Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Ruscogenin, KDM1A'yı Downregüle Ederek Ferroptoz ve Apoptozu Birlikte İndükleyerek Nazofaringeal Karsinom Progresyonunu Baskılar

60 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72523

⸱

3 Eylül 2026

1School of Stomatology and Optometry, Hubei University of Science and Technology

Bu makalede

Özet

Bu protokol, ruscogeninin nazofaringeal karsinom hücrelerindeki antitümör etkinliğini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu bileşiğin, KDM1A genini hedefleyip aşağı düzenleyerek nasıl çift yönlü hücre ölümünü tetiklediğini sistematik olarak açıklamak için canlılık, migrasyon, apoptoz ve ferroptoz analizlerini içeren kapsamlı metodolojileri detaylandırmaktadır.

Özet

Nazofaringeal karsinom (NPC), oldukça agresif bir malignitedir. Doğal bileşik ruscogenin (Rus), anti-kanser potansiyeli göstermektedir. Bu çalışma, NPC hücreleri üzerindeki etkilerini ve temel moleküler yolakları inceleyerek, nazofaringeal karsinomdaki (NPC) spesifik etki mekanizmasını aydınlatmaktadır. İnsan nazofaringeal karsinom (NPC) hücre hattı C666-1, çeşitli Rus konsantrasyonları ilelele tedavi edilmiştir. Hücre canlılığı, proliferasyon, migrasyon, invazyon, apoptoz ve ferroptozun değerlendirilmesi için bir dizi in vitro analiz gerçekleştirilmiştir. Lizin-spesifik demetilaz 1A'nın (KDM1A) rolü Western blot ve moleküler kenetleme (molecular docking) kullanılarak araştırılmış ve aracı rolü aşırı ekspresyon kurtarma deneyleri ile doğrulanmıştır. Ruscogenin, C666-1 hücrelerinin proliferatif, klonojenik, migratif ve invaziv kapasitelerini doz bağımlı olarak azaltmıştır. Mekanistik olarak Rus tedavisi; yürütücü kaspaz-3 aktivasyonu ve Bax/Bcl-2 dengesi üzerinden pro-apoptotik sinyalleşmeye kayış ile kanıtlanan apoptozun yanı sıra, artmış lipid peroksidasyonu ve hücre içi demir ile karakterize edilen ferroptozu da indüklemiştir. Bu anti-tümör etkiler, KDM1A'nın downregülasyonu ile güçlü bir korelasyon göstermiştir. Kritik olarak, KDM1A'nın zorunlu aşırı ekspresyonu, Rus tarafından indüklenen apoptoz ve ferroptozu önemli ölçüde hafifletmiş ve malign fenotiplerin baskılanmasını geri çevirerek KDM1A'nın kritik aracı rolünü doğrulamıştır. Ruscogenin, KDM1A'yı downregüle ederek nazofaringeal karsinomun malign progresyonunu inhibe etmekte, böylece apoptoz ve ferroptozu teşvik etmektedir. Bu bulgular, Rus-KDM1A aksının NPC tedavisi için gelecek vaat eden bir terapötik hedef olduğunu ortaya koymaktadır.

Giriş

Nazofaringeal karsinom (NPC), genetik ve çevresel faktörlerin etkileşimi sonucu ortaya çıkan bir kanser türüdür1. Radyoterapi tedavi sürecinde dikkat çekici ilerlemeler sağlamış olsa da, NPC hastalarının genel sağkalım oranları halen yetersizdir. Bu durum muhtemelen, NPC hücrelerinin hızla çoğalabilmesinden ve bölgesel lenf düğümlerine ile uzak organlara metastaz yapmaya oldukça meyilli olmasından kaynaklanmaktadır2. Bu nedenle, NPC'nin ilerlemesini teşvik eden moleküler mekanizmaların araştırılması temel bir gerekliliktir. Son zamanlarda, Fe2⁺ ve lipid peroksitleri tarafından demire bağımlı bir şekilde düzenlenen yeni bir hücre ölümü modalitesi olan ferroptozisin, NPC'de kritik bir rol oynadığı saptanmıştır3. Mevcut kanıtlar, ferroptozisin NPC'de önemli bir rol oynadığını ve indüklenmesinin kanser radyoterapisini güçlendirebileceğini göstermiştir4,5.

