Yöntem makalesi

EDTA Tabanlı Dekalsifikasyon Kullanılarak Uzamsal Transkriptomik İçin Formalinle Sabitlenmiş, Parafinle Gömülmüş Kemik İliği Örneklerinin Hazırlanması

26 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/72474

⸱

28 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Bu makalede

Özet

Formalinle tespit edilmiş, parafinle gömülmüş kemik örneklerinin uzamsal transkriptomik için hazırlanmasına yönelik standardize edilmiş bir iş akışı, RNA bütünlüğünü korumak için 10 günlük bir EDTA dekalsifikasyon adımı içerir. Temel kalite kontrol kontrol noktaları, örneklerin sonraki uzamsal gen ekspresyon analizi gereksinimlerini karşılayıp karşılamadığının belirlenmesine yardımcı olur.

Özet

Kemik iliği (BM), mekansal ilişkilerin hücre davranışını, sinyalleşmeyi ve fonksiyonu etkilediği karmaşık ve dinamik bir yapıdır. Bu nedenle, hücresel etkileşimlerin tüm dinamiklerini anlamak, hücre popülasyonlarının mimarisini in situ koruyan ve haritalandıran tamamlayıcı mekansal teknikler gerektirir. Sağlıklı ve hastalıklı BM dokusunun transkripsiyonel heterojenliğinin anlaşılmasına katkıda bulunan tek hücre teknolojilerindeki önemli ilerlemelere rağmen, farklı hücre tiplerinin mekansal organizasyonu, niş-spesifik düzenleyici programlar ve bunların etkileşimleri hala daha fazla çalışma gerektirmektedir. Mekansal transkriptomikteki son gelişmeler, farklı dokular boyunca mekansal bağlamla birlikte tarafsız gen ekspresyon analizine olanak sağlamış ve bu teknolojileri, mekansal çözünürlüğü olmayan tek hücre yöntemlerini tamamlayıcı hale getirmiştir. Mekansal transkriptomik yumuşak dokularda yaygın olarak kullanılmış olsa da, kemik dokusunun işlenmesiyle ilgili zorluklar nedeniyle BM gibi mineralize dokulardaki kullanımı sınırlı kalmıştır. Burada sunulan protokol; sağlıklı ve hastalıklı fare ve insan dokularından formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) örnekler hazırlamak için kullanılmıştır. RNA bütünlüğünü korumak ve uzun kemik örneklerinde mekansal transkriptomik kullanımını desteklemek için 10 günlük etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tabanlı bir dekalsifikasyon adımı eklenmiştir. Bu protokol; doku işleme, koruma ve kesit alma ile birlikte kesit bütünlüğü, doku morfolojisi ve RNA kalitesinin değerlendirilmesi gibi temel kalite değerlendirme adımlarını içeren, mekansal transkriptomik analiz için BM örneklerinin hazırlanmasını açıklamaktadır. İş akışı ayrıca; hücresel kompozisyonu karakterize etmek, hücre-hücre etkileşimlerini tanımlamak ve sağlıklı ve hastalıklı durumlarda transkripsiyonel olarak heterojen hücrelerin mekansal dağılımını görselleştirmek için hücre tipi tanımlamasını ve tek hücre transkriptomik verileriyle entegrasyonu desteklemektedir. Genel olarak bu iş akışı, BM mimarisini korurken, tamamen mineralize sağlıklı ve malign dokuları mekansal transkriptomik analiz için hazırlar.

Giriş

Kemik iliği (BM), hematopoiez ve bağışıklık hücresi olgunlaşması için birincil bölge olarak hizmet eden, oldukça karmaşık ve bölmelere ayrılmış bir organdır1,2. Bu heterojen doku; oldukça özelleşmiş ve organize bir üç boyutlu niş içinde birlikte var olan hematopoetik, mezenkimal, endotelyal ve immün hücre soy hatlarından oluşan çeşitli bir diziyi kapsar3,4. Bu niş içerisinde her bir hücre popülasyonu farklı anatomik bölgeleri işgal eder ve mekansal bağlam; hücresel davranışın, sinyalleşmenin ve fonksiyonun düzenlenmesinde temel bir rol oynar4,5. Trabeküler kemik veya vasküler ağlar gibi belirli yapılara olan fiziksel yakınlık; hematopoetik kök hücre (HSC) durgunluğunun sürdürülmesi ve kemik yeniden şekillenmesi dahil olmak üzere temel fizyolojik süreçleri yönetir6,7. Sonuç olarak, bu dinamik mikroçevre ve hücresel ile stromal bileşenleri arasındaki sıkı şekilde düzenlenen etkileşimler, homeostazı koruyan düzenleyici ağları şekillendirir ve hematolojik malignitelerin ilerlemesini etkiler8,9,10,11,12,13.

Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) alanındaki ilerlemeler, daha önce tanınmayan hücre alt tiplerinin ve bunların niş içindeki öngörülen etkileşimlerinin keşfedilmesine olanak sağlayarak kemik iliği (BM) hücresel çeşitliliğine dair anlayışımızda devrim yaratmıştır3,10,11,12,14,15,16. Ancak tek hücreli transkriptomik, hematopoetik nişin bireysel bileşenleri hakkında yüksek çözünürlüklü bilgiler sunsa da, doğası gereği hücreleri yerli ortamlarından ayıran ve potansiyel olarak doğal durumlarını değiştiren doku sindirim süreciyle17 ve kemik dokusu organizasyonunu tanımlayan mekansal bağlamın eksikliğiyle sınırlıdır4,18. Pozisyonel bağlamın bu kaybı, transkripsiyonel olarak belirgin spesifik popülasyonların nerede yerleştiğinin veya komşu hücrelerle nasıl etkileşime girdiğinin kesin olarak haritalandırılmasını imkansız kılmaktadır19. Ayrıca, yoğun kemik dokusu genellikle sadece kısmen ayrıştırılır; bu durum, scRNA-seq veri setlerinde osteositler ve adipositler gibi temel hücre popülasyonlarının yetersiz temsil edilmesine ve doku heterojenliğinin yanlı bir şekilde temsil edilmesine yol açar20,21. Mekansal transkriptomik, gen ekspresyonunun mekansal olarak korunmuş doku kesitleri içinde, in situ olarak çalışılmasına izin vererek bağlamsal bilgileri geri kazanır ve tek hücreli teknolojilerin sınırlamalarını giderir8,19,22,23,24,25,26. Bu teknoloji, BM'yi oluşturan farklı hücre popülasyonlarının hassas mekansal konumlandırılmasını ve yapısal organizasyonunu mümkün kıldığı için alanda temel bir ilerlemeyi temsil etmektedir; bu durum, hücrelerin doğal mikroortamlarındaki etkileşimlerini ve fonksiyonel rollerini anlamak için vazgeçilmezdir8,26. Dahası, hastalık bağlamında mekansal transkriptomik, araştırmacıların ve klinisyenlerin geleneksel patoloji ile yüksek kapasiteli genomik arasındaki boşluğu doldurmalarına, moleküler verileri morfolojik görüntüler üzerine bindirmelerine olanak tanır1,8. Mekansal transkriptomik teknolojileri iki ana gruba ayrılabilir: dizileme tabanlı yöntemler ve görüntüleme tabanlı yöntemler17,24. Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) ve açık kaynaklı Open-ST gibi dizileme tabanlı platformlar, yeni nesil dizileme öncesinde mRNA'yı mekansal olarak kodlanmış diziler veya boncuklar üzerinde yakalar. Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX ve Xenium dahil olmak üzere görüntüleme tabanlı yöntemler, transkriptleri çoklu hibridizasyon veya padlock prob kimyası aracılığıyla doğrudan in situ olarak görselleştirir27,28. Alternatif olarak, platformlar, prob tabanlı tespit gerektirip gerektirmediklerine bağlı olarak hedefli veya hedefsiz olarak kategorize edilebilir17,24.

Uzamsal transkriptomik yöntemleri; beyin, kalp ve karaciğer gibi bozulmamış histolojik kesitlerin oluşturulmasının kolay olduğu yumuşak dokulara yaygın olarak uygulanmıştır.29,30,31Buna karşılık, kemiğin mineralize yapısı nedeniyle kemikte uzamsal transkriptomiğin uygulanması, bir dekalsifikasyon işlemi gerektirdiğinden oldukça daha zordur.32,33kalsiyum fosfatın kontrollü bir şekilde uzaklaştırılmasıyla dokunun, kesit alma ve sonraki histolojik veya moleküler analizler için yeterince yumuşak hale getirilmesi8,20,23,34Klinik uygulamalarda rutin olarak kullanılan geleneksel dekalsifikasyon yöntemleri tipik olarak hidroklorik, nitrik, formik veya fosforik asit gibi ağır asidik çözeltilere dayanır; bu çözeltiler RNA bütünlüğünü ciddi şekilde bozar ve hücresel morfolojiyi tahrip eder.35,36Bu tür moleküler degradasyon, mekansal analizlerde sinyal-gürültü oranını düşürerek genellikle yumuşak dokulara kıyasla kabul edilemeyecek kadar düşük gen saptama oranlarına yol açar.8,10Bu sınırlama, sekanslama tabanlı mekansal analizler için mineralize örneklerde mRNA bütünlüğünü güvenilir bir şekilde koruyan standartlaştırılmış dekalsifikasyon iş akışlarına duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.8,20.

