Yöntem makalesi

EDTA Tabanlı Dekalsifikasyon Kullanılarak Uzamsal Transkriptomik İçin Formalinle Sabitlenmiş, Parafinle Gömülmüş Kemik İliği Örneklerinin Hazırlanması

162 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72474

⸱

28 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Bu makalede

Özet

Formalinle tespit edilmiş, parafinle gömülmüş kemik örneklerinin uzamsal transkriptomik için hazırlanmasına yönelik standardize edilmiş bir iş akışı, RNA bütünlüğünü korumak için 10 günlük bir EDTA dekalsifikasyon adımı içerir. Temel kalite kontrol kontrol noktaları, örneklerin sonraki uzamsal gen ekspresyon analizi gereksinimlerini karşılayıp karşılamadığının belirlenmesine yardımcı olur.

Özet

Kemik iliği (BM), mekansal ilişkilerin hücre davranışını, sinyalleşmeyi ve fonksiyonu etkilediği karmaşık ve dinamik bir yapıdır. Bu nedenle, hücresel etkileşimlerin tüm dinamiklerini anlamak, hücre popülasyonlarının mimarisini in situ koruyan ve haritalandıran tamamlayıcı mekansal teknikler gerektirir. Sağlıklı ve hastalıklı BM dokusunun transkripsiyonel heterojenliğinin anlaşılmasına katkıda bulunan tek hücre teknolojilerindeki önemli ilerlemelere rağmen, farklı hücre tiplerinin mekansal organizasyonu, niş-spesifik düzenleyici programlar ve bunların etkileşimleri hala daha fazla çalışma gerektirmektedir. Mekansal transkriptomikteki son gelişmeler, farklı dokular boyunca mekansal bağlamla birlikte tarafsız gen ekspresyon analizine olanak sağlamış ve bu teknolojileri, mekansal çözünürlüğü olmayan tek hücre yöntemlerini tamamlayıcı hale getirmiştir. Mekansal transkriptomik yumuşak dokularda yaygın olarak kullanılmış olsa da, kemik dokusunun işlenmesiyle ilgili zorluklar nedeniyle BM gibi mineralize dokulardaki kullanımı sınırlı kalmıştır. Burada sunulan protokol; sağlıklı ve hastalıklı fare ve insan dokularından formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) örnekler hazırlamak için kullanılmıştır. RNA bütünlüğünü korumak ve uzun kemik örneklerinde mekansal transkriptomik kullanımını desteklemek için 10 günlük etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tabanlı bir dekalsifikasyon adımı eklenmiştir. Bu protokol; doku işleme, koruma ve kesit alma ile birlikte kesit bütünlüğü, doku morfolojisi ve RNA kalitesinin değerlendirilmesi gibi temel kalite değerlendirme adımlarını içeren, mekansal transkriptomik analiz için BM örneklerinin hazırlanmasını açıklamaktadır. İş akışı ayrıca; hücresel kompozisyonu karakterize etmek, hücre-hücre etkileşimlerini tanımlamak ve sağlıklı ve hastalıklı durumlarda transkripsiyonel olarak heterojen hücrelerin mekansal dağılımını görselleştirmek için hücre tipi tanımlamasını ve tek hücre transkriptomik verileriyle entegrasyonu desteklemektedir. Genel olarak bu iş akışı, BM mimarisini korurken, tamamen mineralize sağlıklı ve malign dokuları mekansal transkriptomik analiz için hazırlar.

Giriş

Kemik iliği (BM), hematopoiez ve bağışıklık hücresi olgunlaşması için birincil bölge olarak hizmet eden, oldukça karmaşık ve bölmelere ayrılmış bir organdır1,2. Bu heterojen doku; oldukça özelleşmiş ve organize bir üç boyutlu niş içinde birlikte var olan hematopoetik, mezenkimal, endotelyal ve immün hücre soy hatlarından oluşan çeşitli bir diziyi kapsar3,4. Bu niş içerisinde her bir hücre popülasyonu farklı anatomik bölgeleri işgal eder ve mekansal bağlam; hücresel davranışın, sinyalleşmenin ve fonksiyonun düzenlenmesinde temel bir rol oynar4,5. Trabeküler kemik veya vasküler ağlar gibi belirli yapılara olan fiziksel yakınlık; hematopoetik kök hücre (HSC) durgunluğunun sürdürülmesi ve kemik yeniden şekillenmesi dahil olmak üzere temel fizyolojik süreçleri yönetir6,7. Sonuç olarak, bu dinamik mikroçevre ve hücresel ile stromal bileşenleri arasındaki sıkı şekilde düzenlenen etkileşimler, homeostazı koruyan düzenleyici ağları şekillendirir ve hematolojik malignitelerin ilerlemesini etkiler8,9,10,11,12,13.

Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) alanındaki ilerlemeler, daha önce tanınmayan hücre alt tiplerinin ve bunların niş içindeki öngörülen etkileşimlerinin keşfedilmesine olanak sağlayarak kemik iliği (BM) hücresel çeşitliliğine dair anlayışımızda devrim yaratmıştır3,10,11,12,14,15,16. Ancak tek hücreli transkriptomik, hematopoetik nişin bireysel bileşenleri hakkında yüksek çözünürlüklü bilgiler sunsa da, doğası gereği hücreleri yerli ortamlarından ayıran ve potansiyel olarak doğal durumlarını değiştiren doku sindirim süreciyle17 ve kemik dokusu organizasyonunu tanımlayan mekansal bağlamın eksikliğiyle sınırlıdır4,18. Pozisyonel bağlamın bu kaybı, transkripsiyonel olarak belirgin spesifik popülasyonların nerede yerleştiğinin veya komşu hücrelerle nasıl etkileşime girdiğinin kesin olarak haritalandırılmasını imkansız kılmaktadır19. Ayrıca, yoğun kemik dokusu genellikle sadece kısmen ayrıştırılır; bu durum, scRNA-seq veri setlerinde osteositler ve adipositler gibi temel hücre popülasyonlarının yetersiz temsil edilmesine ve doku heterojenliğinin yanlı bir şekilde temsil edilmesine yol açar20,21. Mekansal transkriptomik, gen ekspresyonunun mekansal olarak korunmuş doku kesitleri içinde, in situ olarak çalışılmasına izin vererek bağlamsal bilgileri geri kazanır ve tek hücreli teknolojilerin sınırlamalarını giderir8,19,22,23,24,25,26. Bu teknoloji, BM'yi oluşturan farklı hücre popülasyonlarının hassas mekansal konumlandırılmasını ve yapısal organizasyonunu mümkün kıldığı için alanda temel bir ilerlemeyi temsil etmektedir; bu durum, hücrelerin doğal mikroortamlarındaki etkileşimlerini ve fonksiyonel rollerini anlamak için vazgeçilmezdir8,26. Dahası, hastalık bağlamında mekansal transkriptomik, araştırmacıların ve klinisyenlerin geleneksel patoloji ile yüksek kapasiteli genomik arasındaki boşluğu doldurmalarına, moleküler verileri morfolojik görüntüler üzerine bindirmelerine olanak tanır1,8. Mekansal transkriptomik teknolojileri iki ana gruba ayrılabilir: dizileme tabanlı yöntemler ve görüntüleme tabanlı yöntemler17,24. Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) ve açık kaynaklı Open-ST gibi dizileme tabanlı platformlar, yeni nesil dizileme öncesinde mRNA'yı mekansal olarak kodlanmış diziler veya boncuklar üzerinde yakalar. Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX ve Xenium dahil olmak üzere görüntüleme tabanlı yöntemler, transkriptleri çoklu hibridizasyon veya padlock prob kimyası aracılığıyla doğrudan in situ olarak görselleştirir27,28. Alternatif olarak, platformlar, prob tabanlı tespit gerektirip gerektirmediklerine bağlı olarak hedefli veya hedefsiz olarak kategorize edilebilir17,24.

Uzamsal transkriptomik yöntemleri; beyin, kalp ve karaciğer gibi bozulmamış histolojik kesitlerin oluşturulmasının kolay olduğu yumuşak dokulara yaygın olarak uygulanmıştır.29,30,31Buna karşılık, kemiğin mineralize yapısı nedeniyle kemikte uzamsal transkriptomiğin uygulanması, bir dekalsifikasyon işlemi gerektirdiğinden oldukça daha zordur.32,33kalsiyum fosfatın kontrollü bir şekilde uzaklaştırılmasıyla dokunun, kesit alma ve sonraki histolojik veya moleküler analizler için yeterince yumuşak hale getirilmesi8,20,23,34Klinik uygulamalarda rutin olarak kullanılan geleneksel dekalsifikasyon yöntemleri tipik olarak hidroklorik, nitrik, formik veya fosforik asit gibi ağır asidik çözeltilere dayanır; bu çözeltiler RNA bütünlüğünü ciddi şekilde bozar ve hücresel morfolojiyi tahrip eder.35,36Bu tür moleküler degradasyon, mekansal analizlerde sinyal-gürültü oranını düşürerek genellikle yumuşak dokulara kıyasla kabul edilemeyecek kadar düşük gen saptama oranlarına yol açar.8,10Bu sınırlama, sekanslama tabanlı mekansal analizler için mineralize örneklerde mRNA bütünlüğünü güvenilir bir şekilde koruyan standartlaştırılmış dekalsifikasyon iş akışlarına duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.8,20.