Minimal toksisite ve daha az yan etki nedeniyle, Çin bitkisel formülleri binlerce yıldır kanser tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır6,7. Çok bileşenli, çok hedefli ve sinerjik etkili bir ilaç türü olan geleneksel Çin tıbbı (TCM) reçeteleri, NPC dahil olmak üzere kanserin önlenmesinde ve tedavisinde etkili bir tamamlayıcı terapi olarak kullanılmıştır8,9,10. Çok yıllık otsu bir bitki olan Ophiopogon japonicus'in kökü olan Radix ophiopogonis'in (RO), yardımcı bir tedavi olarak NPC'yi etkili bir şekilde hafiflettiği bildirilmiştir11,12. RO'nun ana bileşeni olan Ruscogenin'in (Rus), güçlü anti-kanser etkilerine sahip olduğu bildirilmiştir13. Kolorektal kanser fare modellerinde Rus, sıkı bağlantı (tight junction) hasarını iyileştirebilir ve tümör migrasyonunu inhibe edebilir14. Önemli olan şu ki, Rus aynı zamanda ferroptozu indükleyerek pankreas kanseri hücrelerinin canlılığını azaltabilir. Ancak, Rus'un NPC üzerindeki etkisi hala belirsizdir.

Epigenetik, kanser patogenezi için temel araştırma alanıdır ve çok sayıda etkili tedavi yöntemi sunar15. İyi çalışılmış epigenetik modifikasyonlardan biri olan histon metilasyonu, kanserin gelişiminde rol oynar ve aynı zamanda ilaç tasarımı için önemli bir hedeftir16. Histon metilasyonunun dinamik modülasyonu, metiltransferazlar ve demetilazlar aracılığıyla gerçekleşir17. KDM1A, epigenetik modülasyondaki rolü nedeniyle karsinogeneze kritik düzeyde dahil olduğu belirlenmiş bir histon lizin demetilazıdır18. Ayrıca KDM1A'nın, akciğer ve pankreas kanseri gibi birçok kanser türünde yüksek ekspresyona sahip bir onkoprotein olduğu saptanmıştır19. Guo ve ark., KDM1A artışının fosfataz ve tensin homolog (PTEN) ekspresyonunu baskılayabildiğini, apoptozu inhibe ederken NPC hücre proliferasyonu ve migrasyonunu artırabildiğini bildirmişlerdir20. Bu arada, KDM1A'nın yukarı regülasyonunun akciğer kanserinde ferroptozu baskılayabileceği de bulunmuştur21. Super-PRED veri tabanı analizi, KDM1A'nın Rus için potansiyel bir hedef olduğunu göstermiştir.

Rus'un diğer kanserlerdeki kabul görmüş anti-tümör potansiyeline rağmen, nazofaringeal karsinomdaki spesifik rolü ve moleküler mekanizmaları henüz tamamen belirlenmemiştir ve bu durum önemli bir araştırma boşluğu teşkil etmektedir. Ayrıca, önceki raporlar KDM1A'yı tümör proliferasyonu ve ferroptoz direncine ayrı ayrı bağlamış olsa da, KDM1A'yı hedeflemenin NPC'de aynı anda birden fazla hücre ölümü yolunu tetikleyip tetikleyemeyeceğini henüz hiçbir çalışma araştırmamıştır. Bu nedenle, bu çalışma, Rus'un KDM1A'yı doğrudan downregüle ederek NPC hücrelerinin malign progresyonunu baskılayabileceği hipotezi için güçlü bir temel oluşturmaktadır.

