku lamları için ayrılmış alanların/odaların distile su ile doldurulmaması için önlem alın.
  12. DPBS (%0,1 Tween 20) ile yıkama (~18–20 dk):
    1. Bir boyama kabının içine bir lam rafı yerleştirin ve kabı yıkama tamponu (1× DPBS, %0,1 Tween 20).
    2. Gece boyu inkübasyonun ardından lamları nemlendirilmiş bölmeden çıkarın, lamları emici kağıda hafifçe vurarak primer antikorları uzaklaştırın ve ardından lamları yıkama tamponuna (1× bir boyama kabında (DPBS, %0,1 Tween 20) ve yıkama tamponunu dökün.
    3. Ardından, kesitleri 1 içinde yıkayın× Üç kez, her biri 5 dakika boyunca DPBS (%0,1 Tween 20) ile yıkayın; ardından lamları lam rafından çıkarıp nemlendirilmiş hazneye düz bir şekilde yerleştirin ve derhal adım 1.13'e geçin.
      NOT: Adım 1.15'teki renk gelişimi sonrası arka plan boyanmasının yüksek olduğu görülürse, her bir yıkama süresi 10-15 dakikaya uzatılabilir. Dokuların lamlardan ayrılmasını önlemek için yıkama işlemi nazikçe ve statik olarak (sallama veya çalkalama yapmadan) gerçekleştirilmelidir.
  13. Sekonder antikor inkübasyonu (~32–35 dk):
    1. Uygun HRP-konjuge ikincil antikordan (duruma göre anti-tavşan veya anti-sıçan IgG; bakınız) bir damla/kesit ekleyin Tablo 2) ve doku kesitlerini, nemlendirilmiş hazne kapağı kapalı şekilde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Adım 1.15'te arka plan gürültüsünü azaltmak için sekonder antikor, PBS ile 1:1 oranında seyreltilebilir.
  14. DPBS (%0,1 Tween 20) ile yıkama (~18–20 dk):
    1. Sekonder antikor ile inkübasyonun ardından, lamları nemlendirilmiş bölmeden çıkarın ve sekonder antikorları uzaklaştırmak için lamlara emici kağıt üzerinde hafifçe vurun.
    2. Ardından, lamları yıkama tamponu (1× (0,1% Tween 20 içeren DPBS) ile boyama kabı içerisinde kısa bir yıkama yapın ve yıkama tamponunu dökün.
    3. Ardından, doku kesitlerini 1 ile üç kez yıkayın× Her biri için 5 dakika boyunca DPBS (%0,1 Tween 20).
      1. Kromojen geliştirme aşamasına (yani adım 1.15) başlamadan önce, kromojenik reaksiyonu durdurmak amacıyla adım 1.16 için bir hazırlık adımı olarak, ayrı bir lam rafını distile su ile doldurulmuş bir boyama kabına yerleştirin.
      2. Son yıkama sırasında, DAB çalışma çözeltisini taze olarak hazırlayın (1 mL substrat başına 1 damla kromojen; bakınız Ek Dosya 1).
  15. Kromojen gelişimi (30 sn–5 dk):
    1. Adım 1.14'teki üçüncü yıkamadan sonra, lamları lam rafından çıkarın ve beyaz arka planlı çalışma tezgahına düz bir şekilde yerleştirin.
    2. 50 uygulayın µher bir kesite L DAB çalışma çözeltisi ekleyin ve beyaz bir arka plan üzerinde veya ışık mikroskobu altında kahverengi renk oluşumunu görsel olarak izleyin.
      NOT: Adım 1.1'de olduğu gibi KKD kullanın. Beyaz emici kağıt kullanmak, DAB kromojen aşamasında kahverengi renk oluşumunun gözlemlenmesine yardımcı olur. Renk oluşumu bazı markörler için 20–60 saniye, diğerleri için ise 2–5 dakika sürebilir (ayrıntılar için adım 1.16'ya bakınız).
  16. Reaksiyonu durdurma (1–2 dk):
    1. Adım 1.15'te istenen kahverengi renk sinyali görünür görünmez, lamı adım 1.14.3.1'de hazırlanan distile su kabına daldırarak reaksiyonu derhal durdurun.
    2. Slaytları 1 dakika boyunca distile su ile durulayın. Distile suyu dökün, ardından adım 1.17'ye (karşıt boyama) geçin.
      NOT: Lamlar, boyamayı etkilemeden 1 saate kadar distile su içerisinde bekletilebilir. Renk gelişimi için gereken süre, durdurma reaksiyonu adımının ne zaman başlatılacağını belirler. Ayrıca, aynı lam üzerinde (bu çalışmada olduğu gibi) 2–3 belirteç (CD3, CD4, CD8 veya diğerleri gibi) bulunuyorsa, reaksiyon süreleri farklılık gösterebilir; örneğin, burada açıklanan sistemde renk gelişimi CD8 için genellikle yaklaşık 30 saniye sürer.+ hücreler, CD3 için 1–3 dk+ veya CD4+ hücreler veya Granzyme B için daha uzun (3–5 dk)+ ve Ki67+ hücreler. Renk oluşum zamanlamasındaki farklılıklar nedeniyle, reaksiyonu durdurmak için lamın tamamı distile suya daldırılamaz. Bunun yerine, her bir bölüme 200–300 ekleyerek her reaksiyonu her kesit için ayrı ayrı durdurun µher bir bölüme doğrudan L distile su.
  17. Karşı boyama (<1 dk):
    1. Kahverengi boyama ile kontrastı artırmak için, lamların seyreltilmiş hematoksilin içerisinde yaklaşık 10-20 saniye boyunca kaldığından emin olarak boyama kabına seyreltilmiş hematoksilin (distile suda 1:3) ekleyin.
      NOT: DAB arka planı güçlüyse, karşıt boyamayı daha uzun süre (1 dakikaya kadar) gerçekleştirin veya kısa süreliğine seyreltilmemiş hematoksilin kullanın.
  18. Musluk suyu ile yıkama (6 dk):
    1. Boyama kabındaki hematoksilini boşaltın ve yeniden kullanmak üzere cam şişeye geri koyun.
    2. Slaytları 1 dakika boyunca musluk suyuyla durulayın, ardından kesitlerin doğrudan su akışına bakmadığından emin olarak 5 dakika boyunca yavaş akan musluk suyuyla durulayın. Musluk suyunu boşaltın ve adım 1.19'e geçin.
      NOT: Montaja kadar olan kalan adımlar bir çeker ocakta gerçekleştirilir.
  19. Kademelidehidrasyon (15–17 dk):
    1. Slaytları boyama kabı içerisindeki %70'lik etanole 5 dakika boyunca daldırın (ardından %70'lik etanolü yeniden kullanmak üzere cam şişeye geri koyun), ardından %90'lık etanole 5 dakika daldırın (sonra şişeye geri koyun) ve son olarak %100'lük etanole 5 dakika daldırın (sonra şişeye geri koyun).
    2. Adım 1.20'ye geçiniz.
      NOT: Bu adımı kimyasal çeker ocak içerisinde gerçekleştirin. Budehidratasyon adımında, adım 1.2'deki etanol çözeltileri kullanılır ve temiz göründükleri sürece defalarca yeniden kullanılabilirler.
  20. Şeffaflaştırma:
    1. Doku kesitlerini/lamlarını temizlemek için deparafinizasyon (adım 1.1) aşamasında kullanılan Ksilen I ve II çözeltilerinin aynısını kullanın.
    2. Öncelikle, lamları boyama kabındaki Xylene I çözeltisine 10 dakika boyunca daldırın (ardından Xylene I'i yeniden kullanmak üzere cam şişeye geri koyun) ve sonrasında Xylene II çözeltisinde 10 dakika daha bekletin.
    3. Slaytları, kapatma işlemi (yani adım 1.21) tamamlanana kadar Ksilen II içinde bekletin.
      NOT: Kesitlerin kuruması onları kırılgan hale getireceğinden, bu adım sırasında kesitlerin asla kurumasına izin vermeyin; bu nedenle, gerekirse kesitler montaj için Xylene II içerisinde daha uzun süre tutulabilir.
  21. Montaj:
    1. Lamları Xylene II içerisinden tek tek çıkarın ve bir kimyasal çeker ocak içerisinde düz bir şekilde yerleştirin. Uygun boyutlu bir lamelle üzerine bir damla ksilen bazlı kapatma medyumu damlatın, ardından kapatma lamellini, kapatma medyumu doku kesitlerine bakacak şekilde lamın üzerine yerleştirin.
    2. Kapak camına başparmakla hafifçe bastırarak, montaj ortamının her üç kesite eşit şekilde yayılmasını sağlayın ve hava kabarcıklarını giderin.
      NOT: 24 × bir lam üzerindeki üç kesiti kapatmak için 50 mm'lik lamel gereklidir; 24 × iki kesit için 40 mm lamelle; ve 24 × Tek kesit için 24 mm'lik lameller kullanılır. Çeker ocaktaki sürekli hava akışı nedeniyle kapatma medyumu hızla kuruyabildiğinden, her lam için kapatma işleminin 30 saniye içinde tamamlanması önemlidir; aksi takdirde Xylene II lam üzerinden hızla buharlaşarak kesitlerin kırılgan hale gelmesine neden olur.
  22. Hava ile kurutma ve ışık mikroskobisi:
    1. Lamları, değerlendirme ve ışık mikroskobu ile görüntüleme öncesinde çeker ocakta en az 2 saat boyunca havada kurutun. Kuruma işlemi tamamlandıktan sonra, monte edilmiş lamları lama kutularında oda sıcaklığında yıllarca saklayabilirsiniz.