Bu protokol, daha önce Muiños-Lopez ve ark. tarafından uygulanan8, uzamsal transkriptomik için formalinle fikse edilmiş, parafinle gömülmüş (FFPE) BM örneklerinin hazırlanmasına yönelik standartlaştırılmış bir iş akışı sunmaktadır. İş akışı, kontrollü pH'da etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kullanılarak gerçekleştirilen 10 günlük bir dekalsifikasyon aşamasını içermektedir. Agresif asitlerin aksine EDTA, mikroskobik yapıyı koruyan ve nükleik asit kalitesini sürdüren nazik bir şelatör olarak işlev görerek moleküler uygulamalarda kullanımını destekler8,20,33,36,37. Kavram kanıtı olarak protokol; sağlıklı ve multipl miyelom (MM) fare modellerinden alınan kemik doku örnekleri ile sağlıklı ve hastalıklı bireylerden alınan insan BM örnekleri üzerinde uygulanmış ve örnekler daha sonra Visium Spatial Gene Expression platformunda sekanslanmıştır38. İş akışı; hem insan hem de fare kemik örneklerinden doku temini, fiksasyon, dekalsifikasyon, dehydrasyon, parafin gömme ve kesit alma için standartlaştırılmış prosedürleri; ardından kesit bütünlüğü değerlendirmesi, hematoksilin ve eozin (H&E) boyama, RNA kalite değerlendirmesi (DV200) ve hücre tipi doğrulaması için isteğe bağlı immünofloresan (IF) analizini kapsayan kapsamlı bir kalite kontrol hattını içermektedir. Bu hazırlık adımları, yalnızca yüksek kaliteli kesitlerin; doku kesitlerinin ön işlemi, kütüphane oluşturma, sekanslama ve ardından gelen veri kalite kontrolü ve analizi dahil olmak üzere alt uzamsal transkriptomik iş akışlarına geçmesini sağlar.

Bu standartlaştırılmış prosedür, mekansal transkriptomik analizler için insan ve fare BM örneklerinin hazırlanmasını ve kalite değerlendirmesini desteklemektedir. Hematolojik ve iskeletsel bozukluklardaki nişe özgü düzenleyici programların araştırılmasını kolaylaştırmak amacıyla tasarlanmıştır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına yönelik 2010/63/EU sayılı Avrupa Direktifi'ne uygun olarak yürütülmüş ve Navarra Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi (Comité de Ética para la Experimentación Animal; protokoller CEEA082-20 ve CEEA039-20) tarafından onaylanmıştır. Hayvan bakımı, idaresi ve ötanazisi, ağrı ve acıyı en aza indirmek amacıyla İspanyol mevzuatına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

İnsan çalışması, Navarra Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Komitesi (Comisión de Ética de Investigación, CEI; 2022.100mod1 ve 2023.172 numaralı projeler) ve Navarra Sağlık Servisi Araştırma Etik Komitesi (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1) tarafından onaylanmıştır. İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, Helsinki Deklarasyonu'nun etik ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür. Kişisel veriler, Kişisel Verilerin Korunması ve Dijital Hakların Garantisi hakkındaki 3/2018 sayılı İspanyol Organik Kanunu ve Biyomedikal Araştırmalar hakkındaki 14/2007 sayılı İspanyol Kanunu uyarınca gizli tutulmuştur.

NOT: Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntılı bir listesi şurada sunulmuştur: Materyaller TablosuKemik dokularında uzamsal transkriptomiğin uygulanmasına yönelik kapsamlı deneysel iş akışı şematik olarak şu şekilde gösterilmiştir: Şekil 1 ve üç operasyonel aşamaya ayrılmıştır: örnek temini, kalite kontrol (QC) ve mekansal transkriptomik profilleme. Örnek temini; insan veya fare kemik fragmanlarının toplanmasını, ardından fiksasyon, EDTA ile dekalsifikasyon, dehidrasyon, parafin gömme, kesit alma ve lam hazırlama işlemlerini kapsar. QC aşaması, histolojik bütünlüğü ve RNA korunmasını değerlendirir. Doğrulanmış kemik kesitleri daha sonra lam üzerinde doku permeabilizasyonuna, kütüphane hazırlığına, sekanslamaya ve veri analizine tabi tutulur.

figure-protocol-1
Şekil 1: Murin ve insan kemik dokuları için örnekleme ve EDTA tabanlı hazırlama iş akışı. Fare femurleri ve insan kemik örnekleri toplanır, fikse edilir, EDTA ile dekalsifiye edilir,yeteştirilir, parafine gömülür ve kesitlere ayrılır. Örnek kalitesi, H&E boyama ve RNA bütünlüğü (DV200) değerlendirmesi ile analiz edilir; ardından mekansal transkriptomik doku ön işlemesi, kütüphane hazırlığı, sekanslama ve veri kalite kontrolü gerçekleştirilir. Kısaltmalar: BM = kemik iliği; DV200 = 200 nükleotidden daha uzun olan RNA fragmanlarının yüzdesi; EDTA = etilendiamintetraasetik asit; H&E = hematoksilin ve eozin; QC = kalite kontrolü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Kemik doku örneklerinin elde edilmesi ve işlenmesi