Bu çalışma, Rus'un NPC hücrelerinin proliferasyonu, migrasyonu ve invazyonu üzerindeki etkisini sistematik olarak değerlendirerek bu boşluğu gidermeyi amaçlamıştır. Bu araştırmanın temel özgünlüğü, çift mekanizmalı bir stratejinin ortaya çıkarılmasında yatmaktadır. Odak noktası, Rus'un hem klasik apoptozu hem de demire bağımlı ferroptozu eş zamanlı olarak indükleme kapasitesi olmuştur. Yeni Rus-KDM1A sinyal eksenini doğrulayan bu çalışma, tek bir doğal bileşiğin eş zamanlı çoklu yol blokajı yoluyla tümör direncini nasıl aşabileceğini göstererek mevcut bilgileri önemli ölçüde ilerletmekte ve hedefe yönelik NPC tedavisi için gelecek vadeden bir preklinik temel sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hücre kültürü, tedavi ve transfeksiyon

İnsan nazofaringeal karsinom (NPC) hücre hattı C666-1 (RRID: CVCL_M597) ve malign olmayan insan nazofaringeal epitel hücre hattı NP69 (RRID: CVCL_F755), ticari bir tedarikçiden satın alınmıştır. Her iki hücre hattı da Kısa Tandem Tekrar (STR) profillemesi ile kimliklendirildi ve kullanım öncesinde mikoplazma kontaminasyonu içermediği onaylandı. Rutin kültür için C666-1 hücreleri, %10 fetal bovin serum (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamında çoğaltıldı. NP69 hücreleri, %10 FBS, 10 ng/mL rekombinant epidermal büyüme faktörü ve %1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş keratinosit serumsuz ortamda kültüre edildi. Ruscogenin (Rus; saflık ≥ 98%), ticari bir tedarikçiden satın alındı. Her iki hücre hattı da nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37 °C'de ve %5 CO₂ altında muhafaza edildi. Uygulamalar için hücreler, farklı konsantrasyonlarda (10, 20, 50 µM) Ruscogenin'e (Rus) 24 sa boyunca maruz bırakıldı22. Transfeksiyon için, ticari bir tedarikçiden temin edilen, aşırı ekspresyon için lizin-spesifik demetilaz 1A kodlayan plazmidler (oe-KDM1A) ve buna karşılık gelen negatif kontrol boş vektör (oe-NC), hücre konfluenslemesi %70–80'e ulaştığında C666-1 hücrelerine transfekte edildi. Spesifik olarak, 2,5 µg plazmid DNA ve 5 µL lipid tabanlı transfeksiyon reaktifi, her biri 150 µL düşük serumlu ortamda seyreltildi, nazikçe karıştırıldı, oda sıcaklığında 20 dk inkübe edildi ve ardından üretici protokolüne uygun olarak 6 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna eklendi. Hücreler 37 °C'de 48 sa boyunca inkübe edildi ve ardından transfeksiyon etkinliği doğrulandı.

Hücre sayım kiti-8 (CCK-8) analizi

Rus tedavisi sonrası hücre canlılığı, CCK-8 testi kullanılarak belirlenmiştir. Bu işlem için hücreler önce 96 kuyucuklu plakalara ekilmiş ve gece boyunca kültüre edilmişlerdir. Test, 10 µL CCK-8 çözeltisi eklenerek başlatılmış ve 2 saatlik inkübasyonun ardından, oluşan kolorimetrik değişim bir plaka okuyucu kullanılarak 450 nm'de optik yoğunluk (OD) olarak ölçülmüştür.

Koloni oluşum deneyi

Klonojenik sağkalımı değerlendirmek için, C666-1 hücreleri 6 kuyucuklu plakalara ekilmiş ve 14 gün boyunca kültüre edilmiştir. İnkübasyon süresinin ardından, oluşan koloniler %100 metanol ile 10 dk boyunca fikse edilmiş, ardından %0,5 kristal viyole ile 30 dk boyunca görselleştirilmiştir. Boyanan kolonilerin sayısı daha sonra mikroskobik görüntüleme ve sayım yoluyla nicelendirilmiştir.