2. FFPE beyin tümörü kesitleri için çift renkli IHC

NOT: Aşağıdaki protokol, aynı FFPE beyin tümörü kesitindeki iki antijenin eş zamanlı tespiti için substrat tabanlı çift renkli kromojenik IHC iş akışını açıklamaktadır. Tek renkli IHC ile karşılaştırıldığında, çift renkli iş akışı, her boyama turu için gece boyu inkübasyon adımlarını da içeren bağımsız primer antikor inkübasyonlarıyla ardışık boyama döngüleri gerektirdiğinden daha fazla zaman alıcıdır. Bununla birlikte, bu genişletilmiş iş akışı, doku morfolojisini korurken ve ışık mikroskobunda net kromojenik sinyal ayrımını sürdürürken aynı doku kesiti içinde güvenilir eş zamanlı antijen tespitine olanak tanır.

  1. Deparafinizasyon (20 dk):
    1. Kimyasal çeker ocak altında, tek renkli IHC için adım 1.1'de belirtilen deparafinizasyon sürecini takip edin, ancak ksilen bazlı olmayan berraklaştırıcı ajanlar kullanın (örneğin, ksilen yerine Histo-Clear I ve Histo-Clear II).
      DİKKAT: Adım 1.1'de olduğu gibi KKD kullanın ve bu adımı kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirin. Kromojen ksilen içinde kısmen çözündüğü için Histo-Clear önerilir ve ksilen içermeyen işlem, çift renkli IHC sırasında boyama yoğunluğunun korunmasına yardımcı olur. Kesitlerin kurumasına izin vermeyin. Bu berraklaştırma çözeltileri, hava geçirmez cam kaplarda saklandıkları ve temiz göründükleri sürece yeniden kullanılabilir.
  2. Kademeli rehidrasyon (15 dk):
    1. Adım 1.2'de belirtilen tek renkli IHC ile aynıdır. Kesitleri, her adımda 5 dk boyunca etanol konsantrasyonunun kademeli olarak azaldığı (100%, 90% ve 70%) bir sıralama ile rehidrate edin.
      ​NOT: Adım 1.2'deki tek renkli IHC için kullanılan dereceli etanol muhtemelen Ksilen II ile kontamine olduğu için burada ayrı bir ksilen içermeyen dereceli etanol seti kullanılır.
  3. Su ile durulama (5 dk):
    1. Adım 1.3'teki tek renkli IHC ile aynıdır; rehidrasyon işlemini tamamlamak için lamları 5 dk boyunca distile suda bekletin.
      ​NOT: Adım 1.3 ile aynıdır; bu 5 dakikalık süre zarfında antijen geri kazanım çözeltisini hazırlayın.
  4. Antijen geri kazanımı (~20 dk): Adım 1.4'te tek renkli IHC için belirtilen antijen geri kazanım prosedürünü takip edin.
  5. Soğutma (10–20 dk): Adım 1.5'te tek renkli IHC için açıklanan soğutma sürecini takip edin.
  6. DPBS yıkama (10 dk): Adım 1.6'da tek renkli IHC için belirtilen antijen geri kazanım çözeltisinin yıkanarak uzaklaştırılması sürecini takip edin.
  7. Hidrofobik bariyer (<1 dk/lam):
    1. Adım 2.6'daki DPBS yıkaması sırasında, adım 1.7'deki süreç/protokolü takip ederek doku kesitlerinin etrafına hidrofobik bir bariyer oluşturun.
    2. Her bir doku kesitinin etrafına sıvı itici bir bariyer çizmek için hidrofobik bariyer kalemi kullanın, ardından lamı boyama kabındaki DPBS yıkama çözeltisine geri koyun. Bu adımları tüm lamlar için tekrarlayın.
  8. Alkalen fosfataz bloklama (5 dk):
    1. Tüm doku kesitlerinde hidrofobik bariyerler tamamlandıktan sonra, lamları boyama kabından çıkarın, nemlendirilmiş hazneye düz bir şekilde yerleştirin, kesit başına bir damla endojen alkalen fosfataz bloklama çözeltisi (örneğin, BLOXALL) ekleyin ve kesitleri 5 dk inkübe edin. Hemen adım 2.9'a geçin.
      ​NOT: Çift renkli IHC protokolünde AP-konjugeli sekonder antikorlar kullanıldığından, kırmızı veya mavi renk gelişimi sırasında arka plan sinyalini azaltmak için endojen alkalen fosfataz aktivitesini bloklamak esastır. Endojen alkalen fosfatazı inhibe etmek için burada BLOXALL bloklama çözeltisi kullanılır. Bu çözelti ayrıca endojen peroksidazı da inhibe eder, bu nedenle bu bloklama çözeltisi, tek renkli IHC protokolünde %3 H₂O₂ çözeltisi yerine endojen peroksidaz aktivitesini bloklamak için de kullanılabilir.
  9. DPBS yıkama (10 dk):
    1. Lamları boyama kabındaki 1× DPBS çözeltisi ile her biri 5 dk olmak üzere iki kez durulayın.
    2. İkinci yıkamadan sonra lamları boyama kabından çıkarın, nemlendirilmiş hazneye düz bir şekilde yerleştirin ve nemlendirilmiş haznenin kenarlarına distile su ekleyin.
      NOT: Kesitlerin kurumasına izin vermeyin, bu nedenle hemen adım 2.10'daki spesifik olmayan antijen-antikor bağlanmasının bloklanması işlemine geçin.
  10. Serum bloklama (~70 dk):
    1. Adım 1.10'da belirtilen tek renkli IHC protokolündeki serum bloklama sürecini takip edin.
      1. Öncelikle, oda sıcaklığında 30 dk boyunca evrensel bloklama tamponu (%5 BSA; 50 µL/kesit) ile, ardından sekonder AP-konjugeli anti-rabbit IgG antikorunun konakçı türüyle eşleşen %2,5 normal at serumu (bir damla/kesit) ile nemlendirilmiş hazne kapağı kapalı olarak oda sıcaklığında 30 dk daha bloklama yapın.
      2. Bu sürenin ardından, serumu uzaklaştırmak için lamlara emici kağıt üzerinde hafifçe vurun ve adım 2.11'e geçin.
        NOT: Adım 1.10'da açıklandığı gibi, bloklama adımının son dakikasında primer antikor I'i (bkz. Tablo 1) hazırlayın.
  11. Primer antikor I inkübasyonu (~16 sa):
    1. Adım 1.11'deki primer antikor ile aynı inkübasyon sürecini takip edin. Örneğin, her bir doku kesitine %2,5 normal at serumu içinde 1:100 oranında seyreltilmiş ~50 µL rabbit anti-CD3 antikoru ekleyin (bkz. Tablo 1).
    2. Nemlendirilmiş bir haznede 4 °C'de gece boyunca (~16 sa) inkübe edin.
  12. DPBS (%0,1 Tween 20) yıkama (~18–20 dk):
    1. Adım 1.12'de tek renkli IHC protokolü için belirtilen aynı yıkama prosedürünü (her biri 5 dk olan 3 yıkama adımı) takip edin.
    2. Üçüncü yıkamadan sonra lamları nemlendirilmiş haznenin içine düz bir şekilde yerleştirin. Hemen adım 2.13'e geçin.
      NOT: Adım 1.12 ile aynı notlar geçerlidir; örneğin, her yıkama süresi 10–15 dk'ya uzatılabilir ve yıkama nazik ve statik olmalıdır. Kesitlerin kurumasına izin vermeyin.
  13. Sekonder antikor I inkübasyonu (~32–35 dk):
    1. Kesit başına bir damla AP-konjugeli anti-rabbit IgG sekonder antikoru ekleyin (bkz. Tablo 2) ve doku kesitlerini nemlendirilmiş hazne kapağı kapalı olarak oda sıcaklığında 30 dk inkübe edin.
      NOT: Adım 2.15'teki arka planı azaltmak için sekonder antikor PBS ile 1:1 oranında seyreltilebilir.
  14. DPBS (%0,1 Tween 20) yıkama (~18–20 dk):