  1. Fare kemiklerinin toplanması
    1. Hayvanları %5 isofluran ile anestezi edin ve refleks kaybını teyit edin.
    2. Tam anestezi sağlandıktan sonra, kurumsal ve düzenleyici kılavuzları takip ederek servikal dislokasyon yoluyla ötanazi gerçekleştirin.
      ​NOT: Ötanazi eğitimli personel tarafından yapılmalı ve doku toplama işlemine geçilmeden önce ölüm teyit edilmelidir.
    3. Farenin dorsal yüzeyine %70 etanol püskürterek cildi dezenfekte edin ve cerrahi makas kullanarak cildi dikkatlice kaldırmak ve arka ekstremiteleri ortaya çıkarmak için küçük bir insizyon yapın.
    4. Kalça ekleminin üzerinden keserek arka ekstremiteleri disseke edin ve bunları 10 mL soğuk Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpü buz üzerinde tutun.
    5. Steril pens ve bistüri kullanarak yapışık kas ve bağ dokusunu temizleyin.
    6. Kemikleri, temiz ve soğuk DPBS ile önceden doldurulmuş 50 mL'lik steril bir kaba aktarın, ardından kabı buz üzerine yerleştirin.
    7. Doku bütünlüğünü korumak için hemen örnek doku fiksasyonuna geçin.
  2. İnsan kemik örneği işlemleri
    1. Kemik kor biyopsilerini veya cerrahi kemik fragmanlarını 100 mL'lik steril kaplarda teslim alın.
    2. Kemik fragmanlarını, soğuk DPBS ile önceden doldurulmuş temiz, steril bir 100 mL'lik kaba aktarın, ardından buz üzerine yerleştirin.
    3. Doku bütünlüğünü korumak için hemen örnek fiksasyonuna geçin.
      UYARI: İnsan örnekleri BSL 2 koşulları altında işlenmelidir.
  3. Kemik dokusu fiksasyonu
    1. Kemik örneğini içeren 50 mL veya 100 mL'lik kabı alın ve DPBS'yi boşaltın.
    2. Plastik kasetleri etiketleyin ve kemik örneklerini bireysel kasetlere yerleştirin. Sonraki işlemler sırasında doku kaybını önlemek için kapakları sıkıca kapatın.
      ​NOT: Fare örnekleri için kaset başına bir kemik yerleştirin. İnsan kemik örnekleri için gerekirse, dokuyu standart kasetlere sığacak kadar küçük fragmanlara bölmek için steril bir bistüri kullanın ve her kasete bir fragman yerleştirin. Eğer insan kemik örnekleri bu aşamada kesilemeyecek kadar sertse, bütün halde bırakılıp dekalsifikasyon solüsyonuna aktarılabilirler; dekalsifiye olduktan sonra, yumuşayan doku uygun boyutta fragmanlara bölünebilir ve etiketli kasetlere yerleştirilebilir.
    3. 1:20 örnek-fiksatif oranında %4 tamponlu formaldehit solüsyonu ekleyin ve örneği 4 °C'de 24 sa boyunca inkübe edin.
      UYARI: Toksisitesi ve uçucu buharları nedeniyle fiksatifi bir kimyasal çeker ocak içinde kullanın.
      NOT: FFPE iş akışlarında RNA bütünlüğünü azaltan aşırı fiksasyondan (>48 sa) kaçının39.
  4. Mineralize kemik dokusunun dekalsifikasyonu
    1. Formalini boşaltın ve kemik örneğini ultrapüre su ile yıkayın. Kalan herhangi bir formalin kalıntısını gidermek için suyla durulayın, kısa süre ajite edin ve boşaltın.
    2. Ultrapüre su içinde 0.25 M EDTA solüsyonu hazırlayın ve pH'ı 6.95'e ayarlayın.
      NOT: Geleneksel dekalsifikasyon protokollerinde EDTA genellikle pH 8.0'e ayarlansa da, bu iş akışı doku morfolojisini ve RNA kalitesini korurken etkili şelasyon sağlamak için EDTA'yı yaklaşık pH 6.95'te kullanır8.
    3. EDTA solüsyonunu kemik örneğinin bulunduğu kaba ekleyin ve hafif ajitasyonla 4 °C'de 10 gün boyunca inkübe edin.
      ​NOT: Fare örnekleri için genellikle yaklaşık 50 mL EDTA solüsyonu yeterlidir. İnsan kemik örnekleri için genellikle yaklaşık 100 mL kullanılır. Ancak bu hacim, tam daldırmayı ve etkili dekalsifikasyonu sağlamak için kemik boyutuna göre ayarlanabilir.
    4. 5 günlük dekalsifikasyondan sonra, şelasyon kapasitesi zamanla doyuma ulaştığı için EDTA solüsyonunu boşaltın ve aynı hacimde taze EDTA ile değiştirin. İnkübasyona aynı koşullar altında devam edin.
    5. 10 günlük inkübasyondan sonra EDTA solüsyonunu boşaltın ve dekalsifikasyonun tamamlanıp tamamlanmadığını değerlendirin.
      1. Steril bir bistüri ile küçük bir kesik yapın veya dokunun bir köşesine veya periferik bölgesine ince steril bir iğne yerleştirin; ilgi bölgelerini bozmamak için daima analitik önemi düşük bir alan seçin. Kesme veya iğne yerleştirme sırasında örneği sabitlemek için kemiği steril bir Petri kabına yerleştirin. Eğer doku kolayca kesilebiliyorsa veya iğne minimum dirençle geçiyorsa, örnek yeterince dekalsifiye olmuştur.
      2. Fare femurları durumunda, mineralin tamamen uzaklaştırıldığının güvenilir bir göstergesi olan esnekliği değerlendirmek için kemiği pensle hafifçe bükün.
        NOT: Dekalsifikasyon adımının süresi, kemik örneğinin boyutuna ve kalınlığına ve kullanılan EDTA hacmine bağlıdır. İlk inkübasyon süresinden sonra kemik hala sertse, doku kolayca kesilecek kadar yumuşayana kadar dekalsifikasyona devam edin. Aşırı uzatma doku kalitesini ve RNA bütünlüğünü bozabilir, bu nedenle uzatma, yeterli yumuşama için gereken minimum süreyle sınırlı olmalıdır20.
  5. Dehidrasyon
    1. Kemik örneğinin bulunduğu kaba ultrapüre su ekleyerek yıkayın, ardından ajitasyonla 4 °C'de 5 dk inkübe edin.
    2. Suyu boşaltın ve %70 etanol solüsyonu ile değiştirin. 4 °C'de 1 sa inkübe edin.
      NOT: Bu adım bir duraklama noktası olarak kullanılabilir. Örnekler, sonraki adımlara geçmeden önce 4 °C'de %70 etanolda saklanabilir. Maksimum saklama süresi bu protokolde deneysel olarak doğrulanmamıştır, bu nedenle kullanıcılar laboratuvarlarının standart uygulamalarına göre hareket etmelidir.
    3. Örneği sırasıyla artan etanol konsantrasyonlarında (%70, %80, %96; her biri 4 °C'de 1 sa) dehidre edin, ardından gece boyunca 4 °C'de %100 etanolde bekletin.
    4. %100 etanolü boşaltın ve ksilen ile değiştirin. Oda sıcaklığında (RT) 4 sa inkübe edin.
    5. Ksileni boşaltın ve örnek kasetini eritilmiş, temiz parafin içeren bir cama yerleştirin. 60 °C'de gece boyunca eritilmiş parafinde inkübe edin.
      NOT: Vakum destekli işlem sistemleri mevcut olduğunda, bu cihazlar daha etkili parafin penetrasyonu sağladığından daha kısa infiltrasyon süreleri kullanılabilir40,41,42.
      UYARI: Ksilen ve dereceli etanol solüsyonlarını içeren tüm adımlar, uygun havalandırmayı sağlamak ve toksik ve yanıcı buharlara maruz kalmayı minimize etmek için bir kimyasal çeker ocak içinde gerçekleştirilmelidir.
  6. Parafin gömme
    ​NOT: RNA degradasyonunu önlemek için gömme istasyonunun yüzeylerini bir RNase dekontaminasyon solüsyonu ile temizleyin.
    1. Gömme istasyonunu açın ve parafin rezervuarını, kaset parafin banyosunu, kalıp parafin banyosunu ve kalıp ısıtma plakasını 60 °C'ye ön ısıtın. Gömme işleminden önce soğumasını sağlamak için soğuk plakayı aktive edin.
    2. Parafinin tamamen erimesini bekleyin ve ardından parafinle infiltre edilmiş örnekleri içeren kasetleri kaset parafin banyosuna yerleştirin. Gömme işleminden önce ksilenin tamamen temizlendiğinden emin olmak için 2 sa inkübe edin.
    3. Gerekli tüm kalıpları kalıp parafin banyosuna yerleştirin.
      NOT: İnsan örnekleri için standart metal gömme kalıpları kullanın. Fare örnekleri için, Visium lamları üzerine uygun kesit yerleşimine uygun boyutlarda kare bir boşluk içeren, Visium platformuyla uyumlu plastik gömme kalıpları kullanın. Tüm fare kemikleri bu kalıpların kare boşluğuna tamamen sığmadığından, uygun boyutta fragmanlar elde etmek için kemikleri gömme işleminden hemen önce steril bir bistüri ile kesin. Boyutlarına bağlı olarak her kalıba bir veya iki kemik fragmanı gömülebilir.
    4. Gömme istasyonunun merkezi çıkışından eritilmiş parafin akıtarak ince bir temel tabaka ekleyin.
    5. Kaseti açın ve dokuyu sıcak bir pens yardımıyla kasetten kalıba nazikçe aktarın.
    6. Parafinle dolu kalıbı kalıp ısıtma plakasına yerleştirin ve parafin sıvı haldeyken, dokuyu sıcak pens ile istenen kesme düzleminde yönlendirin.
    7. Kemik fragmanının pozisyonunu kısa süreliğine sabitlemek için kalıbı gömme istasyonunun soğuk yüzeyine yerleştirin.
    8. Kalıbı, dokunun tamamen kapandığından ve büyük hava kabarcığı kalmadığından emin olarak dağıtıcıdan gelen eritilmiş parafinle tamamen doldurun.
    9. Etiketli kaseti, parafin bloğunun tabanını oluşturacak şekilde kalıbın üzerine yerleştirin.
    10. Kasetle birlikte kalıbı gömme istasyonunun soğuk plakasına aktarın. Blok opak ve sert olana kadar parafinin tamamen katılaşması için 10 dk bekleyin.
    11. Katılaştıktan sonra parafin bloğunu kalıptan çıkarın ve kesim işlemine kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Bu adım bir duraklama noktası olarak kullanılabilir. Parafin bloğu 4 °C'de saklanabilir; ancak, saklama sırasında RNA degradasyonunu minimize etmek için, mümkün olduğunda doku kesimi ve sonraki uzamsal transkriptomik analizler gömme işleminden sonra mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirilmelidir43,44.
  7. Kesim ve lam hazırlama
    NOT: RNA degradasyonunu önlemek için mikrotomu ve su banyosunu bir RNase dekontaminasyon solüsyonu ile temizleyin.
    1. Su banyosunu distile su ile doldurun ve 42 °C'ye ön ısıtın. Mikrotomu açın ve yeni bir bıçak takın. Mikroskop lamlarını kurşun kalemle etiketleyin.
    2. Parafin bloğunu, kasetin istenen boyuna kesme düzlemine göre yönlendirildiğinden emin olarak örnek tutucuya yerleştirin.
      ​NOT: Buzla doldurulmuş plastik bir torba hazırlayın ve parafinin yumuşaması nedeniyle kesim zorlaştığında, parafin sertleşmesi ve kesit kalitesinin artması için buz torbasını mikrotomda takılı olan bloğun üzerine doğrudan yerleştirip bir lastikle birkaç dakika sabitleyin.
    3. Mikrotom kalınlığını 20 µm'ye ayarlayın ve düzeltme kesimlerini yapın.
    4. Mikrotom ayarını 5 µm'ye getirin. Dört adet 5 µm'lik kesiti etiketli, RNase-free 1.5 mL'lik bir mikrosentrifüj tüpüne toplayın. Tüpü kuru buz üzerinde tutun ve -80 °C'de saklayın.
    5. 5 µm kalınlığında kesime devam edin ve kesit şeritlerini su banyosuna bırakın. Kesit tamamen açıldığında ve kırışıklıklar gittiğinde, etiketli lam ile alın.
      1. Belirli sayıda kesitte bir (örneğin, doku boyutuna bağlı olarak her 5-10 şeritte bir), ek olarak 4 adet 5 µm'lik kesiti yeni bir etiketli 1.5 mL'lik tüpe toplayın. Toplam üç adet 5 µm'lik kesit içeren 1.5 mL'lik tüp elde edene kadar bu işlemi tekrarlayın.
        NOT: Eğer doku çatlarsa, kırılırsa veya sürekli bir kesit olarak elde edilemezse, örnek tam olarak dekalsifiye olmamıştır ve ek dekalsifikasyon süresi gerektirir. İş akışı adımlarını dekalsifikasyon aşamasına kadar geri döndürerek örneği kurtarın. Bunun için parafin bloğunu yaklaşık 2 sa boyunca 60 °C'de eritin ve örneği ksilene (2 sa) aktarın. Örneği dereceli etanol solüsyonları (%100, %96, %80, %70) ve ardından distile su ile rehidre edin. Rehidre edilen örneği taze 0.25 M EDTA (pH 6.95) içine geri koyun ve dehidrasyon, yeniden gömme ve kesime geçmeden önce dekalsifikasyon süresini gerektiği kadar uzatın. FFPE işlemini geri döndürmek RNA bütünlüğünü bozabileceğinden, bu kurtarma prosedürü kesinlikle son çare olarak kullanılmalıdır.
    6. Kalan suyun buharlaşması için lamları gece boyunca 37 °C'lik fırında bekletin, ardından 4 °C'de saklayın.
    7. Doku yapışmasını artırmak için, isteğe bağlı olarak lamları 37 °C'de gece boyunca inkübe etmeden önce 42 °C'de 3 sa boyunca pişirin.
      NOT: Malzemeler Tablosu'nda listelenen cam lamlar kullanıldığında bu adım genellikle gerekli değildir, çünkü bu lamlar güçlü yapışma sağlar ve doku genellikle işlem boyunca sıkıca yapışık kalır. Bu adım bir duraklama noktası olarak kullanılabilir. Lamlar 4 °C'de saklanabilir; ancak, mümkün olduğunda, saklama sırasında RNA degradasyonunu minimize etmek için sonraki uzamsal transkriptomik analizler gömme işleminden sonra mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirilmelidir43,44.