Western blot

Western blot analizi için, hücrelerden önce RIPA tamponu ile toplam protein ekstraksiyonu yapılmış ve elde edilen lizatlar, süpernatantı toplamak amacıyla santrifüj edilmiştir (12,000 × g). Protein seviyelerini belirlemek için BCA testi kullanılmıştır. Eşit miktarda toplam protein (hat başına 30 µg) yüklenmiş ve %10 sodyum dodekil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrıştırılmıştır. Ayrıştırmanın ardından proteinler, buz üzerinde 100 V sabit voltajda 90 dakika boyunca poliviniliden florür (PVDF) membranlara aktarılmıştır. Membranlar daha sonra, %0,1 Tween 20 içeren tris-tamponlu salinde (TBST) hazırlanmış %5 sığır serum albümini (BSA) ile oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloke edilmiştir. Membranlar sonrasında, bloklama tamponu ile seyreltilmiş (tamamı 1:1000 oranında) şu primer antikorlar ile 4°C'de gece boyunca inkübe edilmiştir: Ki67, PCNA, MMP2, MMP9, Bcl-2, Bax, KDM1A, SLC7A11, GPX4, ACSL4, TFR1 ve β-actin. Son olarak, HRP-konjuge sekonder antikorlar ile 2 saatlik inkübasyonun ardından, immünoreaktif bantlar gelişmiş kemilüminesans (ECL) deteksiyon reaktifi kullanılarak görselleştirilmiş ve Görüntü analiz yazılımı ile densitometrik analiz gerçekleştirilmiştir.

Yara çizme deneyi

Yara iyileşmesi deneyi için, C666-1 hücreleri 6 kuyucuklu plaklarda %80 konfluense ulaşana kadar kültüre edildi. 200 µL pipet ucuyla sıyırma işlemi yapılarak tek tabakaya düzenli bir yara oluşturuldu. Ayrılan hücreler PBS ile yıkanarak uzaklaştırıldı ve ardından kültür ortamı, 24 saatlik inkübasyon için serumsuz ortam ile değiştirildi. Hücre göçünü değerlendirmek amacıyla, ışık mikroskobu kullanılarak yara bölgesinin 0. ve 24. saatlerdeki görüntüleri yakalandı.

Transwell analizi

Hücre invazyonu, 50 µL bazal membran matrisi ile önceden kaplanmış transwell odacıkları (8-µm gözenek boyutu) kullanılarak değerlendirildi. C666-1 hücrelerinin invazyon kapasitesi Transwell odacıkları kullanılarak belirlendi. Üst insertlere serumdan yoksun ortamda süspanse edilmiş hücreler ekilirken, alt kuyucuklar %10 FBS içeren DMEM ile dolduruldu. 24 saatlik inkübasyonun ardından, membranın apikal tarafında kalan hücreler dikkatle uzaklaştırıldı. Nicelleştirme için bazolateral yüzeydeki hücreler metanolle fikse edildi, %0,1 kristal viyole ile boyandı ve ışık mikroskobu ile elde edilen görüntüler üzerinden sayıldı.

Akış sitometrisi

Apoptoz, akış sitometrisi kullanılarak kantifiye edildi. Numuneleri hazırlamak için C666-1 hücreleri toplandı, buz gibi PBS ile durulandı ve ardından 100 µL bağlanma tamponu içinde yeniden süspanse edildi. Hücreler daha sonra Annexin-V-FITC (20 µg/mL) ve propidyum iyodür (PI) ile birlikte boyandı. Bu boyama işlemi, ışıktan korunarak buz üzerinde 15 dk boyunca gerçekleştirildi. Apoptoz hücrelerin yüzdesini belirlemek için veriler derhal bir akış sitometresinde elde edildi.

Kaspaz-3 aktivitesinin tespiti

Caspase-3 aktivitesi, üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari bir analiz kiti kullanılarak ölçüldü. Kısaca, C666-1 hücreleri lizlendi ve 14,000 × g santrifügasyon sonrası süpernatanlar toplandı. Sağlanan reaktif ile 2 saatlik inkübasyonun ardından, her bir süpernatanın absorbansı 405 nm'de belirlendi.