Bu protokol, daha önce Muiños-Lopez ve ark. tarafından uygulanan8, uzamsal transkriptomik için formalinle fikse edilmiş, parafinle gömülmüş (FFPE) BM örneklerinin hazırlanmasına yönelik standartlaştırılmış bir iş akışı sunmaktadır. İş akışı, kontrollü pH'da etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kullanılarak gerçekleştirilen 10 günlük bir dekalsifikasyon aşamasını içermektedir. Agresif asitlerin aksine EDTA, mikroskobik yapıyı koruyan ve nükleik asit kalitesini sürdüren nazik bir şelatör olarak işlev görerek moleküler uygulamalarda kullanımını destekler8,20,33,36,37. Kavram kanıtı olarak protokol; sağlıklı ve multipl miyelom (MM) fare modellerinden alınan kemik doku örnekleri ile sağlıklı ve hastalıklı bireylerden alınan insan BM örnekleri üzerinde uygulanmış ve örnekler daha sonra Visium Spatial Gene Expression platformunda sekanslanmıştır38. İş akışı; hem insan hem de fare kemik örneklerinden doku temini, fiksasyon, dekalsifikasyon, dehydrasyon, parafin gömme ve kesit alma için standartlaştırılmış prosedürleri; ardından kesit bütünlüğü değerlendirmesi, hematoksilin ve eozin (H&E) boyama, RNA kalite değerlendirmesi (DV200) ve hücre tipi doğrulaması için isteğe bağlı immünofloresan (IF) analizini kapsayan kapsamlı bir kalite kontrol hattını içermektedir. Bu hazırlık adımları, yalnızca yüksek kaliteli kesitlerin; doku kesitlerinin ön işlemi, kütüphane oluşturma, sekanslama ve ardından gelen veri kalite kontrolü ve analizi dahil olmak üzere alt uzamsal transkriptomik iş akışlarına geçmesini sağlar.

Bu standartlaştırılmış prosedür, mekansal transkriptomik analizler için insan ve fare BM örneklerinin hazırlanmasını ve kalite değerlendirmesini desteklemektedir. Hematolojik ve iskeletsel bozukluklardaki nişe özgü düzenleyici programların araştırılmasını kolaylaştırmak amacıyla tasarlanmıştır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına yönelik 2010/63/EU sayılı Avrupa Direktifi'ne uygun olarak yürütülmüş ve Navarra Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu (Comité de Ética para la Experimentación Animal; protokoller CEEA082-20 ve CEEA039-20) tarafından onaylanmıştır. Hayvan bakımı, tutumu ve ötanazisi, ağrı ve acıyı en aza indirmek amacıyla İspanyol mevzuatına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

İnsan çalışması, Navarra Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Kurulu (Comisión de Ética de Investigación, CEI; 2022.100mod1 ve 2023.172 sayılı projeler) ve Navarra Sağlık Hizmetleri Araştırma Etik Kurulu (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1) tarafından onaylanmıştır. İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, Helsinki Deklarasyonu'nun etik ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür. Kişisel veriler, Kişisel Verilerin Korunması ve Dijital Hakların Garanti Altına Alınması hakkındaki İspanyol Organik Kanunu 3/2018 ve Biyomedikal Araştırmalar hakkındaki İspanyol Kanunu 14/2007 uyarınca gizli tutulmuştur.

NOT: Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntılı bir listesi şurada sunulmuştur: Materyaller TablosuKemik dokularında uzamsal transkriptomiğin uygulanması için kapsamlı deneysel iş akışı şematik olarak şurada gösterilmiştir: Şekil 1 ve üç operasyonel aşamaya ayrılmıştır: örnek temini, kalite kontrol (QC) ve mekânsal transkriptomik profilleme. Örnek temini; insan veya fare kemik fragmanlarının toplanmasını, ardından fiksasyon, EDTA ile dekalsifikasyon, dehidrasyon, parafin gömme, kesit alma ve lam hazırlama işlemlerini kapsar. QC aşamasında histolojik bütünlük ve RNA korunumu değerlendirilir. Doğrulanmış kemik kesitleri daha sonra lam üzerinde doku permeabilizasyonuna, kütüphane hazırlığına, sekanslamaya ve veri analizine tabi tutulur.

Kemik doku işleme: fiksasyon, dekalsifikasyon,dehidratasyon; uzamsal transkriptomik iş akışı diyagramı.
Şekil 1: Fare ve insan kemik dokuları için örnek toplama ve EDTA tabanlı hazırlama iş akışı. Fare femurları ve insan kemik örnekleri toplanır, fikse edilir, EDTA içinde dekalsifiye edilir, dehidrate edilir, parafine gömülür ve kesitlenir. Örnek kalitesi H&E boyama ve RNA bütünlüğü (DV200) değerlendirmesi ile belirlenir; ardından uzamsal transkriptomik doku ön işlemesi, kütüphane hazırlama, sekanslama ve veri kalite kontrolü gerçekleştirilir. Kısaltmalar: BM = kemik iliği; DV200 = 200 nükleotitten uzun RNA fragmanlarının yüzdesi; EDTA = etilendiamintetraasetik asit; H&E = hematoksilen ve eozin; QC = kalite kontrol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Kemik doku örneklerinin temini ve işlenmesi