2. Numunenin kalite değerlendirmesi

  1. Kesit kalitesinin değerlendirilmesi
    1. Tüm kesitleri standart bir parlak alan ışık mikroskobu altında tek tek inceleyin (4×–10×). Kesi parçalarının fragmante olmadığını doğrulamak için her bir lamı inceleyin ve her bir kesitin kalitesini kaydedin.
      ​NOT: Parafin sertliği, bıçak keskinliği veya eksik dekalsifikasyon sorunlarına işaret edebilecek katlanma, kırışıklık, sıkışma veya titreme izlerini kontrol edin. Kesim sırasında veya su banyosuna aktarım sırasında kopma nedeniyle dokuda herhangi bir alanın eksik olmadığını doğrulayın.
    2. Uzamsal transkriptomik için en iyi korunmuş kesitleri seçin (en tam olanlar, en iyi morfolojiye sahip olanlar).
    3. Seçilen bölümlerin bitişiğindeki ardışık bölümleri belirleyin ve bunları H için ayırın&E boyaması ve IF (immünofloresan), boyanmış görüntünün dizilenecek dokuyla mümkün olduğunca yakın şekilde eşleşmesini sağlayarak.
  2. H& doku bütünlüğü için E boyaması
    1. Lamları cam bir lam boyama rafına yerleştirin ve 15 dakika boyunca şu sıcaklıkta inkübe edin: 60 °C.
    2. Slayt askısını, içinde ksilen bulunan cam boyama kavanozlarına 15 dakika boyunca aktarın. dk.
    3. Kaseti %100, %96, %80 ve %70'lik etanol içeren boyama kavanozlarından geçirerek kesitleri rehidre edin, 5 dakika inkübe edin her bir çözeltide min.
      ​DİKKAT: Ksilen ve dereceli etanol çözeltilerinin kullanıldığı tüm adımlar, uygun havalandırmayı sağlamak ve toksik ve yanıcı buharlara maruz kalmayı en aza indirmek için bir kimyasal çeker ocak içerisinde gerçekleştirilmelidir.
    4. Slaytları 5 dakika boyunca durulayın su ile doldurulmuş bir boyama şişesinde ... dakika.
    5. Slayt kasasını 10 dakika boyunca hematoksiline daldırın, ardından durulama suyu berraklaşana kadar akan musluk suyu altında yıkayın.
    6. Rafı, beş damla konsantre hidroklorik asit içeren suya daldırın ve kırmızımsı bir ton oluşana kadar nazikçe çalkalayın.
    7. Rafı, stabil bir mavi renk oluşana kadar lityum karbonat ile doyurulmuş suya aktarın, ardından kısa bir süre suyla durulayın.
    8. Kesitleri %1 (w/v) eozin ile 5 dakika boyunca boyayın, ardından tekrar su ile durulayın.
    9. Slayt rafını sırasıyla su, %70, %80, %96 ve %100 etanol içeren boyama kavanozlarından geçirerek ve her çözeltide 5 dakika inkübe ederek slaytlarıyedehidre edin.
    10. Lamları 15 dakika boyunca ksilende saydamlaştırın dk.
    11. Her bir lamın arkasını nazikçe kurulayın, bir lamelliye montaj ortamı uygulayın ve kesitleri yerleştirin. Lamların şurada kurumasına izin verin: 24 saat boyunca oda sıcaklığında (RT) bekletin görüntülemeden önce h.
    12. Yüksek çözünürlüklü bir mikroskop kullanarak 20x büyütmede doku görüntülemesi gerçekleştirin.
      NOT: H'yi gerçekleştirin&mekansal transkriptomik için örnek uygunluğunu değerlendirmek amacıyla bir kalite kontrol adımı olarak öncelikle bitişik kesitlerde H&E boyama yapın. Seçimden sonra, ikinci bir H&mekansal transkriptomik için planlanan kesit üzerinde, listedeki mekansal gen ekspresyon platformu için üreticinin doku hazırlama kılavuzunu takip ederek doğrudan H&E boyaması yapın, Materyaller Tablosu.
  3. RNA bütünlük değerlendirmesi (DV200)
    ​NOT: Uzamsal gen ekspresyon protokolü için geleneksel RNA Bütünlük Sayısı (RIN) etkisizdir; çünkü fikse edilmiş dokularda 18S ve 28S ribozomal RNA pikleri genellikle görülmez. Bu nedenle, 200 nükleotitten büyük RNA fragmanlarının yüzdesi olarak tanımlanan DV200 metriği, RIN'den daha bilgilendirici bir kalite parametresi olarak yaygın şekilde kullanılır. bozulmuş klinik örnekler için. Visium v2 için 10x Genomics, verimli prob hibridizasyonu ve optimal analiz performansı sağlamak adına DV200 değeri %30 veya daha yüksek olan FFPE bloklarının kullanılmasını önermektedir. Mevcut en yüksek DV200 değerlerine sahip doku bloklarının seçilmesi, sekanslama kayıplarının önlenmesine yardımcı olur ve spot hassasiyetini maksimize eder.
    1. ... içeren 1,5 mL'lik tüpleri geri alın 5 µm doku kesme aşamasında toplanan kesitleri, RNA ekstraksiyonu yapmak için buz üzerine yerleştirin.
    2. Toplam RNA ekstrakte edin. Bu standartlaştırılmış prosedür; numunenin deparafinizasyonunu, formalalin oluşturduğu çapraz bağları tersine çevirmek için proteinaz K sindirimini, DNaz I uygulamasıyla genomik DNA'nın uzaklaştırılmasını ve saflaştırılmış RNA'nın RNaz içermeyen su ile son elüsyonunu içerir.
    3. Yüksek hassasiyetli bir RNA analizi ile kapiler elektroforez tabanlı bir sistem kullanarak RNA bütünlüğünü değerlendirin. İş akışının özeti şurada verilmiştir: Ek Dosya 142,45,46,47,48.
  4. Hücre tipi doğrulaması için isteğe bağlı IF
    1. FFPE lamını cam bir lam boyama rafına yerleştirin ve 15 dakika boyunca şu sıcaklıkta inkübe edin: 60 °C.
    2. Rafı, ksilen içeren cam boyama kavanozlarına 15 dakika boyunca aktarın dk.
    3. Sırasıyla %100, %96, %80 ve %70'lik etanol çözeltilerinde her birinde 2 dakika bekleterek, ardından 5 dakika su içerisinde ve 5 dakika PBS-Tween (0,1% Tween-20 eklenmiş 1x PBS) içerisinde tutarak kesiti rehidrate edin.
      DİKKAT: Ksilen ve etanol içeren tüm adımlar bir kimyasal çeker ocak içerisinde gerçekleştirilmelidir.
    4. Primer antikor için üretici tavsiyelerine uygun olarak, geri getirme tamponu, pH ve ısıtma koşullarının antikor veri sayfasına uygun olduğundan emin olarak antijen geri getirme işlemini gerçekleştirin. NOT: Bu iş akışında, antijen geri getirme işlemi 10 mM Tris ve 1 mM EDTA, pH 9.0 kullanılarak, bir pişirme tenceresi ısıtma sisteminde 30 dakika boyunca şu sıcaklıkta gerçekleştirilir: 95 °CArdından oda sıcaklığında 20 dakika boyunca soğutuldu.
    5. Lamı, PBS-Tween ile her biri 10 dakika sürecek şekilde iki kez yıkayın.
    6. Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak doku etrafına hidrofobik bir bariyer çizin ve doku kesitlerine en az 40 dakika boyunca 1x DPBS içinde %5 BSA uygulayarak spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin. nemlendirilmiş bir bölmede oda sıcaklığında [X] dk.
      NOT: Nemli oda, antikor inkübasyonu sırasında stabil bir nemli ortam sağlamak amacıyla, plastik bir lam boyama kutusuna bir adet filtre kağıdı yerleştirilip distile su ile iyice nemlendirilerek hazırlanır.
    7. Birincil antikor çözeltisini, her antikor için önerilen dilüsyonda 1x DPBS içerisinde hazırlayın.
      NOT: Bu iş akışında, üretici protokolüne uygun olarak, fare EC ve MSC'lerini tanımlamak için sırasıyla Emcn (V.7C7) ve Cd271 (ME20.4) karşıt birincil antikorlar; bunların insan karşılıklarını tanımlamak için ise CD31 (JC70A) veya PRRX1 (poliklonal) karşıt antikorlar kullanılmıştır.
    8. Kalıntı damlacıkları uzaklaştırmak için lamın kenarını emici kağıda hafifçe vurarak bloklama çözeltisini temizleyin, ardından primer antikor karışımını uygulayın ve lamı gece boyunca şu sıcaklıkta inkübe edin: 4 °C nemlendirilmiş bir bölmede.
    9. Lamı, PBS-Tween içerisinde 5 dakika boyunca iki kez yıkayın ve floroforların spektral olarak uyumlu olduğundan ve örtüşmediğinden emin olarak, ikincil antikor çözeltisini üretici tarafından önerilen dilüsyonda hazırlayın.
      NOT: Bu iş akışında, 1:200 seyreltmede Alexa Fluor konjuge ikincil antikor kullanılmıştır.
    10. Sekonder antikor karışımını uygulayın ve 30 dakika boyunca inkübe edin. nemlendirilmiş bir bölmede, ışıktan korunarak oda sıcaklığında [sayı] dk.
    11. Lamı PBS-Tween içerisinde 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
    12. 1:1 PBS-gliserol çözeltisinde hazırlanan DAPI içeren montaj ortamını (Materyaller Tablosuna bakınız) 1:10 oranında seyrelterek uygulayın ve örneği 5 dakika boyunca inkübe edin.
    13. Kesiti bir lamel ile kapatın ve kurumasını önlemek için kenarlarını oje ile mühürleyin.
    14. Boyanmış dokuyu, multispektral bir görüntüleme platformu kullanarak görselleştirin.