RT-qPCR

Toplam RNA, ticari bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanılarak C666-1 hücrelerinden saflaştırıldı. Elde edilen RNA, üreticinin protokolüne uygun olarak ticari bir kit kullanılarak ilk zincir cDNA'ya ters transkripsiyonla dönüştürüldü. Gen ekspresyon analizi, ardından SYBR Green tabanlı bir master mix ile gerçek zamanlı PCR sisteminde kantitatif PCR (qPCR) ile gerçekleştirildi. Göreceli transkript seviyelerini belirlemek için karşılaştırmalı Ct (2⁻△△Ct) yöntemi kullanıldı. Amplifikasyon için kullanılan primer dizileri şunlardı: β-actin (İleri: 5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'; Geri: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3') ve KDM1A (İleri: 5'-TGACCGGATGACTTCTCAAGA-3'; Geri: 5'-GTTGGAGAGTAGCCTC AAATGTC-3').

Tiyobarbitürik asit reaktif maddeler (TBARS) analizi

Lipid peroksidasyonunu ölçmek için, C666-1 hücrelerinden önce çöktürme (%15 TCA, 500 mM BHA) ve 10.000 × g hızında 10 dk santrifügasyon ile süpernatantlar hazırlandı. Bu süpernatantlar daha sonra %0,375 tiyobarbitürik asit ile reaksiyona sokuldu ve MDA-TBA adüktünü oluşturmak için 100 °C'de 10 dk ısıtıldı. Lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olan bu adüktün seviyesi, bir mikroplaka okuyucuda 532 nm'deki absorbans ölçülerek belirlendi23.

Lipid reaktif oksijen türlerinin (ROS) tespiti

Lipid peroksidasyonu, bir lipid peroksidasyonu floresan probu kullanılarak tespit edildi. C666-1 hücreleri 6 kuyucuklu plakalara ekildi, gece boyunca kültüre edildi ve ardından floresan proba (2 µM) maruz bırakıldı. Bu prob, oksidasyon gerçekleştiğinde kırmızıdan yeşile bir floresans kayması gösterir. Yeşil/kırmızı floresans oranı, bir lazer taramalı konfokal mikroskop ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edildi. Grafiğe dökülen yeşil/kırmızı floresans oranı net bir şekilde tanımlandı ve lipid peroksidasyon seviyelerinin kantitatif göstergesi olarak kullanıldı24.

Fe2+ Tespiti

Hücre içi ferroz demir (Fe2⁺) seviyesi, bir hücre içi demir floresan probu kullanılarak ölçüldü. C666-1 hücreleri, 10 µM floresan prob ile 10 dk boyunca inkübe edildi. Fazla probu uzaklaştırmak için PBS ile yıkandıktan sonra hücreler floresan mikroskobu ile analiz edildi.

Moleküler kenetlenme analizi

Moleküler kenetlenme, bağlanma modlarının değerlendirilmesi yoluyla bir ligand ile hedef proteini arasındaki etkileşimi ve bağlanma afinitesini öngörerek yeni ilaç tasarımını kolaylaştıran kritik bir hesaplamalı yöntemdir25. RCSB PDB web sayfasından (https://www.rcsb.org/), KDM1A'nın 3B yapısı (PDB ID: 6NQU) elde edilmiştir. KDM1A protein yapısının hazırlanması için su ve ilgisiz küçük ligandlar kaldırılmıştır. Moleküler kenetlenme simülasyonu, Lamarckçı Genetik Algoritma kullanılarak moleküler kenetlenme yazılımı aracılığıyla gerçekleştirilmiş ve görselleştirme ise moleküler görselleştirme yazılımı kullanılarak yapılmıştır26.

İstatistiksel analiz

Tüm deneyler en az üç bağımsız biyolojik replika kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve sonuçlar ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. İstatistiki analizler, istatistik analiz yazılımı kullanılarak yapılmıştır. Birden fazla grup arasındaki farklar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma post-hoc testi ile değerlendirilmiştir. P-değerinin 0,05'ten küçük olması, istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğunu göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ruscogenin, nazofaringeal karsinom hücrelerinin canlılığını ve proliferasyonunu seçici olarak inhibe eder