  1. Fare kemiği toplama
    1. Hayvanları %5 isofloran ile anestezi edin ve refleks kaybını doğrulayın.
    2. Tam anestezi sağlandıktan sonra, kurumsal ve düzenleyici kılavuzları takip ederek servikal dislokasyon ile ötenazi gerçekleştirin.
      ​NOT: Ötenazi eğitimli personel tarafından yapılmalı ve doku toplamaya geçmeden önce ölüm doğrulanmalıdır.
    3. Farenin dorsal yüzeyine %70 etanol püskürterek cildi dezenfekte edin ve cerrahi makas kullanarak cildi dikkatlice kaldırmak ve arka ekstremiteleri açığa çıkarmak için küçük bir insizyon yapın.
    4. Kalça ekleminin üzerinden keserek arka ekstremiteleri diseke edin ve 10 mL soğuk Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpü buz üzerinde bekletin.
    5. Steril pens ve skalpel kullanarak yapışık kas ve bağ dokusunu temizleyin.
    6. Kemikleri, temiz ve soğuk DPBS ile önceden doldurulmuş 50 mL'lik steril bir kaba aktarın, ardından kabı buz üzerine yerleştirin.
    7. Doku bütünlüğünü korumak için derhal örnek doku fiksasyonuna geçin.
  2. İnsan kemiği örneği işleme
    1. Kemik kor biyopsilerini veya cerrahi kemik fragmanlarını 100 mL'lik steril kaplarda teslim alın.
    2. Kemik fragmanlarını soğuk DPBS ile önceden doldurulmuş temiz ve steril bir 100 mL'lik kaba aktarın, ardından buz üzerine yerleştirin.
    3. Doku bütünlüğünü korumak için derhal örnek fiksasyonuna geçin.
      DİKKAT: İnsan örnekleri BSL 2 koşulları altında işlenmelidir.
  3. Kemik dokusu fiksasyonu
    1. Kemik örneğini içeren 50 mL veya 100 mL'lik kabı alın ve DPBS'yi boşaltın.
    2. Plastik kasetleri etiketleyin ve kemik örneklerini ayrı kasetlere yerleştirin. Sonraki işlemler sırasında doku kaybını önlemek için kapakları güvenli bir şekilde kapatın.
      ​NOT: Fare örnekleri için kaset başına bir kemik yerleştirin. İnsan kemiği örnekleri için, gerekirse dokuyu standart kasetlere sığacak kadar küçük fragmanlara bölmek için steril bir skalpel kullanın ve kaset başına bir fragman yerleştirin. İnsan kemiği örnekleri bu aşamada kesilmek için çok sertse, bütün halde bırakılıp dekalsifikasyon solüsyonuna aktarılabilir; dekalsifiye olduktan sonra, yumuşayan doku uygun boyutlardaki fragmanlara bölünebilir ve etiketli kasetlere yerleştirilebilir.
    3. 1:20 örnek-fiksatif oranında %4 tamponlu formaldehit solüsyonu ekleyin ve örneği 4 °C'de 24 sa boyunca inkübe edin.
      DİKKAT: Toksisitesi ve uçucu buharları nedeniyle fiksatif ile kimyasal çeker ocak içerisinde çalışın.
      NOT: FFPE iş akışlarında RNA bütünlüğünü azaltan aşırı fiksasyondan (>48 sa) kaçının39.
  4. Mineralize kemik dokusunun dekalsifikasyonu
    1. Formalini boşaltın ve kemik örneğini ultrapure su ile yıkayın. Kalan formalin kalıntılarını gidermek için suyla durulayın, kısa süre ajite edin ve boşaltın.
    2. Ultrapure su içinde 0.25 M EDTA solüsyonu hazırlayın ve pH'ı 6.95'e ayarlayın.
      NOT: Geleneksel dekalsifikasyon protokollerinde EDTA genellikle pH 8.0'e ayarlansa da, bu iş akışı doku morfolojisini ve RNA kalitesini korurken etkili şelasyon sağlamak için yaklaşık pH 6.95'te EDTA kullanır8.
    3. EDTA solüsyonunu kemik örneğinin bulunduğu kaba ekleyin ve 4 °C'de hafif ajitasyonla 10 gün boyunca inkübe edin.
      ​NOT: Fare örnekleri için genellikle yaklaşık 50 mL EDTA solüsyonu yeterlidir. İnsan kemiği örnekleri için genellikle yaklaşık 100 mL kullanılır. Ancak, tam daldırmayı ve etkili dekalsifikasyonu sağlamak için bu hacim kemik boyutuna göre ayarlanabilir.
    4. 5 günlük dekalsifikasyondan sonra, şelasyon kapasitesi zamanla doygunluğa ulaştığı için EDTA solüsyonunu boşaltın ve aynı hacimde taze EDTA ile değiştirin. İnkübasyona aynı koşullar altında devam edin.
    5. 10 günlük inkübasyonun ardından EDTA solüsyonunu boşaltın ve dekalsifikasyonun tamamlanıp tamamlanmadığını değerlendirin.
      1. Steril bir skalpel ile küçük bir kesik yapın veya dokunun bir köşesine ya da periferik bölgesine ince steril bir iğne batırın; ilgi bölgelerini değiştirmemek için her zaman analitik önemi düşük bir alan seçin. Kesme veya iğne batırma sırasında örneği sabitlemek için kemiği steril bir Petri kabına yerleştirin. Doku kolayca kesilebiliyorsa veya iğne minimum dirençle geçiyorsa, örnek yeterince dekalsifiye olmuştur.
      2. Fare femurları durumunda, mineral eliminasyonunun tamamlandığının güvenilir bir göstergesi olan esnekliği değerlendirmek için kemiği pensle nazikçe bükün.
        NOT: Dekalsifikasyon adımının süresi, kemik örneğinin boyutuna ve kalınlığına ve kullanılan EDTA hacmine bağlıdır. İlk inkübasyon süresinden sonra kemik sert kalırsa, doku kolayca kesilecek kadar yumuşayana kadar dekalsifikasyona devam edin. Aşırı uzatma doku kalitesini ve RNA bütünlüğünü tehlikeye atabilir, bu nedenle uzatma süresi yeterli yumuşamayı sağlamak için gereken minimum süre ile sınırlandırılmalıdır20.
  5. Dehidratasyon
    1. Kemik örneğinin bulunduğu kaba ultrapure su ekleyerek yıkayın, ardından 4 °C'de ajitasyonla 5 dk inkübe edin.
    2. Suyu boşaltın ve %70'lik etanol solüsyonu ile değiştirin. 4 °C'de 1 sa inkübe edin.
      NOT: Bu adım bir durdurma noktası olarak kullanılabilir. Örnekler, sonraki adımlara geçmeden önce 4 °C'de %70 etanolde saklanabilir. Maksimum saklama süresi bu protokolde deneysel olarak doğrulanmamıştır, bu nedenle kullanıcılar laboratuvarlarının standart uygulamalarına göre hareket etmelidir.
    3. Örneği artan etanol konsantrasyonlarında (%70, %80, %96; her biri 4 °C'de 1 sa) ardışık olarak dehidrate edin ve ardından gece boyunca 4 °C'de %100 etanolde bekletin.
    4. %100 etanolü boşaltın ve ksilen ile değiştirin. Oda sıcaklığında (RT) 4 sa inkübe edin.
    5. Ksileni boşaltın ve örnek kasetini eritilmiş, temiz parafin içeren bir cama yerleştirin. Eritilmiş parafinde 60 °C'de gece boyunca inkübe edin.
      NOT: Vakum destekli işlem sistemleri mevcut olduğunda, bu cihazlar daha etkili parafin penetrasyonu sağladığı için daha kısa infiltrasyon süreleri kullanılabilir40,41,42.
      DİKKAT: Ksilen ve dereceli etanol solüsyonlarını içeren tüm adımlar, uygun havalandırmayı sağlamak ve toksik ve yanıcı buharlara maruz kalmayı en aza indirmek için kimyasal çeker ocak içerisinde gerçekleştirilmelidir.
  6. Parafin gömme
    ​NOT: RNA degradasyonunu önlemek için gömme istasyonunun yüzeylerini bir RNase dekontaminasyon solüsyonu ile temizleyin.
    1. Gömme istasyonunu açın ve parafin rezervuarını, kaset parafin banyosunu, kalıp parafin banyosunu ve kalıp ısıtma plakasını 60 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun. Gömme işleminden önce soğumasını sağlamak için soğuk plakayı aktive edin.
    2. Parafinin tamamen erimesini bekleyin ve ardından parafinle infiltre edilmiş örnekleri içeren kasetleri kaset parafin banyosuna yerleştirin. Gömme öncesinde ksilenin tamamen temizlendiğinden emin olmak için 2 sa inkübe edin.
    3. Gerekli tüm kalıpları kalıp parafin banyosuna yerleştirin.
      NOT: İnsan örnekleri için standart metal gömme kalıpları kullanın. Fare örnekleri için, Visium lamları üzerine uygun kesit yerleşimi için uygun boyutlarda kare bir boşluk içeren, Visium platformuyla uyumlu plastik gömme kalıpları kullanın. Tüm fare kemikleri bu kalıpların kare boşluğuna tamamen sığmadığı için, gömme işleminden hemen önce steril bir skalpel kullanarak kemikleri uygun boyutta fragmanlar elde edecek şekilde kesin. Boyutlarına bağlı olarak, kalıp başına bir veya iki kemik fragmanı gömülebilir.
    4. Gömme istasyonunun merkezi çıkışından eritilmiş parafin akıtarak ince bir taban katmanı ekleyin.
    5. Kaseti açın ve dokuyu sıcak pens kullanarak nazikçe kasetten kalıba aktarın.
    6. Parafinle dolu kalıbı kalıp ısıtma plakasına yerleştirin ve parafin sıvı haldeyken, dokuyu sıcak pens ile istenen kesme düzlemine göre yönlendirin.
    7. Kemik fragmanının konumunu kısa süreliğine sabitlemek için kalıbı gömme istasyonunun soğuk yüzeyine yerleştirin.
    8. Kalıbı, dokunun tamamen kapandığından ve büyük kabarcık kalmadığından emin olacak şekilde dispenserden eritilmiş parafin ile tamamen doldurun.
    9. Etiketli kaseti, parafin bloğunun tabanını oluşturacak şekilde kalıbın üzerine yerleştirin.
    10. Kaseti takılı kalıbı gömme istasyonunun soğuk plakasına aktarın. Parafinin tamamen katılaşıp blok opak ve sert hale gelene kadar 10 dk bekleyin.
    11. Katılaştıktan sonra, parafin bloğunu kalıptan çıkarın ve kesit alma işlemine kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Bu adım bir durdurma noktası olarak kullanılabilir. Parafin bloğu 4 °C'de saklanabilir; ancak, saklama sırasında RNA degradasyonunu en aza indirmek için, mümkün olduğunca doku kesitleri ve sonraki mekansal transkriptomik analizler gömme işleminden sonra pratik olan en kısa sürede gerçekleştirilmelidir43,44.
  7. Kesit alma ve lam hazırlama
    NOT: RNA degradasyonunu önlemek için mikrotomu ve su banyosunu bir RNase dekontaminasyon solüsyonu ile temizleyin.
    1. Su banyosunu distile su ile doldurun ve 42 °C'ye ön ısıtma yapın. Mikrotomu açın ve yeni bir bıçak takın. Mikroskop lamlarını kurşun kalemle etiketleyin.
    2. Parafin bloğunu, kasetin istenen boylamsal kesme düzlemine göre yönlendirildiğinden emin olarak numune tutucuya yerleştirin.
      ​NOTE: Buzla dolu plastik bir torba hazırlayın ve yumuşak parafin nedeniyle kesim zorlaştığında, parafini sertleştirmek ve kesit kalitesini artırmak için buz torbasını mikrotomda takılı olan bloğun üzerine doğrudan yerleştirip bir lastik bantla birkaç dakika sabitleyin.
    3. Mikrotom kalınlığını 20 µm'ye ayarlayın ve ön düzeltme kesimlerini yapın.
    4. Mikrotom ayarını 5 µm'ye getirin. Dört adet 5 µm'lik kesiti etiketli, RNase-free 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Tüpü kuru buz üzerinde tutun ve -80 °C'de saklayın.
    5. 5 µm'de kesit almaya devam edin ve şeritleri su banyosuna yüzdürün. Kesit tamamen genişlediğinde ve kırışıklıklar gittiğinde, etiketli lam ile alın.
      1. Her belirli sayıda kesitte (örneğin doku boyutuna bağlı olarak her 5-10 şeritte), yeni etiketli bir 1.5 mL'lik tüpe ek olarak 4 adet 5 µm'lik kesit toplayın. Toplamda 5 µm'lik kesitler içeren üç adet 1.5 mL'lik tüp elde edene kadar bu işlemi tekrarlayın.
        NOT: Doku çatlarsa, kırılırsa veya sürekli bir kesit olarak elde edilemezse, örnek tam olarak dekalsifiye olmamıştır ve ek dekalsifikasyon süresi gerektirir. İş akışını dekalsifikasyon aşamasına kadar geri sararak örneği kurtarın. Bunun için parafin bloğunu yaklaşık 2 sa boyunca 60 °C'de eritin ve örneği ksilene (2 sa) aktarın. Örneği dereceli etanol solüsyonları (%100, %96, %80, %70) ve ardından distile su ile rehidrate edin. Rehidrate edilmiş örneği taze 0.25 M EDTA'ya (pH 6.95) geri döndürün ve dehidratasyon, yeniden gömme ve kesit almaya geçmeden önce dekalsifikasyon süresini gerektiği kadar uzatın. FFPE işlemini geri döndürmek RNA bütünlüğünü tehlikeye atabileceğinden, bu kurtarma prosedürü kesinlikle son çare olarak kullanılmalıdır.
    6. Kalıntı suların buharlaşması için lamları gece boyunca 37 °C'lik fırında bekletin, ardından 4 °C'de saklayın.
    7. Doku yapışmasını artırmak için, isteğe bağlı olarak lamları gece boyunca 37 °C'de inkübe etmeden önce 42 °C'de 3 sa boyunca fırınlayın.
      NOT: Malzeme Tablosunda listelenen cam lamlar kullanıldığında bu adım genellikle gerekli değildir, çünkü bu lamlar güçlü yapışma sağlar ve doku genellikle işlem boyunca sıkıca yapışık kalır. Bu adım bir durdurma noktası olarak kullanılabilir. Lamlar 4 °C'de saklanabilir; ancak, saklama sırasında RNA degradasyonunu en aza indirmek için, mümkün olduğunca sonraki mekansal transkriptomik analizler gömme işleminden sonra pratik olan en kısa sürede gerçekleştirilmelidir43,44.