    1. Adım 1.14'teki gibi 1× DPBS/%0,1 Tween 20 ile aynı yıkama prosedürünü takip edin.
    2. NOT: Son yıkama adımı sırasında, üretici talimatlarına göre (bkz. Ek Dosya 1'deki reaktif hazırlama) substrat çalışma çözeltisini (önerilen 5 mL; bkz. Tablo 3) taze olarak hazırlayın.
  15. Kırmızı renk gelişimi (12–15 dk):
    1. Adım 2.14'ü tamamladıktan sonra, adım 1.15'te açıklandığı gibi lamları beyaz emici kağıt gibi beyaz arka planlı bir çalışma tezgahına düz bir şekilde yerleştirin.
    2. Taze hazırlanan kırmızı substrat çalışma çözeltisini iyice karıştırın, ardından her bir doku kesitine 50 µL ekleyin (artan çözeltiyi atın).
    3. Doku kesitlerini, beyaz bir arka planda veya ışık mikroskobu altında her 2–3 dakikada bir periyodik olarak kontrol ederek kırmızı renk görünene kadar oda sıcaklığında inkübe edin.
      NOT: Kırmızı renk gelişimi için gereken süre markerlar arasında farklılık gösterir ve 20–30 dk sürebilir. Ancak, AP-deteksiyon sistemi ile 005 beyin tümörü kesitlerindeki CD3+ hücrelerin boyanması için kırmızı renk gelişimi genellikle 12–15 dk içinde gerçekleşir.
  16. Tampon durulama (5 dk):
    1. Adım 2.15'te istenen kırmızı renk sinyali görünür görünmez, kesitleri bir boyama kabı içinde 1× DPBS/%0,1 Tween 20 ile 5 dk boyunca durulayın.
    2. Bu yıkama süresi boyunca, primer antikor II'yi uygun bir bloklama tamponu içinde (örneğin, %2,5 normal at serumu içinde 1:100 oranında seyreltilmiş rabbit anti-Ki67 antikoru; bkz. Tablo 1) taze olarak hazırlayın.
      NOT: Tek renkli IHC'de (adım 1.16) kullanılan distile su durulamasının aksine, burada DPBS/%0,1 Tween 20 sadece reaksiyonu durdurmak için değil, aynı zamanda fazla kromojeni titizlikle yıkamak ve ikinci boyama döngüsüne hazırlık yapmak için kullanılır.
  17. Primer antikor II inkübasyonu (~16 sa):
    1. Lamları nemlendirilmiş bir hazneye alın ve her bir doku kesitine taze hazırlanmış ~50 µL rabbit anti-Ki67 antikoru ekleyin. 4 °C'de gece boyunca (~16 sa) inkübe edin.
  18. DPBS (%0,1 Tween 20) yıkama (~18–20 dk):
    1. Adım 1.12'dekiyle aynı prosedürü takip edin.
    2. Üçüncü yıkamadan sonra lamları boyama kabından çıkarın ve nemlendirilmiş hazneye düz bir şekilde yerleştirin. Hemen adım 2.19'a geçin.
  19. Sekonder antikor II inkübasyonu (~32–35 dk):
    1. Adım 2.13'teki ile aynı prosedürü takip edin. Kesit başına bir damla AP-konjugeli anti-rabbit IgG ekleyin (bkz. Tablo 2) ve doku kesitlerini nemlendirilmiş hazne kapağı kapalı olarak oda sıcaklığında 30 dk inkübe edin.
  20. DPBS (%0,1 Tween 20) yıkama (~18–20 dk):
    1. Adım 1.14'teki gibi 1× DPBS/%0,1 Tween 20 ile aynı yıkama prosedürünü takip edin.
      NOT: Son yıkama adımı sırasında, üretici talimatlarına göre (bkz. Ek Dosya 1'deki reaktif hazırlama) substrat çalışma çözeltisini (önerilen 5 mL; bkz. Tablo 3) taze olarak hazırlayın.
  21. Mavi renk gelişimi (10–12 dk):
    1. Adım 2.20'yi tamamladıktan sonra, lamları beyaz arka planlı bir çalışma tezgahına düz bir şekilde yerleştirin.
    2. Taze hazırlanan mavi substrat çalışma çözeltisini iyice karıştırın, ardından her bir doku kesitine 50 µL ekleyin (artan çözeltiyi atın).
    3. Doku kesitlerini, beyaz bir arka planda veya ışık mikroskobu altında her 2–3 dakikada bir periyodik olarak kontrol ederek mavi renk görünene kadar oda sıcaklığında inkübe edin.
      NOT: Adım 2.15'teki kırmızı renk gelişimi gibi, mavi renk gelişimi için gereken süre 20–30 dk sürebilir. Ancak, AP-deteksiyon sistemi ile 005 beyin tümörü kesitlerindeki Ki67+ hücrelerin boyanması için mavi renk 10–12 dk içinde gelişir.
  22. Tampon yıkama (5 dk):
    1. Adım 2.21'de istenen mavi renk sinyali görünür görünmez, kesitleri bir boyama kabı içinde 1× DPBS/%0,1 Tween 20'ye 5 dk boyunca daldırın. Yıkama çözeltisini atın.
  23. Su ile durulama (1 dk): Kesitleri 1 dk boyunca distile suda durulayın. Durulamadan sonra distile suyu atın.
  24. Kademeli dehidrasyon (15–17 dk):
    1. Lamları boyama kabındaki %70 etanolde 5 dk boyunca (ardından %70 etanolü yeniden kullanım için cam şişeye geri koyun), ardından %90 etanolde 5 dk boyunca (ardından şişeye geri koyun) ve son olarak %100 etanolde 5 dk boyunca (ardından şişeye geri koyun) bekletin.
    2. Her bir adımı çeker ocak altında tekrarlayın. Adım 2.25'e geçin.
      NOT: Bu dehidrasyon adımında adım 2.2'deki aynı (ksilen içermeyen) etanol çözeltileri kullanılır ve temiz göründükleri sürece birçok kez yeniden kullanılabilirler.
  25. Ksilen bazlı olmayan berraklaştırma:
    1. Doku kesitlerini/lamları temizlemek için adım 2.1'de kullanılan aynı ksilen içermeyen çözeltileri (yani Histo-Clear) kullanın.
      1. Öncelikle, lamları boyama kabındaki ksilen içermeyen çözelti I'e 10 dk boyunca daldırın (ardından ksilen içermeyen çözelti I'i yeniden kullanım için cam şişeye geri koyun) ve ardından ek olarak 10 dk boyunca ksilen içermeyen çözelti II'ye daldırın.
      2. Lamları, kapatma (yani adım 2.26) tamamlanana kadar ksilen içermeyen çözelti II'de tutun.
        NOT: Kesitler, kapatma işlemi için gerekirse ksilen içermeyen çözelti II'de daha uzun süre kalabilir.
        DİKKAT: Adım 1.1'de olduğu gibi KKD kullanın ve bu adımı kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirin.
  26. Ksilen bazlı olmayan kapatma:
    1. Lamları ksilen içermeyen çözelti II'den tek tek çıkarın ve bir çeker ocak içinde düz bir şekilde yerleştirin. Uygun boyutlu bir lamelle bir damla ksilen bazlı olmayan kapatma medyumu yerleştirin, ardından lamelin kapatma medyumunun olduğu yüzü doku kesitlerine bakacak şekilde lamın üzerine koyun.
    2. Kapatma medyumunu tüm üç kesite eşit şekilde yaymak ve hava kabarcıklarını gidermek için lamelin üzerine başparmağınızla hafifçe bastırın.
      NOT: Kapatma medyumu hızla kuruyabileceği için kapatma işlemini lam başına 30 saniye içinde tamamlayın. Adım 1.1'de olduğu gibi KKD kullanın ve bu adımı kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirin.
  27. Hava ile kurutma ve ışık mikroskobu: Lamları, ışık mikroskobu kullanılarak yapılacak değerlendirme ve görüntülemeden önce en az 2 saat boyunca çeker ocak içinde hava ile kurutun. Kuruduktan sonra, kapatılmış lamlar oda sıcaklığında lam kutularında yıllarca saklanabilir.