Çalışmada ilk olarak ruscogenin'in (Rus), hem normal nazofaringeal epitel hücrelerinin (NP69) hem de nazofaringeal karsinom (NPC) hücrelerinin (C666-1) canlılığı üzerindeki etkisi araştırılmıştır. CCK-8 analizi ile belirlendiği üzere, 10, 20 ve 50 µM konsantrasyonlardaki Rus uygulaması, normal NP69 hücrelerine karşı anlamlı bir toksisite göstermemiştir. Buna karşılık, Rusc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Nazofaringeal karsinom (NPC), yüksek metastaz prevalansına sahip ciddi bir malignitedir ve bu durum, neden daha iyi müdahalelere acilen ihtiyaç duyulduğunu açıklamaktadır27. Burada, Radix ophiopogonis türevi olan doğal bir ürün olan Ruskogenin'in (Rus), NPC hücreleri üzerinde güçlü anti-tümör etkileri olduğu gösterilmektedir. Ayrıca Rus'un, histon demetilaz KDM1A'yı baskılayarak NPC ilerlemesini önlediği ve bunun sonucunda apoptoz ve ferroptoz olmak üzere iki farklı programlı hücre ölümü ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, herhangi bir rakip finansal çıkar beyan etmemektedir. Yazarlar; çalışmanın kurgulanması, veri toplanması, veri analizi veya şekil oluşturma süreçlerinde herhangi bir üretici yapay zeka aracı kullanılmadığını beyan ederler. Yapay zeka destekli teknolojiler, yalnızca bu taslağın yazımı sırasında küçük dil düzenlemeleri ve dil bilgisi düzeltmeleri için kullanılmıştır. Yazarlar, yayınlanan çalışmanın içeriği ve dürüstlüğü konusunda tüm sorumluluğu üstlenmektedir.