2. Numunenin kalite değerlendirmesi

  1. Kesit kalitesinin değerlendirilmesi
    1. Tüm kesitleri standart bir parlak alan ışık mikroskobu altında (4×–10×) tek tek inceleyin. Kesitlerin parçalanmadığından emin olmak için her lamı kontrol edin ve her bir kesitin kalitesini kaydedin.
      NOT: Parafin sertliği, bıçak keskinliği veya yetersiz dekalsifikasyon sorunlarına işaret edebilecek katlanma, kırışıklık, sıkışma veya tırtıklı izleri (chatter marks) kontrol edin. Kesit alma veya su banyosuna aktarma sırasında kopma nedeniyle doku kaybı olup olmadığını doğrulayın.
    2. Uzamsal transkriptomik için en iyi korunmuş kesitleri seçin (en eksiksiz, en iyi morfolojiye sahip olanlar).
    3. Seçilenlerin bitişiğindeki ardışık kesitleri belirleyin ve boyanan görüntünün dizilenecek dokuyla mümkün olduğunca yakın şekilde örtüşmesini sağlamak için bunları H&E boyama ve IF için ayırın.
  2. Doku bütünlüğü için H&E boyama
    1. Lamları cam bir lam boyama rafına yerleştirin ve 60 °C'de 15 dk inkübe edin.
    2. Rafı, ksilen içeren cam boyama kavanozlarına 15 dk boyunca aktarın.
    3. Rafı %100, %96, %80 ve %70 etanol içeren boyama kavanozlarından geçirerek ve her çözeltide 5 dk inkübe ederek kesitleri yeniden hidrate edin.
      UYARI: Ksilen ve dereceli etanol çözeltileri içeren tüm adımlar, uygun havalandırmayı sağlamak ve toksik ve yanıcı buharlara maruz kalmayı en aza indirmek için kimyasal çeker ocak içinde gerçekleştirilmelidir.
    4. Lamları suyla dolu bir boyama kavanozunda 5 dk boyunca durulayın.
    5. Rafı 10 dk boyunca hematoksilin içinde bekletin, ardından durulama suyu berraklaşana kadar akan musluk suyu altında yıkayın.
    6. Rafı, beş damla konsantre hidroklorik asit içeren suyun içine daldırın ve kırmızımsı bir ton oluşana kadar hafifçe çalkalayın.
    7. Rafı, stabil bir mavi renk gelişene kadar lityum karbonat ile doyurulmuş suya aktarın, ardından suda kısa bir süre durulayın.
    8. Kesitleri %1 (w/v) eosinde 5 dk boyunca boyayın, ardından tekrar suda durulayın.
    9. Rafı su, %70, %80, %96 ve %100 etanol içeren boyama kavanozlarından geçirerek ve her çözeltide 5 dk inkübe ederek lamlarıye dehidrate edin.
    10. Lamları 15 dk boyunca ksilen ile şeffaflaştırın.
    11. Her lamın arkasını nazikçe kurulayın, bir lamel üzerine kapatma medyumu uygulayın ve kesitleri kapatın. Görüntüleme öncesinde lamların oda sıcaklığında (RT) 24 saat boyunca kurumasına izin verin.
    12. 20x büyütmede yüksek çözünürlüklü bir mikroskop kullanarak doku görüntülemesi gerçekleştirin.
      NOT: Örneğinin uzamsal transkriptomik için uygunluğunu değerlendirmek amacıyla, bir kalite kontrol adımı olarak önce bitişik kesitlerde H&E boyama yapın. Seçimden sonra, Malzeme Tablosunda listelenen uzamsal gen ekspresyon platformu için üreticinin doku hazırlama kılavuzunu takip ederek, doğrudan uzamsal transkriptomik için amaçlanan kesit üzerinde ikinci bir H&E boyama gerçekleştirin.
  3. RNA bütünlük değerlendirmesi (DV200)
    NOT: Uzamsal gen ekspresyon protokolü için geleneksel RNA Bütünlük Sayısı (RIN) etkisizdir çünkü fikse edilmiş dokularda 18S ve 28S ribozomal RNA pikleri genellikle mevcut değildir. Bu nedenle, 200 nükleotitten büyük RNA fragmanlarının yüzdesi olarak tanımlanan DV200 metriği, degrade olmuş klinik örnekler için RIN'den daha bilgilendirici bir kalite parametresi olarak yaygın şekilde kullanılır. Visium v2 için 10x Genomics, verimli prob hibridizasyonu ve optimal analiz performansı sağlamak adına DV200 değeri ≥ %30 olan FFPE bloklarının kullanılmasını önermektedir. Mevcut en yüksek DV200 değerlerine sahip doku bloklarının seçilmesi, sekanslama kayıplarını (dropouts) önlemeye yardımcı olur ve spot hassasiyetini maksimize eder.
    1. Doku kesit alma adımı sırasında toplanan 5 µm kesitleri içeren 1,5 mL tüpleri geri alın ve RNA ekstraksiyonu için buza yerleştirin.
    2. Toplam RNA ekstraksiyonu yapın. Bu standartlaştırılmış prosedür; örnek deparafinizasyonu, formalin çapraz bağlarını geri çevirmek için proteinaz K sindirimi, DNase I işlemi ile genomik DNA'nın uzaklaştırılması ve saflaştırılmış RNA'nın RNase-free suda son elüsyonunu içerir.
    3. Yüksek hassasiyetli bir RNA analizi ile kapiler elektroforez tabanlı bir sistem kullanarak RNA bütünlüğünü değerlendirin. İş akışının özeti Ek Dosya 1'de sunulmuştur42,45,46,47,48.
  4. Hücre tipi doğrulaması için isteğe bağlı IF
    1. FFPE lamını cam bir lam boyama rafına yerleştirin ve 60 °C'de 15 dk inkübe edin.
    2. Rafı, ksilen içeren cam boyama kavanozlarına 15 dk boyunca aktarın.
    3. Rafı %100, %96, %80 ve %70 etanol üzerinden her biri 2 dk olacak şekilde geçirerek, ardından 5 dk suda ve 5 dk PBS-Tween (%0,1 Tween-20 ile desteklenmiş 1x PBS) içerisinde tutarak kesiti yeniden hidrate edin.
      UYARI: Ksilen ve etanol içeren tüm adımlar kimyasal çeker ocak içinde gerçekleştirilmelidir.
    4. Birincil antikor için üreticinin önerilerine göre antijen geri kazanımı (antigen retrieval) gerçekleştirin; geri kazanım tamponunun, pH'ın ve ısıtma koşullarının antikor veri sayfasıyla eşleştiğinden emin olun. NOT: Bu iş akışında antijen geri kazanımı, bir yemek pişirme tenceresi ısıtma sisteminde 10 mM Tris ve 1 mM EDTA, pH 9,0 ile 95 °C'de 30 dk boyunca uygulanmış, ardından oda sıcaklığında (RT) 20 dk soğutulmuştur.
    5. Lamı PBS-Tween ile her biri 10 dk olmak üzere iki kez yıkayın.
    6. Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak doku etrafına hidrofobik bir bariyer çizin ve nemlendirilmiş bir bölmede oda sıcaklığında (RT) en az 40 dk boyunca doku kesitlerine 1x DPBS içinde %5 BSA uygulayarak spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.
      NOT: Nemli bölme, plastik bir lam boyama kutusuna bir filtre kağıdı yerleştirilerek ve antikor inkübasyonu sırasında stabil bir nemli ortamı korumak için distile su ile iyice nemlendirilerek hazırlanır.
    7. Birincil antikor çözeltisini 1x DPBS içinde her antikor için önerilen dilüsyonda hazırlayın.
      NOT: Bu iş akışında, üretici protokolüne uygun olarak, sırasıyla fare EC ve MSC'lerini tanımlamak için Emcn (V.7C7) ve Cd271 (ME20.4) karşıtı birincil antikorlar; bunların insan karşılıklarını tanımlamak için ise CD31 (JC70A) veya PRRX1 (poliklonal) karşıtı antikorlar kullanılmıştır.
    8. Bloke etme çözeltisini, kalıntı damlacıkları uzaklaştırmak için lamın kenarını emici kağıda hafifçe vurarak temizleyin, ardından birincil antikor karışımını uygulayın ve lamı nemlendirilmiş bir bölmede 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
    9. Lamı PBS-Tween ile 5 dk boyunca iki kez yıkayın ve floroforların spektral olarak uyumlu olduğundan ve örtüşmediğinden emin olarak ikincil antikor çözeltisini üreticinin önerdiği dilüsyonda hazırlayın.
      NOT: Bu iş akışında, 1:200 dilüsyonda Alexa Fluor-konjuge ikincil antikor kullanılmıştır.
    10. İkincil antikor karışımını uygulayın ve nemlendirilmiş bir bölmede, ışıktan korunmuş olarak oda sıcaklığında (RT) 30 dk inkübe edin.
    11. Lamı PBS-Tween ile 5 dk boyunca iki kez yıkayın.
    12. 1:1 PBS–gliserol çözeltisinde hazırlanan DAPI içerikli kapatma medyumunun (bkz. Malzeme Tablosu) 1:10 dilüsyonunu uygulayın ve örneği 5 dk inkübe edin.
    13. Kesiti bir lamel ile kapatın ve kurumasını önlemek için kenarlarını oje ile mühürleyin.
    14. Boyanmış dokuyu multispektral bir görüntüleme platformu kullanarak görselleştirin.