Ek Dosya 1: RNA Bütünlük Değerlendirmesi ve Visium Uzamsal Transkriptomik İş Akışı Protokol Adımları Özeti. Bu ek dosya, üretici talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilen prosedürel adımların ayrıntılı bir özetini sunmaktadır. Şunları içermektedir: (i) ana protokolün 2.3.3 adımında açıklanan, RNA bütünlüğünü (DV200) değerlendirmek için kullanılan High Sensitivity RNA ScreenTape Assay ve (ii) doku ön işleme, kütüphane hazırlama ve dizilemeyi kapsayan Visium CytAssist Uzamsal Gen İfadesi iş akışının genel görünümü (ana protokolün 3.1–3.3 adımları).Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Uzamsal transkriptomik

NOT: Uzamsal transkriptomik iş akışını, ilgili kullanıcı kılavuzlarını42,45,46 takip ederek, Materyaller Tablosunda listelenen platform ve reaktifleri kullanarak gerçekleştirin. Ek Dosya 1, temel doku ön işleme, kütüphane hazırlama ve sekanslama adımlarını özetlemektedir.

  1. Uzamsal transkriptomik veri kalite kontrolü
    1. Visium veri setleri için standart hattı kullanarak uzamsal transkriptomik verileri demultipleksleyin (bkz. Malzemeler Tablosu).
    2. Okumaları uygun Ensembl 105 referans genomuna haritalayın.
      NOT: İnsan örnekleri için GRCh38 ve fare örnekleri için mm10 kullanılmıştır.
    3. Aynı hattı kullanarak filtrelenmiş özellik-barkod matrislerini oluşturun ve bunları alt akış tek hücreli/uzamsal analiz ortamına aktarın (bkz. Malzemeler Tablosu).
    4. Uzamsal transkriptomik hattı tarafından sağlanan görselleştirme arayüzündeki H&E görüntülerini inceleyin (bkz. Malzemeler Tablosu) ve veri setine bağlı olarak kortikal kemik bölgesiyle veya kemik dokusuyla örtüşen noktaları manuel olarak kaldırın.
    5. Veri setlerini, tek hücreli analiz iş akışlarında yaygın olarak uygulanan bir varyans stabilize edici transformasyon yöntemi kullanarak normalize edin (bkz. Malzemeler Tablosu).

Sonuçlar

Bu EDTA tabanlı iş akışının farklı türler ve hastalık bağlamlarındaki uygulanabilirliğini değerlendirmek için protokol, dört KM örneğine uygulanmıştır: iki fare femuru ve sağlıklı ile multipl miyelom (MM) durumlarını temsil eden iki insan kemik örneği (Tablo 1 ve Şekil 1).

Örnek TanımlamaTürCinsiyetYaşHastalık
YFPcγ1FareDişi210 daysSağlıklı
mMMFareErkek314 daysMM
hHBMİnsanErkek76 yearsSağlıklı
hMMİnsanDişi50 yearsMM

Tablo 1: Çalışmaya dahil edilen murin ve insan kemik örnekleri. Her örnek için tür, cinsiyet, yaş ve sağlık durumu belirtilmiştir. Kısaltmalar: hHBM = sağlıklı insan kemik iliği; hMM = insan multipl miyelom; mMM = murin multipl miyelom; MM = multipl miyelom; YFPcγ1 = sağlıklı kontrol faresi.

MM fare örneği hariç, bu çalışmada kullanılan örnekler daha önce araştırma grubunun önceki yayınlarında, özellikle Muiños-Lopez ve ark. ile Cenzano ve ark. çalışmalarında karakterize edilmiş ve rapor edilmiştir. Daha önce rapor edilen örnekler için uzamsal transkriptomik verileri ve sonuçları söz konusu çalışmalarda sunulmuştur8,10. Bu nedenle, burada yer alan materyal, yeni biyolojik bulgular sunmaktan ziyade, protokolün uzamsal transkriptomik için teknik uygunluğunu değerlendirmek amacıyla kullanılmıştır.

Fare femur kemiği örnekleri, MM hastalarının klinik ve immünolojik özelliklerini tekrarlayan BIC (BIcγ1) genetiği değiştirilmiş MM fare modelinden ve bunlara karşılık gelen sağlıklı kontrol farelerinden (YFPcγ1)8,49 elde edilmiştir. Her hayvandan tek bir femur çıkarılmış, temizlenmiş ve standardize edilmiş protokole göre işlenmiştir (Şekil 2A). Femurlar, bol miktarda erişilebilir iliğe, üstün niş kalitesine ve tekrarlanabilir işlem kolaylığına sahip oldukları için bu analizlerde özellikle kullanılmıştır; bu özellikler onları sekanslama tabanlı bir uzamsal transkriptomik platformu için oldukça uygun kılmaktadır8,10. Kontrol faresinin femurunun başarılı bir şekilde dekalsifiye edildiği, forseps ile manuel manipülasyon sırasında doku esnekliğindeki belirgin artışla makroskobik olarak doğrulanmıştır (Şekil 2B). Ardından, sonraki moleküler analizler için RNA bütünlüğünü ve doku mimarisini korumak amacıyla, bu kemik parçası uzamsal transkriptomiğe uyumlu özel bir kalıp kullanılarak parafine gömülmüştür (Şekil 2C).

Zıt işleme geçmişlerine sahip iki insan BM örneği de analiz edilmiştir8,10. Hematolojik olarak sağlıklı taze bir insan BM örneği, Hospital Universitario de Navarra'da gerçekleştirilen bir ortopedik kalça protezi ameliyatı sırasında cerrahi atıklardan elde edilmiştir (Şekil 2D–F). Protokolün translasyonel faydasını göstermek için bu örnek, fare örneklerinde olduğu gibi işlenmiştir. Fare dokularında gözlenen sonuçlarla uyumlu olarak, insan kemiğinin başarılı EDTA dekalsifikasyonu, iğnenin zahmetsizce nüfuz etmesiyle kanıtlandığı üzere, dokunun tamamen yumuşamasıyla makroskobik olarak doğrulanmıştır (Şekil 2E). Dekalsifiye edilmiş insan kemiği fragmanı, sonraki işlemler için standart bir metal kalıp kullanılarak başarıyla parafine gömülmüştür (Şekil 2F). İkinci insan örneği, Clínica Universidad de Navarra (CUN) Patoloji Bölümü'nde bulunan bir MM hastasının iliak kristinden alınan arşivlenmiş FFPE BM biyopsilerinden oluşmaktaydı. Özellikle, bu arşivlenmiş MM örneği daha önce güçlü asitler içeren standart bir klinik protokol kullanılarak dekalsifiye edilmişti36. Bu örnek, EDTA ile işlenen spesimenlerle kalitatif bir karşıtlık sunmaktadır; ancak doku kaynağı, fiksasyon geçmişi, saklama ve dekalsifikasyon farklılıkları, gözlenen farkların yalnızca dekalsifikasyon ajanına bağlanamayacağı anlamına gelmektedir.

figure-results-1
Şekil 2: EDTA tabanlı hazırlık sırasındaki fare ve insan kemik örnekleri. (A) Dekalsifikasyon öncesindeki sağlam kontrol fare femurleri. (B) Artan esnekliği gösteren dekalsifiye kontrol fare femuru. (C) Parafine gömülmüş kontrol fare kemiği fragmanları. (D) Dekalsifikasyon öncesi kalça cerrahisinden alınan sağlıklı insan kemiği fragmanları. (E) İğne penetrasyonunu gösteren, EDTA dekalsifikasyonu sonrası aynı fragman. (F) Parafine gömülmüş EDTA-dekalsifiye sağlıklı insan kemiği. Ölçek çubukları: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. Kısaltma: EDTA = etilendiamintetraasetik asit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Genel doku mimarisini analiz etmek için H&E boyaması yapılmıştır (Şekil 3). Murin kesitlerde gözlemlenen daha iyi morfolojik korunma, türden kaynaklı doğal özelliklerden ziyade numune taşıma ve işleme süreçlerindeki farklılıkları yansıtıyor olabilir. Fare femurları özellikle konumsal transkriptomik için toplanmış ve hemen bütün kemikler olarak işlenmiş, böylece mimarileri korunmuştur (Şekil 3A, B). Buna karşılık, insan örnekleri ya kalça değiştirme ameliyatı sırasında elde edilen artık materyallerden (Şekil 3C) ya da tanısal MM kemik biyopsilerinden (Şekil 3D) elde edilmiştir; her iki durum da değişken preanalitik doku kalitesine sahip olabilir. Sonuç olarak, EDTA ile dekalsifiye edilmiş insan örneği ile asit ile dekalsifiye edilmiş MM biyopsisi arasındaki morfolojik farklar belirgin değildir, çünkü her iki insan örneği de yalnızca dekalsifikasyon nedeniyle değil, aynı zamanda genel doku işlemleri nedeniyle oluşan temel yapısal sınırlamalar sergilemektedir (Şekil 3C, D). Buna bağlı olarak, konumsal transkriptomik için numune kalitesini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek, birden fazla farklı parametrenin incelenmesini gerektirir. İlk olarak, yapısal korunma yalnızca kullanılan dekalsifiye edici asite göre değil, spesifik numune tipine göre de önemli ölçüde farklılık gösterebildiğinden, doku bütünlüğü dikkatle izlenmelidir. İkinci olarak, dekalsifikasyon koşulları RNA kalitesini etkileyebildiği için RNA kalitesi de değerlendirilmelidir20,35,36.