Sonuçlar

HRP tabanlı kromojenik saptama sistemi kullanılarak gerçekleştirilen tek renkli IHC, FFPE 005 beyin tümörü kesitlerinde net ve tekrarlanabilir boyama sağlamıştır. Yüzey antijeni boyamasının temsilci görüntüleri Şekil 1'de gösterilmektedir; bu görüntüler T hücresi belirteçlerinin (CD3, CD4, CD8), tümörle ilişkili makrofaj (TAM) belirteçlerinin (CD68, F4/80) ve immün kontrol noktası molekülü programlı ölüm ligandı 1'in (PD-L1) başarıyla saptandığını kanıtlamaktadır. Tüm vakalarda, kromojen olarak DAB kullanılarak pozitif boyama, korunmuş doku morfolojisi ve minimum arka plan boyaması ile belirgin kahverengi bir kromojenik sinyal olarak görselleştirilmiştir; bu durum, tek renkli IHC protokolünün çeşitli membran ilişkili antijenlerle uyumlu olduğunu göstermektedir.

Hücre içi antijen tespiti için tek renkli IHC protokolünün uygulanabilirliği Şekil 2'de gösterilmiştir. Temsili boyama görüntüleri; T-bet, FoxP3, fosforile STAT1 (pSTAT1), Ki67, granzim B ve cleaved caspase-3 dahil olmak üzere transkripsiyonel, sinyalizasyon, proliferatif, sitotoksik ve apoptotik hücre içi markerların başarılı bir şekilde tespit edildiğini göstermektedir. Yüzey antijeni boyamasına benzer şekilde, hücre içi marker tespiti, doku mimarisini korurken minimal spesifik olmayan arka plan boyaması ile net kahverengi kromojenik sinyaller üretmiş (Şekil 2) ve böylece protokolün hem yüzey hem de hücre içi antijenlerin tespiti için uygun olduğunu kanıtlamıştır.

Ardışık bir alkalin fosfataz (AP) tabanlı kromojenik tespit stratejisi kullanılarak, aynı doku kesiti içindeki iki antijeni eş zamanlı olarak saptamak için çift renkli IHC protokolü başarıyla uygulanmıştır. Şekil 3'te gösterildiği gibi, sırasıyla proliferatif T hücrelerini ve M1 benzeri makrofajları belirten19 CD3(kırmızı)/Ki67(mavi) ve pSTAT1(kırmızı)/CD68(mavi) eş boyaması, ışık mikroskobu altında net bir şekilde ayırt edilebilen kromojenik sinyaller üretmiş ve ardışık boyama iş akışı kullanılarak net renk ayrımıyla etkili eş zamanlı çift antijen tespitini kanıtlamıştır. Bu çift renkli boyama yaklaşımının çok yönlülüğünü daha fazla göstermek için, aynı protokol GFP eksprese eden 005 GSC tümörlerinden türetilen beyin tümörü kesitlerinde bir nöronal belirteç (kırmızıda NeuN) ve yeşil floresan proteini (mavide GFP) eş zamanlı olarak saptamak amacıyla başarıyla uygulanmıştır (Şekil 4). GFP ve NeuN'nin kolokalizasyonu, muhtemelen 005 GSC'lerin nöronal belirteç NeuN'yi eksprese eden olgun fenotiplere farklılaştığını göstermektedir21.

Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3'teki görüntüler dört bağımsız tümörü temsil etmektedir; iki bağımsız tümörü temsil eden F4/80 görüntüsü ve üç bağımsız tümörü temsil eden PD-L1 görüntüsü hariç, tüm boyanmış immün hücre antijenleri için tümör başına bir kesit kullanılmıştır; F4/80 ve PD-L1 için ise ikişer kesit kullanılmıştır. Şekil 4'teki görüntü tek bir tümör kesitini temsil etmektedir. Çift-IHC protokolü, iki ila dört bağımsız tümördeki aynı doku kesitinde iki antijeni (örneğin, CD3+ ve Ki67+, veya CD68+ ve pSTAT1+) ardışık olarak boyamak için kullanıldığından ve ayrıca GFP+ ve NeuN+ hücrelerinin birlikte boyanmasıyla doğrulandığından, bu sonuçlar çift-IHC protokolünün tekrarlanabilir uygulamasını desteklemektedir. Benzer şekilde, tekli-IHC protokolü 12 bağımsız immün hücre antijenine başarıyla uygulanmış ve burada açıklanan boyama koşulları altında geniş uygulanabilirliği kanıtlanmıştır.