Ek Dosya 1: RNA Bütünlük Değerlendirmesi ve Visium Uzamsal Transkriptomik İş Akışı için Protokol Adımlarının Özeti. Bu ek dosya, üretici talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilen prosedür adımlarının ayrıntılı bir özetini sunmaktadır. Şunları içermektedir: (i) ana protokolün 2.3.3 adımında açıklandığı üzere RNA bütünlüğünü (DV200) değerlendirmek için kullanılan High Sensitivity RNA ScreenTape Assay ve (ii) doku ön işleme, kütüphane hazırlama ve sekanslamayı kapsayan Visium CytAssist Uzamsal Gen İfadesi iş akışına genel bakış (ana protokolün 3.1–3.3 adımları).Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

3. Uzamsal transkriptomik

NOT: Uzamsal transkriptomik iş akışını, ilgili kullanıcı kılavuzlarını42,45,46 takip ederek Materyal Tablosu'nda listelenen platform ve reaktifleri kullanarak gerçekleştirin. Ek Dosya 1; temel doku ön işleme, kütüphane hazırlama ve sekanslama adımlarını özetlemektedir.

  1. Uzamsal transkriptomik veri kalite kontrolü
    1. Visium veri setleri için standart hattı kullanarak uzamsal transkriptomik verilerin demultipleks işlemini gerçekleştirin (bkz. Materyaller Tablosu).
    2. Okumaları uygun Ensembl 105 referans genomuna haritalayın.
      NOT: İnsan örnekleri için GRCh38 ve fare örnekleri için mm10 kullanılmıştır.
    3. Aynı hattı kullanarak filtrelenmiş özellik-barkod matrislerini oluşturun ve bunları sonraki tek hücre/uzamsal analiz ortamına aktarın (bkz. Materyaller Tablosu).
    4. Uzamsal transkriptomik hattı tarafından sağlanan görselleştirme arayüzündeki H&E görüntülerini inceleyin (bkz. Materyaller Tablosu) ve veri setine bağlı olarak kortikal kemik bölgesini veya kemik dokusunu kapsayan spotları manuel olarak kaldırın.
    5. Tek hücre analiz iş akışlarında yaygın olarak uygulanan varyans stabilize edici bir transformasyon yöntemi kullanarak veri setlerini normalize edin (bkz. Materyaller Tablosu).

Sonuçlar

Bu EDTA tabanlı iş akışının türler ve hastalık bağlamları genelindeki uygulanabilirliğini değerlendirmek amacıyla, protokol dört KM örneğine uygulanmıştır: sağlıklı ve multipl miyelom (MM) durumlarını temsil eden iki fare femuru ve iki insan kemik örneği (Tablo 1 ve Şekil 1).

Numune TanımlamaTürlerCinsiyetYaşHastalık
YFPcγ1FareDişi210 günSağlıklı
mMMFareErkek314 günMM
hHBMİnsanErkek76 yaşSağlıklı
hMMİnsanDişi50 yılMM

Tablo 1: Çalışmaya dahil edilen fare ve insan kemik örnekleri. Her örnek için tür, cinsiyet, yaş ve sağlık durumu belirtilmiştir. Kısaltmalar: hHBM = sağlıklı insan kemik iliği; hMM = insan multipl miyelom; mMM = fare multipl miyelom; MM = multipl miyelom; YFPcγ1 = sağlıklı kontrol faresi.

MM fare örneği hariç, bu çalışmada kullanılan örnekler daha önce karakterize edilmiş ve araştırma grubunun önceki yayınlarında, özellikle Muiños-Lopez ve ark. ile Cenzano ve ark. tarafından yapılan çalışmalarda raporlanmıştır. Daha önce raporlanan örnekler için mekansal transkriptomik verileri ve sonuçları söz konusu çalışmalarda sunulmuştur8,10. Bu nedenle, burada yer alan materyaller yeni biyolojik bulgular sunmaktan ziyade, protokolün mekansal transkriptomik için teknik uygunluğunu değerlendirmek amacıyla kullanılmıştır.

Fare femur kemiği örnekleri, MM hastalarının klinik ve immünolojik özelliklerini yeniden canlandıran BIC (BIcγ1) genetiği değiştirilmiş MM fare modelinden ve bunlara karşılık gelen sağlıklı kontrol fareden (YFPcγ1) elde edilmiştir8,49. Her hayvandan tek bir femur hasat edilmiş, temizlenmiş ve standart protokole göre işlenmiştir (Şekil 2A). Femurlar, bol miktarda mevcut iliğe, üstün niş kalitesine ve tekrarlanabilir işlem kolaylığına sahip oldukları için bu analizlerde özellikle kullanılmıştır; bu özellikler onları sekanslama tabanlı bir uzamsal transkriptomik platform için uygun kılmaktadır8,10. Kontrol fare femurunun başarılı bir şekilde dekalsifiye olduğu, pensle yapılan manuel manipülasyon sırasında doku esnekliğindeki belirgin artışla makroskobik olarak doğrulanmıştır (Şekil 2B). Ardından, RNA bütünlüğünü ve doku mimarisini sonraki moleküler analizler için korumak amacıyla, bu kemik parçası özel, uzamsal transkriptomik ile uyumlu bir kalıp kullanılarak parafine etkili bir şekilde gömülmüştür (Şekil 2C).

Zıt işleme geçmişlerine sahip iki insan KM örneği de analiz edilmiştir8,10. Hematolojik olarak sağlıklı taze bir insan KM örneği, Hospital Universitario de Navarra'da gerçekleştirilen bir ortopedik kalça protezi ameliyatı sırasında cerrahi atıklardan elde edilmiştir (Şekil 2D–F). Protokolün translasyonel faydasını göstermek için bu örnek, fare örneklerinde olduğu gibi işlenmiştir. Fare dokusunda gözlemlenen sonuçlarla uyumlu olarak, insan kemiğinin başarılı EDTA dekalsifikasyonu, iğnenin zahmetsizce nüfuz etmesiyle kanıtlandığı üzere dokunun tamamen yumuşamasıyla makroskobik olarak doğrulanmıştır (Şekil 2E). Dekalsifiye edilmiş insan kemiği parçası, sonraki işlemler için standart bir metal kalıp kullanılarak başarıyla parafine gömülmüştür (Şekil 2F). İkinci insan örneği, Clínica Universidad de Navarra (CUN) Patoloji Bölümü'nde bulunan, bir MM hastasının iliak kanadından alınan arşivlenmiş FFPE KM biyopsilerinden oluşmaktaydı. Özellikle, bu arşivlenmiş MM örneği daha önce güçlü asitler içeren standart bir klinik protokol kullanılarak dekalsifiye edilmişti36. Bu örnek, EDTA ile işlenen preparatlar ile kalitatif bir karşılaştırma sunmaktadır; ancak doku kaynağı, fiksasyon geçmişi, saklama koşulları ve dekalsifikasyon yöntemindeki farklılıklar, gözlemlenen farkların yalnızca dekalsifikasyon ajanına bağlanamayacağı anlamına gelmektedir.

Histolojik doku işleme: cetvellerle birlikte altı doku örneği; araştırmadaki analizler için görüntüleme.
Şekil 2: EDTA tabanlı hazırlık sırasında fare ve insan kemik örnekleri. (A) Dekalsifikasyon öncesi sağlam kontrol fare femurları. (B) Artan esnekliği gösteren dekalsifiye kontrol fare femuru. (C) Parafine gömülmüş kontrol fare kemik fragmanları. (D) Dekalsifikasyon öncesi kalça cerrahisinden alınan sağlıklı insan kemik fragmanları. (E) EDTA dekalsifikasyonu sonrası, iğne penetrasyonunu gösteren aynı fragman. (F) Parafine gömülmüş EDTA ile dekalsifiye sağlıklı insan kemiği. Ölçek çubukları: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. Kısaltma: EDTA = etilendiamintetraasetik asit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Genel doku mimarisini analiz etmek için H&E boyaması yapıldı (Şekil 3). Murine kesitlerde gözlemlenen daha iyi morfolojik koruma, türe özgü doğal özelliklerden ziyade örnekleme ve işleme süreçlerindeki farklılıkları yansıtıyor olabilir. Fare femurları özellikle uzamsal transkriptomik için toplandı ve bütün kemikler olarak hemen işlendi, böylece mimarileri korundu (Şekil 3A, B). Buna karşılık, insan örnekleri ya kalça değiştirme cerrahisi sırasında elde edilen artık materyallerden (Şekil 3C) ya da diyagnostik MM kemik biyopsilerinden (Şekil 3D) elde edilmiştir ve her iki kaynakta da pre-analitik doku kalitesi değişkenlik gösterebilir. Sonuç olarak, EDTA ile dekalsifiye edilmiş insan örneği ile asit ile dekalsifiye edilmiş MM biyopsisi arasındaki morfolojik farklar belirgin değildir; çünkü her iki insan örneği, yalnızca dekalsifikasyon nedeniyle değil, aynı zamanda genel doku işleme süreçleri nedeniyle de temel yapısal sınırlamalar sergilemektedir (Şekil 3C, D). Dolayısıyla, uzamsal transkriptomik için örnek kalitesinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi, birden fazla farklı parametrenin analiz edilmesini gerektirir. İlk olarak, yapısal koruma yalnızca kullanılan dekalsifikasyon asidine göre değil, aynı zamanda spesifik örnek tipine göre de önemli ölçüde değişebileceğinden, doku bütünlüğü dikkatle izlenmelidir. İkinci olarak, dekalsifikasyon koşulları RNA kalitesini etkileyebileceği için RNA kalitesi de değerlendirilmelidir20,35,36.