figure-results-2
Şekil 3: Doku kalite değerlendirmesi için kullanılan H&E boyalı kesitler.Ardışık FFPE kesitleri sırasıyla (A) sağlıklı kontrol faresine10, (B) MM olan bir fareye, (C) sağlıklı insan kemiğine8,10 ve (D) bir insan MM biyopsisine8 karşılık gelmektedir. Ölçek çubukları = 500 µm. Kısaltmalar: FFPE = formalinle fikse edilmiş, parafine gömülmüş; H&E = hematoksilin ve eozin; MM = multipl miyelom. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Histolojik analizi tamamlamak için RNA kalitesi değerlendirilmiştir. H&E boyama belirsiz farklar ortaya koyarken, RNA bütünlüğü iki dekalsifikasyon yönteminin etkilerini net bir şekilde ayırt etmiştir (Tablo 2). Hem murin örneklerden hem de sağlıklı insan kemik örneğinden elde edilen DV200 değerleri, Visium FFPE analizleri için önerilen eşiği aşmış olup, prob hibridizasyonu ve kütüphane kurulumu için yeterli RNA fragman uzunluğu dağılımına işaret etmiştir. YFP sağlıklı fare örneği %82,55 DV200 değeri göstermekte ve sağlıklı insan kemiği (hHBM) örneği %58'e ulaşmaktadır; her iki değer de 10x Genomics tarafından tanımlanan %30 kabul eşiğinin oldukça üzerindedir. MM fare (mMM) örneği, kabul edilebilirliğin alt sınırına yakın olan %31,3'lük bir DV200 değeri göstermektedir; bu durum, diğer örneğe özgü faktörlerin yanı sıra parafin bloğunun kesit alınmadan önce 4 °C'de uzun süre saklanmasını yansıtıyor olabilir. Buna karşılık, asit ile dekalsifiye edilmiş insan MM biyopsisi (hMM), morfolojik bozulma daha az belirgin olduğunda bile belirgin şekilde daha düşük RNA bütünlüğü ile ilişkili olan yalnızca %8'lik bir DV200 sergilemektedir. Özetle, hem yapısal hem de moleküler değerlendirmelerin yapılması, örneğin sonraki aşamalardaki uzamsal analizler için uygunluğunun değerlendirilmesi açısından önemlidir.

Numune TanımlamaDV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV200: Toplam RNA fragmanlarının yüzdesi > 200 nükleotit.
2Bu örnek, güçlü asitlerin kullanıldığı standart bir klinik protokol uygulanarak dekalsifiye edilmiştir.

Tablo 2: Çalışma örneklerinin RNA kalitesi. DV200, 200 nükleotitten daha uzun olan RNA fragmanlarının yüzdesidir; en az %30'luk değerler, sonraki spatial transcriptomics aşamaları için uygun kabul edilmiştir. Kısaltmalar: hHBM = sağlıklı insan kemik iliği; hMM = insan multipl miyelom; mMM = fare multipl miyelomu.

Ek kalite değerlendirmeleri de gerçekleştirilebilir. Doku bütünlüğünü daha fazla doğrulamak ve EDTA kalsiyum giderme sonrası belirli hücresel kompartmanların korunduğunu teyit etmek için, fare ve insan dokularından alınan komşu FFPE kesitlerinde isteğe bağlı IF boyaması yapılmıştır. MM fare örneğinde endotel (EC) ve mezenkimal hücreleri (MSC) görselleştirmek için sırasıyla Endomucin (Emcn) ve Cd271 antikorları kullanılmıştır (Şekil 4A). Bu boyama, EDTA ile işlem görmüş dokuların, sürekli Emcn boyaması ile iyi tanımlanmış vasküler yapılar ve korunmuş stromal ağlar sergilediğini göstererek, test edilen belirteçlerin işlem sonrası tespit edilebilir kaldığını kanıtlamıştır. Ayrıca, otomatik bir multispektral görüntüleme sistemi kullanılarak yapılan yüksek çözünürlüklü görüntüleme, test edilen antijenlerin hücre tipi doğrulaması için tespit edilebilir kaldığına dair ek kanıtlar sunarak, uzamsal transkriptomik analiz öncesinde ek bir kalite kontrol katmanı sağlamıştır. Dahası, bu bulgular; EC ekspresyonunun CD31 ve MSC ekspresyonunun PRRX1 (Paired Related Homeobox 1) antikorları ile tespit edildiği sağlıklı yaşlı insan örneklerinde de gözlemlenmiş ve test edilen niş belirteçlerinin EDTA kalsiyum giderme işleminden sonra tanımlanabilir kaldığını göstermiştir (Şekil 4B). Buna karşılık, bu bulgular çeşitli asit bazlı kalsiyum giderme protokollerine tabi tutulan insan MM biyopsilerinde tekrarlanamamıştır. Daha önce belirtildiği üzere, bu örneklerdeki RNA bütünlüğü düşük olduğundan, alt akış transkriptomik analizleri sınırlanmıştır. Bu insan örneklerinin bozunmuş doğası nedeniyle, alt akıştaki kullanımları bazal transkriptomik profilleme8 ve malign plazma hücrelerinin (PC) immünohistokimyasal (IHC) değerlendirmesi ile sınırlı kalmıştır (Şekil 4C).

figure-results-3
Şekil 4: Hücre tipi doğrulaması için isteğe bağlı immünofloresans ve immünohistokimya. (A) DAPI ile işaretlenmiş çekirdekleri (mavi), CD271-pozitif MSC'leri (yeşil) ve EMCN-pozitif EC'leri (kırmızı) gösteren fare MM dokusu. (B) DAPI ile işaretlenmiş çekirdekleri (mavi), PRRX1-pozitif MSC'leri (yeşil) ve CD31-pozitif EC'leri (kırmızı) gösteren sağlıklı insan kemiği10. (C) CD138-pozitif malign PC'leri gösteren insan MM biyopsisi8. Ölçek çubukları: (A) 250 µm (genel görünüm), 20 µm (birleştirilmiş büyütme) ve 50 µm (tek kanallı görüntüler); (B) 500 µm (genel görünüm) ve 20 µm (birleştirilmiş ve tek kanallı büyütmeler); (C) 500 µm. Kısaltmalar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; EC = endotelyal hücre; MM = multipl miyelom; MSC = mezenkimal stromal hücre; PC = plazma hücresi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Doku morfolojisi ve DV200 sonuçları birlikte, EDTA ile işlenmiş örneklerin sonraki basamaklardaki uzamsal transkriptomik analizler için uygunluğunu desteklemektedir. Bu hazırlık iş akışının uzamsal transkriptomik uygulamaları daha önce rapor edilmiştir8,10.

Tartışma

EDTA tabanlı kontrollü dekalsifikasyon, standartlaştırılmış FFPE işlemleri ve sıkı kalite kontrol kontrol noktaları entegre eden bu protokol, özellikle güçlü asit tabanlı dekalsifikasyon yöntemlerinin neden olduğu RNA degradasyonu ve morfolojik hasarla ilgili olan, kemik dokusunun uzamsal transkriptomik için hazırlanmasıyla geleneksel olarak ilişkilendirilen birçok kısıtlamanın üstesinden gelmektedir8,10,20,33,36. Mineralize örneklerin uzamsal transkriptomik için işlenmesindeki en kritik adım dekalsifikasyondur. Yetersiz dekalsifikasyon, kemiğin kesilmeyecek kadar sert kalmasıyla sonuçlanır ve bu durum, uzamsal transkriptomik için yüksek kaliteli kesitler elde edilmesini fiziksel olarak imkansız hale getirir8,20,23,37,50. Kemik dokusu çok sert kaldığında, mikrotom bıçağına karşı parçalanır veya titreşir; bu da parçalanmış kesitlere veya yerli BM mimarisini doğru şekilde temsil etmeyen boşluklara yol açar. Önemli olan, dekalsifikasyonun başarısının mikrotomi aşamasına kadar tam olarak doğrulanamamasıdır: yüzeysel olarak yumuşamış görünen örnekler bile, yalnızca ince FFPE kesitleri alınmaya çalışıldığında belirginleşen kalıntı mineraller içerebilir. Bu nedenle, tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için dekalsifikasyon sürecinin dikkatle izlenmesi esastır.

İş akışında, sürekli ajitasyonla ve beşinci günde solüsyon değişimi ile 10 gün boyunca pH 6.95'te 0.25 M EDTA kullanılmaktadır8,10. Protokol geliştirme aşamasında, farklı dekalsifikasyon süreleri ve solüsyon değişim programlarının yanı sıra tek başına EDTA, polivinilpirolidon ile desteklenmiş EDTA ve %10 formik asit değerlendirilmiş olup karşılaştırmalı veriler burada sunulmamıştır. 10 günden daha kısa süreler, fare örneklerinin kesit alınması sırasında sıklıkla doku kırılmasına yol açarken, insan örnekleri örneğe bağlı davranışlar sergilemiştir. Bu nedenle, fare femurleri için 10 günlük süre kullanılırken, insan örnekleri yoğunluk ve trabeküler içeriğe bağlı olarak daha uzun dekalsifikasyon gerektirebilir. Parafin gömme işleminden önce fiziksel kalite kontrol kontrol noktaları kullanılmalıdır. Mikrotomi sırasında yetersiz dekalsifikasyon olduğu fark edilirse, ek ısı, solvent maruziyeti ve rehidrasyon RNA kalitesini bozabileceği için yeniden işleme prosedürü yalnızca son çare olarak kurtarma adımı şeklinde uygulanmalıdır.