Birlikte, bu temsili sonuçlar, açıklanan substrat tabanlı tek ve çift renkli IHC protokollerinin, FFPE GBM dokularında geniş bir yelpazedeki yüzey ve hücre içi antijenlerin saptanması için pratik ve tekrarlanabilir yöntemler sağladığını kanıtlamaktadır.

CD3, CD4, CD8, CD68, F4/80, PD-L1 bağışıklık belirteçlerinin immünohistokimyası, mikroskop görüntüleri.
Şekil 1: Yüzey antijenleri için tek renkli immünohistokimya (IHC). Glioblastoma (GBM) kök hücre benzeri hücre (GSC) kaynaklı fare GBM kesitlerinde, horseradish peroxidase (HRP) tabanlı tespit sistemi kullanılarak tümör infiltrasyonlu T hücreleri (CD3+, CD4+ ve CD8+), tümörle ilişkili makrofajlar (CD68+ ve F4/80+) ve bağışıklık kontrol noktası molekülü programlanmış ölüm ligandı 1 (PD-L1+) için substrat tabanlı tek renkli (kahverengi) IHC boyaması (ayrıntılar için protokolün 1. Bölümüne bakınız). Temsili IHC görüntüleri sunulmuştur (CD3, CD4 ve CD8 için 10× büyütme; CD68, F4/80 ve PD-L1 için 20× büyütme). Pozitif hücreler kahverengiye boyanmıştır. Ölçek çubukları = 100 μμm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Doku kesitlerinde T-bet, FoxP3, p-STAT1, Ki67, GranB, CC3 immünohistokimya belirteçleri.
Şekil 2: Hücre içi antijenler için tek renkli immünohistokimya (IHC). Glioblastoma (GBM) kök benzeri hücre (GSC) kaynaklı fare GBM kesitlerinde, horseradish peroxidase (HRP) tabanlı tespit sistemi kullanılarak hücre içi transkripsiyonel (T-bet+ ve FoxP3+), sinyal iletim (pSTAT1+), proliferatif (Ki67+), sitotoksik (granzyme B+, GranB) ve apoptotik (cleaved caspase-3+, CC3) belirteçlerin substrat tabanlı tek renkli (kahverengi) IHC boyaması (ayrıntılar için protokolün Bölüm 1'ine bakınız). Temsili IHC görüntüleri sunulmuştur (FoxP3, GranB ve CC3 için 10× büyütme; T-bet, pSTAT1 ve Ki67 için 20× büyütme). Pozitif hücreler kahverengiye boyanmıştır. Ölçek çubukları = 100 μμm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Histolojik analiz, CD3/Ki67 ve pSTAT1/CD68 belirteçleri, mikroskopi görüntüsü, hücre proliferasyonu çalışması.
Şekil 3: Proliferatif tümörle ilişkili lenfositler (TILs) ve M1 benzeri tümörle ilişkili makrofajlar (TAMs) için çift renkli immünohistokimya (IHC). Glioblastoma (GBM) kök hücre benzeri hücre (GSC) kaynaklı fare GBM kesitlerinde, alkali fosfataz (AP) bazlı deteksiyon sistemi kullanılarak CD3+(kırmızı)/Ki67+(mavi) tümörle ilişkili proliferatif T hücreleri ve pSTAT1+(kırmızı)/CD68+(mavi) M1 benzeri makrofajların substrat bazlı çift renkli (kırmızı/mavi) IHC boyaması (ayrıntılar için protokolün 2. Bölümüne bakınız). Temsili IHC görüntüleri sunulmuştur (20× büyütme). Üstteki görüntüde, CD3+ hücreleri kırmızıya boyanmış, Ki67+ hücreleri maviye boyanmış ve kolokalize olan birkaç hücre siyah oklarla belirtilmiştir. Benzer şekilde, alttaki görüntüde pSTAT1+ hücreleri kırmızıya, CD68+ hücreleri maviye boyanmış ve kolokalize olan birkaç hücre siyah oklarla gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 100 μμm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NeuN/GFP boyalı doku, tümör ve tümör dışı, mikroskopi görüntüsü, hücresel farklılaşma analizi.
Şekil 4: Nöronal hücreler ve yeşil floresan protein pozitif (GFP+) glioblastoma kök hücre benzeri hücreler (GSC'ler) için çift renkli immünohistokimya (IHC). Glioblastoma (GBM) kök hücre benzeri hücre (GSC) kaynaklı fare GBM kesitlerinde, alkali fosfataz (AP) tabanlı tespit sistemi kullanılarak gerçekleştirilen NeuN+(kırmızı)/GFP+(mavi) substrat tabanlı çift renkli (kırmızı/mavi) IHC boyaması (ayrıntılar için protokolün 2. Bölümüne bakınız). Temsili IHC görüntüsü gösterilmiştir (20× büyütme). NeuN+ (bir nöronal belirteç) hücreler kırmızıya, GFP+ (005 GSC'ler tarafından eksprese edilen) hücreler maviye boyanmıştır ve kolokalize olan birkaç hücre siyah oklarla belirtilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 μμm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şuna Karşı Primer AntikorKatalog NumarasıTedarikçiÇalışma DilüsyonuSeyreltme TamponuKonak TürUygun İkincil 
CD3eab5690Abcam1:100At serumuTavşanTavşan anti-IgG
CD4 14-9766-80eBioscience1:200Keçi serumuSıçanAnti-sıçan IgG
CD68ab125212Abcam1:100At serumuTavşanAnti-tavşan IgG
CD8a 14-0808-80eBioscience1:100Keçi serumuSıçanAnti-sıçan IgG
Kivrilmiş (kesilmiş) kaspaz-39661CST1:100At serumuTavşanAnti-tavşan IgG
F4/80ab111101Abcam1:100At serumuTavşanAnti-tavşan IgG
FoxP3ab54501* Abcam1:450At serumuTavşanAnti-tavşan IgG
GFPab183734Abcam1:200At serumuTavşanAnti-tavşan IgG
Granzim Bab4059Abcam1:150At serumuTavşanAnti-tavşan IgG
Ki67ab16667Abcam1:100At serumuTavşanAnti-tavşan IgG
NeuN24307CST1:400At serumuTavşanAnti-tavşan IgG
PD-L1ab205921Abcam1:400At serumuTavşanAnti-tavşan IgG
pSTAT19167CST1:100At serumuTavşanAnti-tavşan IgG
T-betab91109Abcam1:100At serumuFareAnti-fare IgG

Tablo 1: Birincil antikorların listesi. Bu çalışmada kullanılan birincil antikorlar; kaynakları, optimize edilmiş çalışma dilüsyonları, önerilen dilüsyon tamponları, konak türleri ve tekli veya çift renkli immünohistokimyasal boyama için uygun ikincil antikorlar ile birlikte sunulmuştur.

Konjuge İkincil Antikor Katalog NumarasıKonakçı TürlerDamla/kesitTedarikçi
HRP anti-sıçan IgGMP-7444-15KeçiBir damla (seyreltilmemiş)Vector Laboratories
HRP anti-tavşan IgGMP-7401At
HRP anti-fare IgGMP-7402-15At
AP anti-sıçan IgGMP-5404-15Keçi
AP anti-tavşan IgGMP-5401At

Tablo 2: Sekonder antikorların listesi. Enzim konjugatları (HRP veya AP), konak türler, önerilen uygulama hacmi ve tedarikçi bilgileri dahil olmak üzere, tek ve çift renkli IHC protokolleri için optimize edilmiş sekonder tespit reaktifleri.