Mikroskop altında doku örneklerinin histolojik karşılaştırması; yapısal analiz için 500μm ölçek.
Şekil 3: Doku kalitesi değerlendirmesi için kullanılan H&E boyalı kesitler. Ardışık FFPE kesitleri sırasıyla (A) sağlıklı kontrol fareye10, (B) MM'li bir fareye, (C) sağlıklı insan kemiğine8,10 ve (D) bir insan MM biyopsisine8 karşılık gelmektedir. Ölçek çubukları = 500 µm. Kısaltmalar: FFPE = formalinle fikse edilmiş, parafine gömülmüş; H&E = hematoksilin ve eozin; MM = multipl miyelom. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Histolojik analizi tamamlamak amacıyla RNA kalitesi değerlendirilmiştir. H&E boyaması belirsiz farklılıklar ortaya koyarken, RNA bütünlüğü iki dekalsifikasyon yönteminin etkilerini net bir şekilde ayırt etmiştir (Tablo 2). Hem fare örneklerinden hem de sağlıklı insan kemiği örneğinden elde edilen DV200 değerleri, Visium FFPE analizleri için önerilen eşiği aşmış olup, prob hibridizasyonu ve kütüphane oluşturma için yeterli RNA fragman uzunluğu dağılımına işaret etmiştir. YFP sağlıklı fare örneği %82,55 DV200 değeri gösterirken, sağlıklı insan kemiği (hHBM) örneği %58'e ulaşmıştır; her iki değer de 10x Genomics tarafından tanımlanan %30'luk kabul eşiğinin oldukça üzerindedir. MM fare (mMM) örneği, kabul edilebilirliğin alt sınırına yakın olan %31,3'lük bir DV200 değeri göstermiştir; bu durum, diğer örneğe özgü faktörlerin yanı sıra, parafin bloğunun kesit alınmadan önce 4 °C'de uzun süre saklanmasını yansıtıyor olabilir. Buna karşın, asitle dekalsifiye edilmiş insan MM biyopsisi (hMM), morfolojik bozulma daha az belirgin olduğunda bile, belirgin şekilde daha düşük RNA bütünlüğü ile ilişkili olan yalnızca %8'lik bir DV200 değeri sergilemektedir. Özetle, hem yapısal hem de moleküler değerlendirmelerin yapılması, örneklerin sonraki aşamadaki uzamsal analizler için uygunluğunun belirlenmesi açısından önemlidir.

Numune TanımlamaDV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV200: Toplam RNA fragmanlarının yüzdesi > 200 nükleotid.
2Bu örnek, güçlü asitlerin kullanıldığı standart bir klinik protokol uygulanarak dekalsifiye edilmiştir.

Tablo 2: Çalışma örneklerinin RNA kalitesi. DV200, 200 nükleotidden daha uzun olan RNA fragmanlarının yüzdesidir; %30 ve üzerindeki değerler sonraki spatial transcriptomics analizleri için uygun kabul edilmiştir. Kısaltmalar: hHBM = sağlıklı insan kemik iliği; hMM = insan multipl miyelom; mMM = fare multipl miyelom.

Ek kalite değerlendirmeleri de gerçekleştirilebilir. Doku bütünlüğünü daha fazla doğrulamak ve EDTA dekalsifikasyonu sonrası belirli hücresel kompartmanların korunduğunu teyit etmek için, fare ve insan dokularından alınan komşu FFPE kesitleri üzerinde isteğe bağlı IF boyaması yapılmıştır. MM fare örneğinde endotelyal (EC) ve mezenkimal hücreleri (MSC) görselleştirmek için sırasıyla Endomucin (Emcn) ve Cd271 antikorları kullanılmıştır (Şekil 4A). Bu boyama, EDTA ile işlenmiş dokuların, sürekli Emcn boyaması ile iyi tanımlanmış vasküler yapılar ve korunmuş stromal ağlar sergilediğini, böylece test edilen belirteçlerin işlem sonrası saptanabilir kaldığını göstermiştir. Ayrıca, otomatik bir multispektral görüntüleme sistemi kullanılarak yapılan yüksek çözünürlüklü görüntüleme, test edilen antijenlerin hücre tipi doğrulaması için saptanabilir kaldığına dair ek kanıtlar sunarak, mekansal transkriptomik analiz öncesinde ek bir kalite kontrol katmanı sağlamıştır. Dahası, bu bulgular sağlıklı yaşlı insan örneklerinde de gözlemlenmiş; burada EC ekspresyonu CD31 ve MSC ekspresyonu PRRX1 (Paired Related Homeobox 1) antikorları ile saptanarak, test edilen niş belirteçlerinin EDTA dekalsifikasyonu sonrası tanımlanabilir kaldığı gösterilmiştir (Şekil 4B). Buna karşılık, bu bulgular çeşitli asit bazlı dekalsifikasyon protokollerine tabi tutulan insan MM biyopsilerinde tekrarlanamamıştır. Daha önce belirtildiği gibi, bu örneklerdeki RNA bütünlüğü düşüktü ve bu durum alt akış transkriptomik analizlerini kısıtlamıştır. Bu insan örneklerinin degrade yapısı nedeniyle, alt akış kullanımları temel transkriptomik profilleme8 ve malign plazma hücrelerinin (PC) immünohistokimyasal (IHC) değerlendirmesi ile sınırlı kalmıştır (Şekil 4C).

Doku kesitlerinin immünofloresan mikroskopisi; çok renkli boyama; hücresel yapı analizi.
Şekil 4: Hücre tipi doğrulaması için isteğe bağlı immünofloresan ve immünohistokimya. (A) DAPI ile işaretlenmiş çekirdekleri (mavi), CD271-pozitif MSC'leri (yeşil) ve EMCN-pozitif EC'leri (kırmızı) gösteren fare MM dokusu. (B) DAPI ile işaretlenmiş çekirdekleri (mavi), PRRX1-pozitif MSC'leri (yeşil) ve CD31-pozitif EC'leri (kırmızı) gösteren sağlıklı insan kemiği10. (C) CD138-pozitif malign PC'leri gösteren insan MM biyopsisi8. Ölçek çubukları: (A) 250 µm (genel görünüm), 20 µm (birleştirilmiş büyütme) ve 50 µm (tek kanallı görüntüler); (B) 500 µm (genel görünüm) ve 20 µm (birleştirilmiş ve tek kanallı büyütmeler); (C) 500 µm. Kısaltmalar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; EC = endotelyal hücre; MM = multipl miyelom; MSC = mezenkimal stromal hücre; PC = plazma hücresi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Doku morfolojisi ve DV200 sonuçları birlikte, EDTA ile işlem görmüş örneklerin sonraki aşamadaki uzamsal transkriptomik analizler için uygunluğunu desteklemektedir. Bu hazırlama iş akışının uzamsal transkriptomik uygulamaları daha önce rapor edilmiştir8,10.

Tartışma

EDTA tabanlı kontrollü dekalsifikasyon, standartlaştırılmış FFPE işlemleri ve sıkı kalite kontrol kontrol noktaları entegre eden bu protokol, özellikle güçlü asit tabanlı dekalsifikasyon yöntemlerinin neden olduğu RNA degradasyonu ve morfolojik hasarla ilgili olan, kemik dokusunun uzamsal transkriptomik için hazırlanmasıyla geleneksel olarak ilişkilendirilen birçok kısıtlamanın üstesinden gelmektedir8,10,20,33,36. Mineralize örneklerin uzamsal transkriptomik için işlenmesindeki en kritik adım dekalsifikasyondur. Yetersiz dekalsifikasyon, kemiğin kesilmeyecek kadar sert kalmasıyla sonuçlanır ve bu durum, uzamsal transkriptomik için yüksek kaliteli kesitler elde edilmesini fiziksel olarak imkansız hale getirir8,20,23,37,50. Kemik dokusu çok sert kaldığında, mikrotom bıçağına karşı parçalanır veya titreşir; bu da parçalanmış kesitlere veya yerli BM mimarisini doğru şekilde temsil etmeyen boşluklara yol açar. Önemli olan, dekalsifikasyonun başarısının mikrotomi aşamasına kadar tam olarak doğrulanamamasıdır: yüzeysel olarak yumuşamış görünen örnekler bile, yalnızca ince FFPE kesitleri alınmaya çalışıldığında belirginleşen kalıntı mineraller içerebilir. Bu nedenle, tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için dekalsifikasyon sürecinin dikkatle izlenmesi esastır.

İş akışında, sürekli ajitasyonla ve beşinci günde solüsyon değişimi ile 10 gün boyunca pH 6.95'te 0.25 M EDTA kullanılmaktadır8,10. Protokol geliştirme aşamasında, farklı dekalsifikasyon süreleri ve solüsyon değişim programlarının yanı sıra tek başına EDTA, polivinilpirolidon ile desteklenmiş EDTA ve %10 formik asit değerlendirilmiş olup karşılaştırmalı veriler burada sunulmamıştır. 10 günden daha kısa süreler, fare örneklerinin kesit alınması sırasında sıklıkla doku kırılmasına yol açarken, insan örnekleri örneğe bağlı davranışlar sergilemiştir. Bu nedenle, fare femurleri için 10 günlük süre kullanılırken, insan örnekleri yoğunluk ve trabeküler içeriğe bağlı olarak daha uzun dekalsifikasyon gerektirebilir. Parafin gömme işleminden önce fiziksel kalite kontrol kontrol noktaları kullanılmalıdır. Mikrotomi sırasında yetersiz dekalsifikasyon olduğu fark edilirse, ek ısı, solvent maruziyeti ve rehidrasyon RNA kalitesini bozabileceği için yeniden işleme prosedürü yalnızca son çare olarak kurtarma adımı şeklinde uygulanmalıdır.