Bu yöntemin temel sınırlaması, klinik patolojide yaygın olarak kullanılan hızlı asit tabanlı protokollerin aksine, işlem süresinin uzun olmasıdır20,36. İşlem sürelerinin uzunluğu araştırma ortamlarında genellikle kabul edilebilir olsa da, 24 saat içinde dekalsifikasyon sağlamak için Morse çözeltisi (%22,5 formik asit ve %10 sodyum sitrat) kullanan Miao ve ark. tarafından açıklanan protokol gibi güncel çalışmalar, mekansal analizler için kemik hazırlığının hızlandırılmasına yönelik artan ilgiyi vurgulamaktadır20. Bununla birlikte, asit tabanlı yöntemler tarihsel olarak RNA degradasyonu riskini çok daha fazla artırarak DV200 değerlerini düşürmekte ve sonuç olarak mekansal transkriptomik ile uyumluluklarını sınırlamaktadır1,8,35,36. Bu EDTA tabanlı yaklaşım, hıza kıyasla RNA korunmasına öncelik vererek Visium gibi sekanslama tabanlı mekansal platformlarla uyumluluğu sağlar.

BM mekansal transkriptomiğin potansiyel bir sınırlaması, PC'den türeyen immünoglobulin transkriptlerinin yüksek bolluğudur ve bu durum, düşük bolluktaki genlerin saptanmasını azaltabilir. Araştırma grubunun önceki bir çalışmasında uygulanan, düşük kaliteli noktaların kaldırılması (<200 UMI ve <150 saptanan gen), dekonvolüsyon analizleri sırasında düşük katkılı hücre tiplerinin filtrelenmesi (nokta başına <%20) ve mekansal transkriptomik veri setlerinde saptanan marker genlerin seçimi gibi kalite kontrol ve filtreleme stratejilerinde olduğu gibi, immünoglobulin transkriptleri de uygun olduğunda etkilerini minimize etmek için analizlerin alt aşamalarında hesaplamalı olarak filtrelenebilir8. Hedefli mekansal transkriptomik yaklaşımları, belirli uygulamalarda düşük bolluktaki transkriptlerin saptanmasını daha da iyileştirebilir.

Bu yöntemin potansiyel uygulama alanları oldukça geniştir. Uzamsal ve tek hücreli verilerin yakın zamanda entegre edilmesi, uzmanlaşmış insan osteojenik nişlerini ve trabeküler kemikten yayılan karmaşık sinyal gradyanlarını ortaya çıkarmıştır3,26. Dahası, uzamsal transkriptomik, yaşlanmanın EC'lerin uzamsal organizasyonunu ve iletişimini değiştirerek BM mikroçevresini yeniden şekillendirdiğini, bunun da osteojenik desteğin bozulmasına ve yaşlanmış niş içerisinde inflamatuar sinyal ağlarının ortaya çıkmasına yol açtığını göstermiştir10. Multiomik profilleme ayrıca, erken miyelopoezi destekleyen arterio-endosteal bölgeler ve hematopoetik kök hücreler ile progenitör hücrelerce zenginleştirilmiş peri-adipositik zonlar gibi belirgin mikroçevresel komşuluklar tanımlamıştır3. MM bağlamında bu protokol, hastalıklı murine BM'nin bileşimini ve hücre-hücre etkileşimlerini karakterize etmek için uzamsal ve tek hücreli transkriptomik çerçevelerin entegrasyonuna olanak tanır. Önceki çalışmalar, malign PC'lerin uzamsal olarak farklı dağılımlarını ortaya çıkarmış ve tümörle zenginleşmiş bölgelerle ters ilişkili olan NETosis ve IL-17 sinyallemesi gibi immün ve inflamatuar programları tanımlamıştır. Ek olarak, malign PC yoğunluğundaki artış, efektör T hücresi durumlarından tükenmiş T hücresi durumlarına doğru bir kayma ile korelasyon göstermiştir. Bu bulgular, farklı hastalık yükleri genelindeki translasyonel ilgilerini kanıtlayacak şekilde, insan FFPE BM örneklerinde de doğrulanmıştır8. Nihayetinde, bu hazırlama iş akışı, BM'nin mineralize mimarisi içindeki karmaşık hücresel etkileşimlerin araştırılması için teknik temel sağlamaktadır.

Yüksek çözünürlüklü mekansal gen ekspresyon platformları, tek hücreye yakın çözünürlükte tüm transkriptom profillemesi sağlayabilir38,51,52. Bu yaklaşımlar, hazırlama iş akışının kullanımını, mekansal olarak organize edilmiş kemik iliği ve hematolojik malignitelerin daha yüksek çözünürlüklü analizlerine genişletebilir. Bu nedenle iş akışı, fizyolojik ve malign hematopoezin gelecekteki çalışmaları için teknik bir temel oluşturmaktadır.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir. MM'nin MIcγ1 fare modellerinin teknik bilgisi (know-how) ve deneysel kullanımı üzerine olan bir patent, MIMO Biosciences'a lisanslanmıştır (başvuru no. PCT/EP2023/071025).

Teşekkürler

Bu çalışma Instituto de Salud Carlos III tarafından desteklenmiş ve ERDF A way of making Europe (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) ve RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011; Departamento de Salud Gobierno de Navarra (GN2024/04); Cancer Research UK [C355/A26819]; Accelerator Ödül Programı kapsamında FC AECC ve AIRC tarafından ortak finanse edilmiştir; FP'ye The International Myeloma Foundation (Brian van Novis) ve The Paula and Rodger Riney Foundation tarafından destek sağlanmıştır. IAC, Avrupa Komisyonu'ndan bir Marie Curie hibe desteği (H2020- MSCA-IF-837491), AECC Talent hibesi (INVES258003CALV) ve Departamento de Salud, Gobierno de Navarra (GN2023/03) tarafından desteklenmiştir. MC, Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades'den bir FPU bursu (FPU22/03283) ile desteklenmiştir. Değerli teknik ve entelektüel yardımları için CIMA Universidad de Navarra bünyesindeki Advanced Genomics Laboratory ve Animal Facility personeline teşekkür ederiz. Ayrıca, BM örneklerini sağladıkları ve üstün iş birlikleri için Clínica Universidad de Navarra (CUN) ve Hospital Universitario de Navarra'nın Patoloji Departmanlarına teşekkür ederiz. MM fare modelleri için José Ángel Martínez-Climent ve Marta Larrayoz'a özel teşekkürlerimizi sunarız. Uzamsal transkriptomik için fare ve insan BM örneklerinin işlenmesinde teknoloji optimizasyonu, protokol geliştirme ve sorun giderme konusundaki mükemmel destekleri için Patxi San Martín-Uriz, Tania López ve Eduardo Larequi'ye teşekkür ederiz. Ayrıca, uzamsal transkriptomik üzerine yaptıkları tüm hesaplamalı çalışmalar için Beñat Ariceta ve Asier Ullate'ye teşekkür ederiz. Son olarak, bu çalışmaya cömertçe katılan hastalara ve sağlıklı donörlere derin şükranlarımızı sunarız.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL tüplerEppendorf15625367
100 mL steril kap deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991ARNA bütünlük değerlendirmesi için kapiler elektroforez– tabanlı sistem
50 mL steril kap IberoMedREOR001
50 mL tüp FALCON352070
Advanced PAP PenTed Pella 22309Z377821-1EAHidrofobik bariyer kalemi 
Tavşanda üretilmiş Anti-PRRX1 antikoruSigma-AldrichHPA051084
BSA (Sığır Serum Albümini)Sigma-AldrichA9418-50G
Kasetler KartellLABWARE2921
CD271 (NGF Reseptörü) Monoklonal Antikor (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, Endotel Hücresi (Konsantre) Klon JC70AAligent DakoM0823
LamellaFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (DAPI içeren VECTASHIELD Antifade Montaj Ortamı)Vector LaboratoriesH-1200-10
Deparafinizasyon SolüsyonuQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals Fosfat tamponlu salin (DPBS, 1×), Dulbecco formülü, kalsiyumsuz, magnezyumsuz
Histoloji için DPX Montaj OrtamıSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Etilendiamintetraasetik asit, (EDTA), 0.5 M Solüsyon, Moleküler Biyoloji Derecesi, Ultrapure
Gömme istasyonu Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Emcn Antikoru (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Ensembl Referans Genomu (GRCh38 / mm10, sürüm 105)EMBL-EBIN/AOkuma hizalaması için kullanılan referans genom.
EozinMillipore SigmaHT110116
EtanolMillipore SigmaE7023-500MLCerrahi makaslar
Falc Instruments B-I Histoloji Su BanyosuFalc610.1030.00
Formalin %4 PanReac AppliChem2524311315Klinik tanı için pH = 7'ye tamponlanmış ve metanol ile stabilize edilmiş Formaldehit %3.7–4.0 w/v (CE-IVD)
Cam lam boyama rafı WHEATONZ710970-3EA
Cam boyama kavanozları BRANDBR472200-10EAMastercycler  X50
GliserolSigma-AldrichC3H803
Keçi anti-Fare IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
Keçi anti-Fare IgG (H+L) Yüksek Derecede Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Derecede Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Hematoksilin Millipore SigmaMHS16
Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTapeAgilent5067-5579RNA bütünlük değerlendirmesi
Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTape MerdiveniAgilent5067-5581RNA bütünlük değerlendirmesi
Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTape Örnek TamponuAgilent5067-5580RNA bütünlük değerlendirmesi
Yüksek çözünürlüklü mikroskop Leica BiosystemsN/AAperio CS2 Tarayıcı
Hidroklorik asit (0.1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
Illumina NextSeq 2000 platformuIllumina20038897
Invitroge Keçi anti-Sıçan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
Iris Makasları - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009İzofluran
Lityum karbonat Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/AHE görüntülerini görselleştirmek ve Visium noktalarını düzenlemek için kullanılan yazılım; analiz hattı tarafından oluşturulan .cloupe dosyalarını açar.
Metal gömme kalıplarıBio-Optica07-BM24256
Mikroskop Lamlarıavantor631-0108Superfrost Plus Mikroskop Lamları
Mikrotom bıçaklarıFEATHERFEAT207500006_U
Mikrotom HM 340EEprediaN/AHM 340E modeli
İğneBD301156BD Microlanc 3 İğne 21 G 1 IN (25 MM)
Nikon Optiphot-2Nikon71052Brightfield ışık mikroskobu
Parafin PanReac AppliChem256993Klinik tanı için plastikleştirilmiş Parafin M.P. 55–58°C + DMSO peletleri (CE-IVD)
Petri kabı CorningCLS430167-100EA
Plastik gömme kalıpları Bio-Optica07-MP7070
Potts-Smith PensleriF.S.T 11012-18Pensler
Qubit 3.0 FlorometreInvotrogen Q33216
Qubit Analiz TüpleriInvotrogen Q32856
Qubit RNA HS Analiz KitiInvotrogen Q32855
RNaz içermeyen 1.5 mL mikro santrifüj tüpüThermo Scientific AM12400
RNaz içermeyen su MerkW4502
RNaseZap RnaseInvotrogen AM9780Dekontaminasyon Solüsyonu
RNeasy FFPE Kiti (50)Qiagen73504Toplam RNA ekstraksiyonu
SCTransform (v0.3.5)Satija LabN/ASeurat'ta uygulanan varyans sabitleyici normalizasyon yöntemi.
Seurat (v4.3.0.1) Satija LabN/ATek hücre ve uzamsal transkriptomik analizi için kullanılan R paketi.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/AVisium veri setleri için demultipleksleme, hizalama ve özellik-barkod matrislerinin oluşturulmasında kullanılan yazılım.
Stlime Neşter Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Bergen LabN/AUzamsal transkriptomik görselleştirme ve entegrasyonu için kullanılan R paketi.
Cerrahi Neşter Bıçağı No.23Swann-Morton210Cerrahi neşter bıçakları
Termal döngüleyici Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455IF görselleştirme için multispektral görüntüleme platformu
Visium Aksesuar Kiti 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Visium İnsan Transkriptom Prob Kiti Küçük 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Visium Fare Transkriptom Prob Kiti Küçük 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Visium Uzamsal Gen Ekspresyon Lam Kiti 4 rxn 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
KsilenPanreac214736Ksilen, analiz için izomer karışımı, ACS, ISO