SubstratSaptama EnzimiTampon BileşimiReaktif Formülasyonuİnkübasyon SüresiNotlar
Vector BlueAlkalen fosfataz100 mM Tris-HCl, pH 8.2–8.5, %0,1 Tween 202 damla (80 µL) Reaktif 1 + 2 damla (80 µL) Reaktif 2 + 2 damla (45 µL) Reaktif 320–30 dkÇift IHC mavi boyama için; ksilende kısmen çözünür; ksilen içermeyen reaktifler ve montaj ortamları önerilir
Vektör KırmızısıAlkalen fosfataz 100 mM Tris-HCl, pH 8,2–8,5, %0,1 Tween 202 damla (80 µL) Reaktif 1 + 2 damla (80 µL) Reaktif 2 + 2 damla (80 µL) Reaktif 320–30 dkÇift IHC kırmızı boyama için
DAB Yaban turbu peroksidazı Üretici tarafından sağlanan substrat tamponu1 mL DAB substratına 1 damla kromojen eklenirDeğişken (bkz. adım 2.16)Kahverengi boyama sağlar; karsinojeniktir, güvenlik kılavuzlarına uygun şekilde kullanın

Tablo 3: Kromojenik substratların listesi. Bu tablo; uyumlu saptama enzimleri, hazırlama ve formülasyon, inkübasyon süreleri ve optimal kromojenik sinyal gelişimi için kritik uygulama önerileri dahil olmak üzere, tek ve çift renkli IHC için kullanılan kromojenik substratları özetlemektedir.

Ek Dosya 1: Reaktiflerin, tamponların ve substratların hazırlanması. Bu dosya, tek ve çift renkli immünohistokimya protokollerinde kullanılan tüm reaktiflerin, tamponların, bloklama solüsyonlarının ve kromojenik substratların hazırlanması, saklanması ve kritik uygulama hususlarını özetlemektedir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışma, ortotopik bir GSC modelinden türetilen FFPE beyin tümörü dokularında, yüzey ve hücre içi antijenlerin tek ve çift renkli tespiti için ayrıntılı ve tekrarlanabilir, substrat tabanlı kromojenik bir IHC iş akışını tanımlamaktadır. Bu çalışmanın temel amacı, immünokompetan GBM dokularında güvenilir kromojenik antijen tespiti için pratik ve adım adım bir protokol oluşturmak olan metodolojik bir yaklaşımdır.

Kromojenik IHC, TME içindeki antijenlerin uzamsal lokalizasyonuna izin verirken doku mimarisini koruduğu için FFPE dokularda hücresel belirteçlerin değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılan bir yöntem olmaya devam etmektedir15,16. Tekrarlanabilir bir kromojenik boyama; antijen geri kazanımı, bloklama koşulları, antikor konsantrasyonu, kromojen geliştirme süresi ve boyama ile montaj sırasındaki doku işleme dahil olmak üzere birden fazla teknik parametrenin dikkatli optimizasyonunu gerektirir. Bu adımlardaki küçük sapmalar doku kaybına, zayıf sinyal yoğunluğuna, aşırı arka plan boyanmasına veya zayıf morfolojik korumaya neden olabilir. Bu protokol, boyama tutarlılığını ve tekrarlanabilirliğini artırmak için ayrıntılı prosedür rehberliği sağlayarak yaygın teknik zorlukları ele almaktadır.

Tek renkli IHC iş akışı kullanılarak yapılan temsili boyamalar; T hücresi belirteçleri, makrofajla ilişkili belirteçler, immün kontrol noktası molekülleri, sinyal proteinleri, proliferasyon belirteçleri ve apoptozla ilişkili antijenler dahil olmak üzere, geniş bir yelpazedeki membranla ilişkili ve hücre içi antijenlerin başarıyla tespit edildiğini göstermiştir. Bu temsili sonuçlar, standart bir HRP tabanlı kromojenik tespit sistemi kullanılarak FFPE GBM dokularındaki çeşitli antijen sınıflarının saptanmasında protokolün uygulanabilirliğini kanıtlamaktadır.

Çift kromojenik IHC'deki yaygın bir teknik zorluk, her iki birincil antikorun aynı konak türde üretildiği durumlarda iki antijenin eş zamanlı tespitidir; bu durum antikor uyumluluğunu ve sinyal ayrımını zorlaştırabilir. Bunu gidermek için, ışık mikroskobu altında antijen sinyallerinin net bir şekilde görsel olarak ayrılmasına olanak tanıyan farklı kromojenik substratlar kullanarak ardışık AP tabanlı bir çift renkli boyama iş akışı oluşturduk.

CD3/Ki67 ve pSTAT1/CD68'in temsili ko-boyaması, aynı doku kesiti içinde eş zamanlı antijen tespitinin başarıyla gerçekleştirildiğini göstermiştir. Bu iş akışının NeuN/GFP ko-boyaması için ek uygulaması, ardışık çift renkli protokolün bağışıklık belirteç analizinin ötesindeki çok yönlülüğünü daha da desteklemektedir. Çift renkli IHC boyaması, manuel skorlama veya dijital görüntü analizi ile nicelleştirilebilir. Yaygın metrikler arasında tekli ve çift pozitif hücrelerin sayısı veya yüzdesi ile bunların tümör içindeki dağılımı yer alır. Dijital analiz kullanılırken, tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için tutarlı eşik değerleme ve bölge seçimi önerilir.

Tek renkli IHC protokolü ile güvenilir boyama sonuçları elde etmek için, primer antikoru içermeyen bir negatif kontrol eklenmelidir. Bu kontrol, substrat geliştirme (adım 1.15) sırasında herhangi bir kromojenik sinyal üretmemeli ve böylece boyama prosedürünün özgünlüğünü doğrulamalıdır. Çift renkli IHC protokolü için, primer antikor I (adım 2.11), primer antikor II (adım 2.17) veya her iki primer antikorun çıkarıldığı ek negatif kontroller önerilir. Her iki primer antikor da aynı konak türden kaynaklandığı için, bu kontroller ikinci anti-tavşan sekonder antikorun (adım 2.19) ilk boyama döngüsünden kalan primer antikoru tespit etmediğini doğrular ve taşınma kaynaklı veya spesifik olmayan kromojenik sinyallerin dışlanmasına yardımcı olur.

Bu protokolde gösterilen temsilci görüntüler optimal boyama sonuçlarını örneklendirse de, kullanıcılar zaman zaman zayıf veya eksik kromojenik sinyal, aşırı arka plan boyaması, doku kesiti boyunca düzensiz boyama veya düşük sinyal-gürültü oranı dahil olmak üzere suboptimal sonuçlarla karşılaşabilirler. Bu tür sonuçlar genellikle yetersiz antijen geri kazanımı, suboptimal antikor konsantrasyonu, yetersiz bloklama, kromojenik substratın aşırı geliştirilmesi veya boyama prosedürü sırasında dokunun kuruması ile ilişkilidir. Bu sorunlar genellikle uygun pozitif ve negatif kontrollerle karşılaştırılarak tespit edilebilir ve protokol boyunca belirtilen antijen geri kazanım koşulları, antikor dilüsyonu, bloklama basamakları, yıkama prosedürleri ve kromojen inkübasyon süreleri optimize edilerek düzeltilebilir.