Bu yöntemin temel sınırlaması, klinik patolojide yaygın olarak kullanılan hızlı asit tabanlı protokollerin aksine, işlem süresinin uzun olmasıdır20,36. İşlem sürelerinin uzunluğu araştırma ortamlarında genellikle kabul edilebilir olsa da, 24 saat içinde dekalsifikasyon sağlamak için Morse çözeltisi (%22,5 formik asit ve %10 sodyum sitrat) kullanan Miao ve ark. tarafından açıklanan protokol gibi güncel çalışmalar, mekansal analizler için kemik hazırlığının hızlandırılmasına yönelik artan ilgiyi vurgulamaktadır20. Bununla birlikte, asit tabanlı yöntemler tarihsel olarak RNA degradasyonu riskini çok daha fazla artırarak DV200 değerlerini düşürmekte ve sonuç olarak mekansal transkriptomik ile uyumluluklarını sınırlamaktadır1,8,35,36. Bu EDTA tabanlı yaklaşım, hıza kıyasla RNA korunmasına öncelik vererek Visium gibi sekanslama tabanlı mekansal platformlarla uyumluluğu sağlar.

BM mekansal transkriptomiğin potansiyel bir sınırlaması, PC'den türeyen immünoglobulin transkriptlerinin yüksek bolluğudur ve bu durum, düşük bolluktaki genlerin saptanmasını azaltabilir. Araştırma grubunun önceki bir çalışmasında uygulanan, düşük kaliteli noktaların kaldırılması (<200 UMI ve <150 saptanan gen), dekonvolüsyon analizleri sırasında düşük katkılı hücre tiplerinin filtrelenmesi (nokta başına <%20) ve mekansal transkriptomik veri setlerinde saptanan marker genlerin seçimi gibi kalite kontrol ve filtreleme stratejilerinde olduğu gibi, immünoglobulin transkriptleri de uygun olduğunda etkilerini minimize etmek için analizlerin alt aşamalarında hesaplamalı olarak filtrelenebilir8. Hedefli mekansal transkriptomik yaklaşımları, belirli uygulamalarda düşük bolluktaki transkriptlerin saptanmasını daha da iyileştirebilir.

Bu yöntemin potansiyel uygulama alanları oldukça geniştir. Uzamsal ve tek hücreli verilerin yakın zamanda entegre edilmesi, uzmanlaşmış insan osteojenik nişlerini ve trabeküler kemikten yayılan karmaşık sinyal gradyanlarını ortaya çıkarmıştır3,26. Dahası, uzamsal transkriptomik, yaşlanmanın EC'lerin uzamsal organizasyonunu ve iletişimini değiştirerek BM mikroçevresini yeniden şekillendirdiğini, bunun da osteojenik desteğin bozulmasına ve yaşlanmış niş içerisinde inflamatuar sinyal ağlarının ortaya çıkmasına yol açtığını göstermiştir10. Multiomik profilleme ayrıca, erken miyelopoezi destekleyen arterio-endosteal bölgeler ve hematopoetik kök hücreler ile progenitör hücrelerce zenginleştirilmiş peri-adipositik zonlar gibi belirgin mikroçevresel komşuluklar tanımlamıştır3. MM bağlamında bu protokol, hastalıklı murine BM'nin bileşimini ve hücre-hücre etkileşimlerini karakterize etmek için uzamsal ve tek hücreli transkriptomik çerçevelerin entegrasyonuna olanak tanır. Önceki çalışmalar, malign PC'lerin uzamsal olarak farklı dağılımlarını ortaya çıkarmış ve tümörle zenginleşmiş bölgelerle ters ilişkili olan NETosis ve IL-17 sinyallemesi gibi immün ve inflamatuar programları tanımlamıştır. Ek olarak, malign PC yoğunluğundaki artış, efektör T hücresi durumlarından tükenmiş T hücresi durumlarına doğru bir kayma ile korelasyon göstermiştir. Bu bulgular, farklı hastalık yükleri genelindeki translasyonel ilgilerini kanıtlayacak şekilde, insan FFPE BM örneklerinde de doğrulanmıştır8. Nihayetinde, bu hazırlama iş akışı, BM'nin mineralize mimarisi içindeki karmaşık hücresel etkileşimlerin araştırılması için teknik temel sağlamaktadır.

Yüksek çözünürlüklü mekansal gen ekspresyon platformları, tek hücreye yakın çözünürlükte tüm transkriptom profillemesi sağlayabilir38,51,52. Bu yaklaşımlar, hazırlama iş akışının kullanımını, mekansal olarak organize edilmiş kemik iliği ve hematolojik malignitelerin daha yüksek çözünürlüklü analizlerine genişletebilir. Bu nedenle iş akışı, fizyolojik ve malign hematopoezin gelecekteki çalışmaları için teknik bir temel oluşturmaktadır.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir. MM'nin MIcγ1 fare modellerinin teknik bilgisi (know-how) ve deneysel kullanımı üzerine olan bir patent, MIMO Biosciences'a lisanslanmıştır (başvuru no. PCT/EP2023/071025).

Teşekkürler

Bu çalışma Instituto de Salud Carlos III tarafından desteklenmiş ve ERDF A way of making Europe (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) ve RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011; Departamento de Salud Gobierno de Navarra (GN2024/04); Cancer Research UK [C355/A26819]; Accelerator Ödül Programı kapsamında FC AECC ve AIRC tarafından ortak finanse edilmiştir; FP'ye The International Myeloma Foundation (Brian van Novis) ve The Paula and Rodger Riney Foundation tarafından destek sağlanmıştır. IAC, Avrupa Komisyonu'ndan bir Marie Curie hibe desteği (H2020- MSCA-IF-837491), AECC Talent hibesi (INVES258003CALV) ve Departamento de Salud, Gobierno de Navarra (GN2023/03) tarafından desteklenmiştir. MC, Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades'den bir FPU bursu (FPU22/03283) ile desteklenmiştir. Değerli teknik ve entelektüel yardımları için CIMA Universidad de Navarra bünyesindeki Advanced Genomics Laboratory ve Animal Facility personeline teşekkür ederiz. Ayrıca, BM örneklerini sağladıkları ve üstün iş birlikleri için Clínica Universidad de Navarra (CUN) ve Hospital Universitario de Navarra'nın Patoloji Departmanlarına teşekkür ederiz. MM fare modelleri için José Ángel Martínez-Climent ve Marta Larrayoz'a özel teşekkürlerimizi sunarız. Uzamsal transkriptomik için fare ve insan BM örneklerinin işlenmesinde teknoloji optimizasyonu, protokol geliştirme ve sorun giderme konusundaki mükemmel destekleri için Patxi San Martín-Uriz, Tania López ve Eduardo Larequi'ye teşekkür ederiz. Ayrıca, uzamsal transkriptomik üzerine yaptıkları tüm hesaplamalı çalışmalar için Beñat Ariceta ve Asier Ullate'ye teşekkür ederiz. Son olarak, bu çalışmaya cömertçe katılan hastalara ve sağlıklı donörlere derin şükranlarımızı sunarız.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL tüplerEppendorf15625367
100 mL steril kap deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991ARNA bütünlük değerlendirmesi için kapiler elektroforez– tabanlı sistem
50 mL steril kap IberoMedREOR001
50 mL tüp FALCON352070
Advanced PAP PenTed Pella 22309Z377821-1EAHidrofobik bariyer kalemi 
Tavşanda üretilmiş Anti-PRRX1 antikoruSigma-AldrichHPA051084
BSA (Sığır Serum Albümini)Sigma-AldrichA9418-50G
Kasetler KartellLABWARE2921
CD271 (NGF Reseptörü) Monoklonal Antikor (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, Endotel Hücresi (Konsantre) Klon JC70AAligent DakoM0823
LamellaFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (DAPI içeren VECTASHIELD Antifade Montaj Ortamı)Vector LaboratoriesH-1200-10
Deparafinizasyon SolüsyonuQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals Fosfat tamponlu salin (DPBS, 1×), Dulbecco formülü, kalsiyumsuz, magnezyumsuz
Histoloji için DPX Montaj OrtamıSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Etilendiamintetraasetik asit, (EDTA), 0.5 M Solüsyon, Moleküler Biyoloji Derecesi, Ultrapure
Gömme istasyonu Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Emcn Antikoru (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Ensembl Referans Genomu (GRCh38 / mm10, sürüm 105)EMBL-EBIN/AOkuma hizalaması için kullanılan referans genom.
EozinMillipore SigmaHT110116
EtanolMillipore SigmaE7023-500MLCerrahi makaslar
Falc Instruments B-I Histoloji Su BanyosuFalc610.1030.00
Formalin %4 PanReac AppliChem2524311315Klinik tanı için pH = 7'ye tamponlanmış ve metanol ile stabilize edilmiş Formaldehit %3.7–4.0 w/v (CE-IVD)
Cam lam boyama rafı WHEATONZ710970-3EA
Cam boyama kavanozları BRANDBR472200-10EAMastercycler  X50
GliserolSigma-AldrichC3H803
Keçi anti-Fare IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
Keçi anti-Fare IgG (H+L) Yüksek Derecede Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Derecede Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Hematoksilin Millipore SigmaMHS16
Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTapeAgilent5067-5579RNA bütünlük değerlendirmesi
Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTape MerdiveniAgilent5067-5581RNA bütünlük değerlendirmesi
Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTape Örnek TamponuAgilent5067-5580RNA bütünlük değerlendirmesi
Yüksek çözünürlüklü mikroskop Leica BiosystemsN/AAperio CS2 Tarayıcı
Hidroklorik asit (0.1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
Illumina NextSeq 2000 platformuIllumina20038897
Invitroge Keçi anti-Sıçan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
Iris Makasları - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009İzofluran
Lityum karbonat Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/AHE görüntülerini görselleştirmek ve Visium noktalarını düzenlemek için kullanılan yazılım; analiz hattı tarafından oluşturulan .cloupe dosyalarını açar.
Metal gömme kalıplarıBio-Optica07-BM24256
Mikroskop Lamlarıavantor631-0108Superfrost Plus Mikroskop Lamları
Mikrotom bıçaklarıFEATHERFEAT207500006_U
Mikrotom HM 340EEprediaN/AHM 340E modeli
İğneBD301156BD Microlanc 3 İğne 21 G 1 IN (25 MM)
Nikon Optiphot-2Nikon71052Brightfield ışık mikroskobu
Parafin PanReac AppliChem256993Klinik tanı için plastikleştirilmiş Parafin M.P. 55–58°C + DMSO peletleri (CE-IVD)
Petri kabı CorningCLS430167-100EA
Plastik gömme kalıpları Bio-Optica07-MP7070
Potts-Smith PensleriF.S.T 11012-18Pensler
Qubit 3.0 FlorometreInvotrogen Q33216
Qubit Analiz TüpleriInvotrogen Q32856
Qubit RNA HS Analiz KitiInvotrogen Q32855
RNaz içermeyen 1.5 mL mikro santrifüj tüpüThermo Scientific AM12400
RNaz içermeyen su MerkW4502
RNaseZap RnaseInvotrogen AM9780Dekontaminasyon Solüsyonu
RNeasy FFPE Kiti (50)Qiagen73504Toplam RNA ekstraksiyonu
SCTransform (v0.3.5)Satija LabN/ASeurat'ta uygulanan varyans sabitleyici normalizasyon yöntemi.
Seurat (v4.3.0.1) Satija LabN/ATek hücre ve uzamsal transkriptomik analizi için kullanılan R paketi.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/AVisium veri setleri için demultipleksleme, hizalama ve özellik-barkod matrislerinin oluşturulmasında kullanılan yazılım.
Stlime Neşter Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Bergen LabN/AUzamsal transkriptomik görselleştirme ve entegrasyonu için kullanılan R paketi.
Cerrahi Neşter Bıçağı No.23Swann-Morton210Cerrahi neşter bıçakları
Termal döngüleyici Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455IF görselleştirme için multispektral görüntüleme platformu
Visium Aksesuar Kiti 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Visium İnsan Transkriptom Prob Kiti Küçük 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Visium Fare Transkriptom Prob Kiti Küçük 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Visium Uzamsal Gen Ekspresyon Lam Kiti 4 rxn 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
KsilenPanreac214736Ksilen, analiz için izomer karışımı, ACS, ISO