Kaynaklar

  1. Cooper RA, et al. Spatial transcriptomic approaches for characterising the bone marrow landscape: pitfalls and potential. Leukemia. 2025;39(2):291-295.
  2. Mercier FE, Ragu C, Scadden DT. The bone marrow at the crossroads of blood and immunity. Nat Rev Immunol. 2012;12(1):49-60.
  3. Bandyopadhyay S, et al. Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging. Cell. 2024;187(12):3120-3140.e29.
  4. Tikhonova AN, et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 2019;569(7755):222-228.
  5. Baccin C, et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 2020;22(1):38-48.
  6. Kunisaki Y, et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 2013;502(7473):637-643.
  7. Kusumbe AP, Ramasamy SK, Adams RH. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 2014;507(7492):323-328.
  8. Muiños-Lopez E, et al. Characterization of the bone marrow architecture of multiple myeloma using spatial transcriptomics. Commun Biol. 2025;8(1):1620.
  9. Gui G, et al. Single-cell spatial transcriptomics reveals immunotherapy-driven bone marrow niche remodeling in AML. Sci Adv. 2025;11(28):eadw4871.
  10. Cenzano I, et al. Single-cell profiling reveals RAB13+ endothelial cells and profibrotic mesenchymal cells in aged human bone marrow. Aging Cell. 2026;25(4):e70475.
  11. de Jong MME, et al. The multiple myeloma microenvironment is defined by an inflammatory stromal cell landscape. Nat Immunol. 2021;22(6):769-780.
  12. de Jong MME, et al. An IL-1β-driven neutrophil–stromal cell axis fosters a BAFF-rich protumor microenvironment in individuals with multiple myeloma. Nat Immunol. 2024;25(5):820-833.
  13. Cenzano I, et al. Stromal and endothelial transcriptional changes during progression from MGUS to myeloma and after treatment response. Nat Commun. 2026;17:74389.
  14. Ye J, et al. Deconvolution of the hematopoietic stem cell microenvironment reveals a high degree of specialization and conservation. iScience. 2022;25(5):104225.
  15. Chen L, et al. An inflammatory T-cell-stromal axis contributes to hematopoietic stem/progenitor cell failure and clonal evolution in human myelodysplastic syndrome. Nat Commun. 2025;16(1):10041.
  16. Prummel KD, et al. Inflammatory stromal and T cells mediate human bone marrow niche remodeling in clonal hematopoiesis and myelodysplasia. Nat Commun. 2025;16(1):10042.
  17. De Jonghe J, et al. scTrends: A living review of commercial single-cell and spatial 'omic technologies. Cell Genom. 2024;4(12):100723.
  18. van den Brink SC, et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017;14(10):935-936.
  19. Asp M, Bergenstråhle J, Lundeberg J. Spatially resolved transcriptomes—next generation tools for tissue exploration. Bioessays. 2020;42(10):1900221.
  20. Miao J, et al. A practical protocol of processing mineralized tissue for Visium spatial transcriptomics. Mechanobiol Med. 2025;3(4):100163.
  21. Baldwin M, et al. A roadmap for delivering a human musculoskeletal cell atlas. Nat Rev Rheumatol. 2023;19(11):738-752.
  22. Duan H, Cheng T, Cheng H. Spatially resolved transcriptomics: advances and applications. Blood Sci. 2023;5(1):1-12.
  23. Xiao X, et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 2023;11(1):59.
  24. Jain S, Eadon MT. Spatial transcriptomics in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2024;20(10):659-671.
  25. Tilburg J, et al. Spatial transcriptomics of murine bone marrow megakaryocytes at single-cell resolution. Res Pract Thromb Haemost. 2023;7(4):100158.
  26. Lin W, et al. Mapping the spatial atlas of the human bone tissue integrating spatial and single-cell transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2025;53(2):gkae1298.
  27. Marx V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 2021;18(1):9-14.
  28. Yue L, et al. A guidebook of spatial transcriptomic technologies, data resources and analysis approaches. Comput Struct Biotechnol J. 2023;21:940-955.
  29. Joglekar A, et al. A spatially resolved brain region- and cell type-specific isoform atlas of the postnatal mouse brain. Nat Commun. 2021;12(1):463.
  30. Madissoon E, et al. A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche. Nat Genet. 2023;55(1):66-77.
  31. Wang F, et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023;9(24):eadf5464.
  32. Robinson MH, et al. Regulation of antigen-specific T cell infiltration and spatial architecture in multiple myeloma and premalignancy. J Clin Invest. 2023;133(15):e167303.
  33. Wehrle E, et al. Protocol for preparing formalin-fixed paraffin-embedded musculoskeletal tissue samples from mice for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 2024;5(2):103089.
  34. Sangeetha R, Uma K, Chandavarkar V. Comparison of routine decalcification methods with microwave decalcification of bone and teeth. J Oral Maxillofac Pathol. 2013;17(3):386-391.
  35. Yip RKH, et al. Profiling the spatial architecture of multiple myeloma in human bone marrow trephine biopsy specimens with spatial transcriptomics. Blood. 2025;146(15):1837-1849.
  36. Miquelestorena-Standley E, et al. Effect of decalcification protocols on immunohistochemistry and molecular analyses of bone samples. Mod Pathol. 2020;33(8):1505-1517.
  37. Ambrosi TH, et al. Human skeletal development and regeneration are shaped by functional diversity of stem cells across skeletal sites. Cell Stem Cell. 2025;32(5):811-823.e11.
  38. 10x Genomics. Visium Spatial Platform. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/platforms/visium#assays
  39. Amemiya K, et al. Influence of formalin fixation duration on RNA quality and quantity from formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissues. Pathol Int. 2023;73(12):593-600.
  40. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002;161(6):1961-1971.
  41. Nam SK, et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 2014;48(1):36-42.
  42. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000407, Revision E. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-ffpe/documentation/steps/library-construction/visium-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe-user-guide
  43. Eccher A, et al. Pathology laboratory archives: conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 2024;14(4):333.
  44. Bai Z, et al. Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Cell. 2024;187(23):6760-6779.e24.
  45. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression for FFPE—Tissue Preparation Guide. Document CG000518, Revision D. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/tissue-prep/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-for-ffpe-tissue-preparation-guide
  46. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000495, Revision G. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026. Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/library-construction/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe
  47. Agilent Technologies. High Sensitivity RNA ScreenTape assay for TapeStation systems quick guide. Version A.01.05. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/HS-RNA_QuickGuide.pdf
  48. Agilent Technologies. Agilent 4200 TapeStation system—System manual. Publication G2991-90000, Version A.02.02. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://download.chem.agilent.com/software/4200_tapestation_user_info_package_v2/tapestation%20user%20information/tapestation%20manuals/agilent%204200%20tapestation%20system%20manual_g2991-90000.pdf
  49. Larrayoz M, et al. Preclinical models for prediction of immunotherapy outcomes and immune evasion mechanisms in genetically heterogeneous multiple myeloma. Nat Med. 2023;29(3):632-645.
  50. Wang S. Resolving the bone – optimizing decalcification in spatial transcriptomics and molecular pathology. J Histotechnol. 2025;48(1):68-77.
  51. Oliveira MF, et al. High-definition spatial transcriptomic profiling of immune cell populations in colorectal cancer. Nat Genet. 2025;57(6):1512-1523.
  52. Bourgain-Chang E, Kuang X, Cang Z, Nie Q. Reconstructing single-cell resolution from spatial transcriptomics with CellRefiner. Nat Commun. 2026;17(1):3304.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

FFPE rneklerEDTA DekalsifikasyonuDoku Kesit almaRNA B t nlH cre Tipi Tan mlamaDoku MorfolojisiGen Ekspresyon AnaliziTek H cre Entegrasyonu
Video yakında

İlgili makaleler