Bu çalışmanın bir kısıtlılığı, tek veya çift renkli IHC uygulanabilirliğinin, birden fazla tümör modeli veya tümör progresyon aşaması boyunca sistematik olarak uygulanmak yerine, aynı tümör modelinden alınan temsili doku kesitleri kullanılarak gösterilmiş olmasıdır. Ancak bu kısıtlılık, çalışmanın temel amacı olan substrat tabanlı tek ve çift renkli kromojenik IHC için tekrarlanabilir bir metodolojik iş akışı oluşturma ve belgeleme hedefini etkilememektedir. İmmünofloresan ile karşılaştırıldığında, kromojenik IHC rutin parlak alan mikroskopisi ile uyumludur, doku morfolojisini daha iyi korur ve doku otofloresansından daha az etkilenir. Burada ortotopik immünokompetan GSC kaynaklı GBM modeli için optimize edilmiş olsa da, bu protokol diğer preklinik tümör modellerine ve marköre özgü optimizasyonla insan FFPE tümör örneklerine uyarlanabilir. Dijital patoloji ve görüntü analiz platformlarıyla entegrasyon, yarı nicel doku tabanlı analizler için kullanım alanını daha da genişletebilir.

Açıklamalar

S.D.R., Georgetown Üniversitesi ve Massachusetts General Hospital tarafından sahip olunan ve yönetilen, Amgen ve Acti\Vec Inc.'den telif ücretleri alan onkolitik herpes simpleks virüsleri ile ilgili patentlerin ortak mucididir; ayrıca Replimune, Cellinta ve Greenfire Bio'ya danışmanlık yapmış ve bunlardan onurlandırma ücretleri, EG 427'den ise onurlandırma ücretleri ve özkaynak elde etmiştir. Diğer yazarlar, bu taslağın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmaksızın hazırlandığını beyan ederler.

Teşekkürler

D.S. kısmen North Carolina Agricultural and Technical State University (NCA&T) Fen ve Teknoloji Fakültesi'nden sağlanan bir fondan, NCA&T Fakülte Bursu Hibesi'nden (GRADS-4C) ve NIH'den alınan bir hibeden (1R16NS147983-01) desteklenmiştir. Benzer şekilde, S.D.R. kısmen Thomas A. Pappas Nörobilim Kürsüsü tarafından, R.H.N. ise kısmen bir NIH hibesi (1R35GM153737) ile desteklenmiştir. 005 GSC'ler için Dr. Inder Verma ve Dr. Yasushi Soda'ya teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2 L cam şişeler CorningCORN1395-2L10'luk hazırlama ve saklama için kullanılır× DPBS, 1× DPBS, distile su ve sodyum sitrat tamponu
2 L Pyrex cam beher Corning1000-2LSodyum sitrat tamponunda (600 mM) mikrodalga destekli antijen geri kazanımı için kullanılır–800 mL çalışma hacmi)
%2,5 normal at serumu veya normal keçi serumuBunlar, Vector Laboratories'in sekonder antikorlarıyla birlikte hazırlanmış olarak sunulur. Spesifik olmayan bağlanmayı ve arka plan boyanmasını en aza indirmek için sekonder antikorun konakçı türüne (anti-tavşan veya anti-sıçan IgG) bağlı olarak türe özgü bloklama ve antikor seyreltme amacıyla kullanılır.
%30 hidrojen peroksit (H2O2)Fisher ScientificBP2633500
500 mL'lik cam şişelerVWR InternationalVWRU10754-818Tek renkli İHK için yanıcı reaktiflerin ve çift renkli İHK için ksilen içermeyen reaktiflerin hazırlanmasında ve saklanmasında kullanılır
Kimwipes ile emici tezgah kağıdıArdışık inkübasyonlar öncesinde doku kesitlerinden fazla antikoru veya yıkama solüsyonunu uzaklaştırmak için boyama prosedürleri sırasında kullanılır; böylece reaktif taşınması ve çapraz kontaminasyon minimize edilir
Anti-CD3eAbcamab5690
Anti-CD4 eBioscience14-9766-80
Anti-CD68Abcamab125212
Anti-CD8a eBioscience14-0808-80
Anti-Kevrilmiş kaspaz-3CST9661
Anti-F4/80Abcamab111101
Anti-FoxP3Abcamab54501
Anti-GFPAbcamab183734
Anti-Granzim BAbcamab4059
Anti-Ki67Abcamab16667
Anti-NeuNCST24307
Anti-PD-L1Abcamab205921
Anti-pSTAT1CST9167
Anti-T-betAbcamab91109
AP anti-tavşan IgGVector LaboratoriesMP-5401
AP anti-sıçan IgGVector LaboratoriesMP-5404-15
BLOXALL bloklama solüsyonuVector LaboratoriesSP-6000-100Öncelikle, endojen peroksidaz ve alkali fosfataz aktivitesini inhibe etmek amacıyla çift renkli İHK'da kullanılır
Sığır serum albümini (BSA)Bioworld22070007-2Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için %5'lik evrensel bloklama tamponu hazırlamakta kullanılır
Cytoseal 60 kalıcı kapatma medyumu Elektron Mikroskobu Bilimleri18006Tek renkli IHC için kullanılan ksilen uyumlu kapama medyumu
DAB substratı ve kromojeniDAKOK346811-2HRP tabanlı tek renkli kromojenik tespit için kullanılır. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, 1 mL DAB substratına 1 damla kromojen ekleyerek kullanımdan hemen önce hazırlayın.’talimatlara göre. Hazırlama sonrası kullanılmayan çalışma çözeltisi atılmalıdır. DAB potansiyel bir karsinojendir ve kurumsal biyogüvenlik ile kimyasal güvenlik kılavuzlarına uygun şekilde kullanılmalıdır.
Distile suReaktif hazırlama, yıkama ve tampon hazırlama işlemleri için kullanılır. Ultrapure veya Milli-Q su da kullanılabilir.
DPBS (Dulbecco’fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) Corning55-031-PC
Etanol, %100'lük Decon Labs2701
Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop LamlarıFisher Scientific12-550-15Doku kesitleri için pozitif yüklü mikroskobik cam lamlar
Cam lamellerCorning veya Millipore SigmaLam başına düşen doku kesiti sayısına göre uygun boyutlar seçilmelidir. Yaygın boyutlar şunlardır: 24 mm × 24 mm (tek doku kesiti), 24 mm × 40 mm (iki doku kesiti), 24 mm × 50 mm (üç doku kesiti)
HematoksilinFisher Scientific220-102
Histo-Clear (1 L)Elektron Mikroskopisi Bilimleri64111-01Çift renkli IHC için kullanılan ksilen içermeyen şeffaflaştırma ajanı. Histo-Clear I ve Histo-Clear II olarak etiketlenmiş iki adet 500 mL'lik şişe hazırlayın
HRP anti-fare IgGVector LaboratoriesMP-7402-15
HRP anti-tavşan IgGVector LaboratoriesMP-7401
HRP anti-sıçan IgGVector LaboratoriesMP-7444-15
Nemlendirilmiş odacıklar Stellar ScientificHS-120879Doku kesitlerinin primer ve sekonder antikorlarla inkübasyonu için
Hidrofobik bariyer kalemi (PAP kalemi)Vector LaboratoriesH-4000İnkübasyon sırasında antikorların ve reaktiflerin tutulmasını sağlamak ve aynı lam üzerindeki birden fazla doku kesiti arasında çapraz kontaminasyonu önlemek amacıyla, doku kesitlerinin etrafında su itici bir bariyer oluşturmak için kullanılır
KimwipesKimtech Science34155Doku kesitlerinden kalıntı reaktiflerin ve yıkama tamponunun nazikçe uzaklaştırılması için kullanılır
Manyetik karıştırıcı IKAI-10001529Sodyum sitrat ve DPBS stok çözeltilerinin hazırlanması için
Mikrodalga fırınPanasonic (Model: NN-L931BF)SN: 6H610500362,2 kübik foot kapasite. 2 L'lik cam beher kullanılarak yapılan ısı aracılı antijen geri kazanımı için gereklidir
Nikon Işık Mikroskobu NikonSN: 707798Nikon Eclipse Ci-L sn: 707798, Sola ışık motoru 5M5-LCR-VA sn: 11787, Yazılım: NIS Elements BR 4.60.00 & NIS Elements BR Analysis 4.60.00, Kameralar: Nikon DS-Fi3 sn: 110865 (renkli) & Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (S/B)
pH metre VWR International77619-152Antijen geri kazanım tamponu pH'ının ayarlanması için
Streç filmFisher Scientific01810Mikrodalga ısıtma sırasında buharlaşmayı en aza indirmek ve dokunun kurumasını önlemek amacıyla, antijen geri kazanım tamponunu gevşekçe örtmek için kullanılır
Polioksimetilen (POM) lam rafları MopecSP234Yukarıdaki boyama kaplarıyla uyumludur; her bir raf 24 adede kadar mikroskop lamı alır
Hassas terazi Mettler Toledo30697420Sodyum sitrat ve DPBS tozlarının tartılması için
BuzdolabıThermo ScientificTSG3005CASıcaklığa duyarlı reaktiflerin ve antikorların saklanması için
Lam saklama kutularıFisher Scientific22-267294
Boyama kapları/kapları MopecSP233Her bir kap, 24 lamlı bir boyama rafı alır.
Manyetik karıştırıcılar Fisher Scientific14-512-128Sodyum sitrat ve DPBS stok çözeltilerinin hazırlanması için
Trisodyum sitrat dihidrat Thermo Scientific KimyasallarAA3643936
Tween 20 Thermo ScientificAAJ20605AP
VectaMount PT kalıcı montaj medyumu Vector LaboratoriesH-5600-60Çift renkli İHK için kullanılan ksilen içermeyen kalıcı montaj medyumu
Vector Blue alkalen fosfataz substrat kiti Vector LaboratoriesSK-5300Çift renkli AP tabanlı İHK sırasında mavi kromojenik sinyal geliştirme için kullanılır. Vector Blue ksilende kısmen çözündüğü için, çift renkli boyama iş akışlarında ksilen içermeyen şeffaflaştırma ajanları ve kapatma ortamları kullanılmalıdır.
Vector Red alkali fosfataz substrat kitiVector LaboratoriesSK-5100Çift renkli AP tabanlı İHK sırasında kırmızı kromojenik sinyal geliştirme için kullanılır
Ksilen (1 L) StatLab8400-1Tek renkli İHK için deparafinizasyon ve saydamlaştırma ajanı olarak kullanılır. Xylene I ve Xylene II olarak etiketlenmiş iki adet 500 mL'lik şişe hazırlayın