Kaynaklar

  1. Cooper RA, et al. Spatial transcriptomic approaches for characterising the bone marrow landscape: pitfalls and potential. Leukemia. 2025;39(2):291-295.
  2. Mercier FE, Ragu C, Scadden DT. The bone marrow at the crossroads of blood and immunity. Nat Rev Immunol. 2012;12(1):49-60.
  3. Bandyopadhyay S, et al. Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging. Cell. 2024;187(12):3120-3140.e29.
  4. Tikhonova AN, et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 2019;569(7755):222-228.
  5. Baccin C, et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 2020;22(1):38-48.
  6. Kunisaki Y, et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 2013;502(7473):637-643.
  7. Kusumbe AP, Ramasamy SK, Adams RH. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 2014;507(7492):323-328.
  8. Muiños-Lopez E, et al. Characterization of the bone marrow architecture of multiple myeloma using spatial transcriptomics. Commun Biol. 2025;8(1):1620.
  9. Gui G, et al. Single-cell spatial transcriptomics reveals immunotherapy-driven bone marrow niche remodeling in AML. Sci Adv. 2025;11(28):eadw4871.
  10. Cenzano I, et al. Single-cell profiling reveals RAB13+ endothelial cells and profibrotic mesenchymal cells in aged human bone marrow. Aging Cell. 2026;25(4):e70475.
  11. de Jong MME, et al. The multiple myeloma microenvironment is defined by an inflammatory stromal cell landscape. Nat Immunol. 2021;22(6):769-780.
  12. de Jong MME, et al. An IL-1β-driven neutrophil–stromal cell axis fosters a BAFF-rich protumor microenvironment in individuals with multiple myeloma. Nat Immunol. 2024;25(5):820-833.
  13. Cenzano I, et al. Stromal and endothelial transcriptional changes during progression from MGUS to myeloma and after treatment response. Nat Commun. 2026;17:74389.
  14. Ye J, et al. Deconvolution of the hematopoietic stem cell microenvironment reveals a high degree of specialization and conservation. iScience. 2022;25(5):104225.
  15. Chen L, et al. An inflammatory T-cell-stromal axis contributes to hematopoietic stem/progenitor cell failure and clonal evolution in human myelodysplastic syndrome. Nat Commun. 2025;16(1):10041.
  16. Prummel KD, et al. Inflammatory stromal and T cells mediate human bone marrow niche remodeling in clonal hematopoiesis and myelodysplasia. Nat Commun. 2025;16(1):10042.
  17. De Jonghe J, et al. scTrends: A living review of commercial single-cell and spatial 'omic technologies. Cell Genom. 2024;4(12):100723.
  18. van den Brink SC, et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017;14(10):935-936.
  19. Asp M, Bergenstråhle J, Lundeberg J. Spatially resolved transcriptomes—next generation tools for tissue exploration. Bioessays. 2020;42(10):1900221.
  20. Miao J, et al. A practical protocol of processing mineralized tissue for Visium spatial transcriptomics. Mechanobiol Med. 2025;3(4):100163.
  21. Baldwin M, et al. A roadmap for delivering a human musculoskeletal cell atlas. Nat Rev Rheumatol. 2023;19(11):738-752.
  22. Duan H, Cheng T, Cheng H. Spatially resolved transcriptomics: advances and applications. Blood Sci. 2023;5(1):1-12.
  23. Xiao X, et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 2023;11(1):59.
  24. Jain S, Eadon MT. Spatial transcriptomics in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2024;20(10):659-671.
  25. Tilburg J, et al. Spatial transcriptomics of murine bone marrow megakaryocytes at single-cell resolution. Res Pract Thromb Haemost. 2023;7(4):100158.
  26. Lin W, et al. Mapping the spatial atlas of the human bone tissue integrating spatial and single-cell transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2025;53(2):gkae1298.
  27. Marx V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 2021;18(1):9-14.
  28. Yue L, et al. A guidebook of spatial transcriptomic technologies, data resources and analysis approaches. Comput Struct Biotechnol J. 2023;21:940-955.
  29. Joglekar A, et al. A spatially resolved brain region- and cell type-specific isoform atlas of the postnatal mouse brain. Nat Commun. 2021;12(1):463.
  30. Madissoon E, et al. A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche. Nat Genet. 2023;55(1):66-77.
  31. Wang F, et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023;9(24):eadf5464.
  32. Robinson MH, et al. Regulation of antigen-specific T cell infiltration and spatial architecture in multiple myeloma and premalignancy. J Clin Invest. 2023;133(15):e167303.
  33. Wehrle E, et al. Protocol for preparing formalin-fixed paraffin-embedded musculoskeletal tissue samples from mice for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 2024;5(2):103089.
  34. Sangeetha R, Uma K, Chandavarkar V. Comparison of routine decalcification methods with microwave decalcification of bone and teeth. J Oral Maxillofac Pathol. 2013;17(3):386-391.
  35. Yip RKH, et al. Profiling the spatial architecture of multiple myeloma in human bone marrow trephine biopsy specimens with spatial transcriptomics. Blood. 2025;146(15):1837-1849.
  36. Miquelestorena-Standley E, et al. Effect of decalcification protocols on immunohistochemistry and molecular analyses of bone samples. Mod Pathol. 2020;33(8):1505-1517.
  37. Ambrosi TH, et al. Human skeletal development and regeneration are shaped by functional diversity of stem cells across skeletal sites. Cell Stem Cell. 2025;32(5):811-823.e11.
  38. 10x Genomics. Visium Spatial Platform. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/platforms/visium#assays
  39. Amemiya K, et al. Influence of formalin fixation duration on RNA quality and quantity from formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissues. Pathol Int. 2023;73(12):593-600.
  40. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002;161(6):1961-1971.
  41. Nam SK, et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 2014;48(1):36-42.
  42. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000407, Revision E. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-ffpe/documentation/steps/library-construction/visium-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe-user-guide
  43. Eccher A, et al. Pathology laboratory archives: conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 2024;14(4):333.
  44. Bai Z, et al. Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Cell. 2024;187(23):6760-6779.e24.
  45. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression for FFPE—Tissue Preparation Guide. Document CG000518, Revision D. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/tissue-prep/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-for-ffpe-tissue-preparation-guide
  46. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000495, Revision G. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026. Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/library-construction/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe
  47. Agilent Technologies. High Sensitivity RNA ScreenTape assay for TapeStation systems quick guide. Version A.01.05. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/HS-RNA_QuickGuide.pdf
  48. Agilent Technologies. Agilent 4200 TapeStation system—System manual. Publication G2991-90000, Version A.02.02. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://download.chem.agilent.com/software/4200_tapestation_user_info_package_v2/tapestation%20user%20information/tapestation%20manuals/agilent%204200%20tapestation%20system%20manual_g2991-90000.pdf
  49. Larrayoz M, et al. Preclinical models for prediction of immunotherapy outcomes and immune evasion mechanisms in genetically heterogeneous multiple myeloma. Nat Med. 2023;29(3):632-645.
  50. Wang S. Resolving the bone – optimizing decalcification in spatial transcriptomics and molecular pathology. J Histotechnol. 2025;48(1):68-77.
  51. Oliveira MF, et al. High-definition spatial transcriptomic profiling of immune cell populations in colorectal cancer. Nat Genet. 2025;57(6):1512-1523.
  52. Bourgain-Chang E, Kuang X, Cang Z, Nie Q. Reconstructing single-cell resolution from spatial transcriptomics with CellRefiner. Nat Commun. 2026;17(1):3304.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

FFPE ÖrneklerEDTA DekalsifikasyonuDoku Kesit almaRNA BütünlüğüHücre Tipi TanımlamaDoku MorfolojisiGen Ekspresyon AnaliziTek Hücre Entegrasyonu

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.