Teşekkürler

Uygulanamaz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
7500 Fast Gerçek Zamanlı PCR SistemiApplied Biosystems4351106RT-qPCR analizi
Annexin-V-FITC/PI Apoptotik KitBD Biosciences556547Akış sitometrisi ile apoptoz tespiti
Anti-ACSL4 antikoruAbcamab155282Western blot için primer antikor
Anti-Bax antikoruCell Signaling Technology (CST)5023Western blot için primer antikor
Anti-Bcl-2 antikoruCell Signaling Technology (CST)15071Western blot için primer antikor
Antikorlar
Anti-GPX4 antikoruAbcamab125066Western blot için primer antikor
Anti-KDM1A (LSD1) antikoruCell Signaling Technology (CST)2139Western blot için primer antikor
Anti-Ki67 antikoruAbcamab16667Western blot için primer antikor
Anti-MMP2 antikoruAbcamab92536Western blot için primer antikor
Anti-MMP9 antikoruAbcamab76003Western blot için primer antikor
Anti-PCNA antikoruCell Signaling Technology (CST)13110Western blot için primer antikor
HRP-bağlı anti-tavşan IgGCell Signaling Technology (CST)7074Sekonder antikor
Anti-SLC7A11 (xCT) antikoruAbcamab175186Western blot için primer antikor
Anti-TfR1 antikoruAbcamab84036Western blot için primer antikor
Anti-β-aktin antikoruCell Signaling Technology (CST)4970Yükleme kontrolü primer antikoru
Analiz Kitleri
Autodock 4.2Scripps Research InstituteLütfen çevrilecek kaynak metni sağlayın.Moleküler kenetlenme simülasyonu
BCA protein analiz kitiBeyotime BiotechnologyP0012Protein miktarı tayini
BODIPY 581/591 C11 probuInvitrogen (Thermo Fisher Scientific)D3861Lipid ROS tespiti (2 μM)
C666-1 hücre hattıiCell Bioscience Inc.iCell-h378İnsan nazofaringeal karsinom hücre hattı
Kaspaz-3 aktivite analiz kitiBeyotime BiotechnologyC1115Apoptoz değerlendirmesi
CCK-8 analiz kitiDojindo Molecular TechnologiesCK04Hücre canlılığı ölçümü
Kimyasallar & Reaktifler
CytoFLEX akış sitometresiBeckman CoulterCytoFLEXApoptoz analizi
ECL deteksiyon reaktifiMilliporeSigmaWBKLS0500Western blot görselleştirme (Immobilon)
Ekipman
Fetal Bovin Serum (FBS)Gibco (Thermo Fisher Scientific)10099141Hücre kültürü takviyesi
GraphPad Prism 8.0GraphPad YazılımıLütfen çevirmemi istediğiniz kaynak metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, JoVE standartlarına ve belirttiğiniz akademik kriterlere uygun olarak çeviriyi gerçekleştireceğim.İstatistiksel analiz ve grafikleştirme
ImageJ yazılımıNIHMetin sağlanmamıştır. Lütfen çevirmemi istediğiniz İngilizce kaynağı iletiniz.Görüntü densitometrik analizi
Keratinosit serumsuz besiyeriiCell Bioscience Inc.iCell-019NP69 hücre kültürü için
Lazer taramalı konfokal mikroskopCarl ZeissLSM 880BODIPY C11 floresan görüntüleme
Işık / Floresan mikroskobuOlympusIX73Yara çizme, Transwell & Fe2+ görüntüleme
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche Diagnostics4887352001Kantitatif gerçek zamanlı PCR
Lipofectamine 2000 reaktifiInvitrogen (Thermo Fisher Scientific)11668019Hücre transfeksiyon reaktifi
MatrigelCorning356234İnvazyon deneyi için bazal membran matrisi
Mikroplaka okuyucuMolecular DevicesSpectraMax M5Absorbans ölçümü (405, 450, 532 nm)
NP69 hücre hattıiCell Bioscience Inc.iCell-h431Normal insan nazofaringeal epitel hücre hattı
oe-KDM1A & oe-NC plazmitleriShanghai GenePharma Co., Ltd.Özel SentezKDM1A aşırı ekspresyonu için plazmidler
Phen Green SK (PGSK) probuInvitrogen (Thermo Fisher Scientific)P14312Hücre içi Fe2+ tespiti (10 μM)
Pymol 3.0SchrödingerLütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın.Moleküler kenetlenme görselleştirmesi
Ters transkripsiyon kitiRoche Diagnostics4379012001Transcriptor Birinci Zincir cDNA Sentez Kiti
RIPA lizis tamponuSolarbio (Pekin, Çin)R0010Toplam protein ekstraksiyonu
RPMI 1640 besiyeriiCell Bioscience Inc.iCell-0002C666-1 hücre kültürü için
Ruskogenin (Rus)MedChemExpress (MCE)HY-N0193İlaç tedavisi, saflık ≥ 98%
Yazılım
TBARS analiz kitiCayman Chemical10009055Lipid peroksidasyon ölçümü
TRizol reaktifiInvitrogen (Thermo Fisher Scientific)*15596026Toplam RNA ekstraksiyonu