Kaynaklar

  1. Sipos D, et al. Glioblastoma: Clinical presentation, multidisciplinary management, and long-term outcomes. Cancers (Basel). 2025;17(1):146.
  2. Himes BT, et al. Immunosuppression in glioblastoma: Current understanding and therapeutic implications. Front Oncol. 2021;11:770561.
  3. Lin H, et al. Understanding the immunosuppressive microenvironment of glioma: mechanistic insights and clinical perspectives. J Hematol Oncol. 2024;17(1):31.
  4. Puviindran BJ, et al. Within and beyond the tumor: Mechanisms of glioblastoma-induced immunosuppression. Neurooncol Adv. 2025;7(Suppl 4):iv4-iv18.
  5. He J, Yan X, Hu S. Glioma stem cells: drivers of tumor progression and recurrence. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):293.
  6. Dharmapuri S, et al. Multiplexed immunohistochemical analysis of the immune microenvironment of biliary tract cancers pre- & post-neoadjuvant chemotherapy: case series. Ann Transl Med. 2024;12(4):78.
  7. Hatogai K, et al. Comprehensive immunohistochemical analysis of tumor microenvironment immune status in esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(30):47252-64.
  8. Liu X, et al. Spatial heterogeneity of infiltrating immune cells in the tumor microenvironment of non-small cell lung cancer. Transl Oncol. 2024;50:102143.
  9. Kazama A, et al. Tumor-infiltrating immune cell status predicts successful response to immune checkpoint inhibitors in renal cell carcinoma. Sci Rep. 2022;12(1):20386.
  10. Park DH, Kim YZ. Simple analysis using immunohistochemical staining for tumor-infiltrating lymphocytes in brain metastasis of small cell lung cancer. J Neurointensive Care. 2024;7(2):49-55.
  11. Bogajewska-Rylko E, et al. When is immunohistochemistry useful in assessing tumor necrotic tissue? Anticancer Res. 2021;41(1):197-201.
  12. Saha D, Rabkin SD. Immunohistochemistry for tumor-infiltrating immune cells after oncolytic virotherapy. Methods Mol Biol. 2020;2058:179-90.
  13. Saha D, et al. combinatorial effects of VEGFR kinase inhibitor Axitinib and oncolytic virotherapy in mouse and human glioblastoma stem-like cell models. Clin Cancer Res. 2018;24(14):3409-22.
  14. Li M, et al. Characterization and oncolytic virus targeting of FAP-expressing tumor-associated pericytes in glioblastoma. Acta Neuropathol Commun. 2020;8(1):221.
  15. Bommareddy PK, et al. Oncolytic herpes simplex virus expressing IL-2 controls glioblastoma growth and improves survival. J Immunother Cancer. 2024;12(4):e008880.
  16. Chernov A, Chutko A, Alaverdian D, Kashuro V, Galimova E. Chemotherapy sensitivity of primary glioblastoma cells and immunohistochemical markers to predict survival of patients with glioblastoma. Clin Transl Oncol. 2026;28(3):974-85.
  17. Saha D, Rabkin SD, Martuza RL. Temozolomide antagonizes oncolytic immunovirotherapy in glioblastoma. J Immunother Cancer. 2020;8(1):e000345.
  18. Jahan N, Talat H, Alonso A, Saha D, Curry WT. Triple combination immunotherapy with GVAX, anti-PD-1 monoclonal antibody, and agonist anti-OX40 monoclonal antibody is highly effective against murine intracranial glioma. Oncoimmunology. 2019;8(5):e1577108.
  19. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Macrophage polarization contributes to glioblastoma eradication by combination immunovirotherapy and immune checkpoint blockade. Cancer Cell. 2017;32(2):253-67.e5.
  20. Lu L, Saha D, Martuza RL, Rabkin SD, Wakimoto H. Single agent efficacy of the VEGFR kinase inhibitor axitinib in preclinical models of glioblastoma. J Neurooncol. 2015;121(1):91-100.
  21. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Oncolytic herpes simplex virus immunovirotherapy in combination with immune checkpoint blockade to treat glioblastoma. Immunotherapy. 2018;10(9):779-86.
  22. Marumoto T, et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 2009;15(1):110-6.
  23. Cheema TA, et al. Multifaceted oncolytic virus therapy for glioblastoma in an immunocompetent cancer stem cell model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(29):12006-11.
  24. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Curing glioblastoma: oncolytic HSV-IL12 and checkpoint blockade. Oncoscience. 2017;4(7-8):67-9.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Glioblastoma Kök HücreleriTümör Mikroçevresiİmmünohistokimya ProtokolüKromojenik SaptamaÇift Renkli İHKFFPE Beyin TümörüTümör İnfiltrasyonlu İmmün HücrelerOrtotopik İmplantasyonAlkalin Fosfataz Boyama

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.