Kaynaklar

  1. Zhou R, Qiu L, Zhou L, Geng R, Yang S, Wu J. P4HA1 activates HMGCS1 to promote nasopharyngeal carcinoma ferroptosis resistance and progression. Cell Signal. 2023;105:110609.
  2. Cao JY, Liu L, Chen SP, Zhang X, Mi YJ, Liu ZG, et al. Prognostic significance and therapeutic implications of centromere protein F expression in human nasopharyngeal carcinoma. Mol Cancer. 2010;9:237.
  3. Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 2012;149(5):1060-72.
  4. Liu S, Zhang HL, Li J, Ye ZP, Du T, Li LC, et al. Tubastatin A potently inhibits GPX4 activity to potentiate cancer radiotherapy through boosting ferroptosis. Redox Biol. 2023;62:102677.
  5. Amos A, Jiang N, Zong D, Gu J, Zhou J, Yin L, et al. Depletion of SOD2 enhances nasopharyngeal carcinoma cell radiosensitivity via ferroptosis induction modulated by DHODH inhibition. BMC Cancer. 2023;23(1):117.
  6. Jiang H, Li M, Du K, Ma C, Cheng Y, Wang S, et al. Traditional Chinese medicine for adjuvant treatment of breast cancer: Taohong Siwu decoction. Chin Med. 2021;16(1):129.
  7. Shang L, Wang Y, Li J, Zhou F, Xiao K, Liu Y, et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 2023;302(Pt A):115876.
  8. Yang CH, Tung KL, Wu YT, Liu C, Lin SC, Yang CC, et al. Qing Yan Li Ge Tang, a Chinese herbal formula, induces autophagic cell death through the PI3K/Akt/mTOR pathway in nasopharyngeal carcinoma cells in vitro. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:9925684.
  9. Ren T, Bai XY, Yang MZ, Xu N, Guo XZ, Qin LJ, et al. Gambogic acid suppresses nasopharyngeal carcinoma via rewiring the molecular network of cancer malignancy and immunosurveillance. Biomed Pharmacother. 2022;150:113012.
  10. Zhou T, Zhao S, Tang S, Wang Y, Wu R, Zeng X, et al. Guggulsterone promotes nasopharyngeal carcinoma cells' exosomal Circfip1L1 to mediate miR-125a-5p/VEGFA, affecting tumor angiogenesis. Curr Mol Pharmacol. 2023;16(8):870-80.
  11. Feng X, Shi H, Chao X, Zhao F, Song L, Wei M, et al. Deciphering the pharmacological mechanism of the herb Radix Ophiopogonis in the treatment of nasopharyngeal carcinoma by integrating iTRAQ-coupled 2-D LC-MS/MS analysis and network investigation. Front Pharmacol. 2019;10:253.
  12. Kim W, Lee WB, Lee J, Min BI, Lee H, Cho SH. Traditional herbal medicine as adjunctive therapy for nasopharyngeal cancer: a systematic review and meta-analysis. Integr Cancer Ther. 2015;14(3):212-20.
  13. Zhao J, He B, Seshadri VD, Xu S. Anticancer effect of ruscogenin in B(a)P-induced lung cancer in mice via modulation of proinflammatory cytokines and mitochondrial enzymes. Appl Biochem Biotechnol. 2022;194(12):5862-77.
  14. Rabitha R, Shivani S, Showket Y, Sudhandiran G. Ferroptosis regulates key signaling pathways in gastrointestinal tumors: underlying mechanisms and therapeutic strategies. World J Gastroenterol. 2023;29(16):2433-51.
  15. Feinberg AP, Koldobskiy MA, Göndör A. Epigenetic modulators, modifiers and mediators in cancer etiology and progression. Nat Rev Genet. 2016;17(5):284-99.
  16. Song Y, Wu F, Wu J. Targeting histone methylation for cancer therapy: enzymes, inhibitors, biological activity and perspectives. J Hematol Oncol. 2016;9(1):49.
  17. Zhang W, Ruan X, Li Y, Zhi J, Hu L, Hou X, et al. KDM1A promotes thyroid cancer progression and maintains stemness through the Wnt/β-catenin signaling pathway. Theranostics. 2022;12(4):1500-17.
  18. Ismail T, Lee HK, Kim C, Kwon T, Park TJ, Lee HS. KDM1A microenvironment, its oncogenic potential, and therapeutic significance. Epigenetics Chromatin. 2018;11(1):33.
  19. Hou X, Li Q, Yang L, Yang Z, He J, Li Q, et al. KDM1A and KDM3A promote tumor growth by upregulating cell cycle-associated genes in pancreatic cancer. Exp Biol Med (Maywood). 2021;246(17):1869-83.
  20. Guo D, Liu F, Zhang L, Bian N, Liu L, Kong L, et al. Long non-coding RNA AWPPH enhances malignant phenotypes in nasopharyngeal carcinoma via silencing PTEN through interacting with LSD1 and EZH2. Biochem Cell Biol. 2021;99(2):195-202.
  21. Lu C, Cai Y, Liu W, Peng B, Liang Q, Yan Y, et al. Aberrant expression of KDM1A inhibits ferroptosis of lung cancer cells through up-regulating c-Myc. Sci Rep. 2022;12(1):19168.
  22. Hua H, Zhu Y, Song YH. Ruscogenin suppressed the hepatocellular carcinoma metastasis via PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. Biomed Pharmacother. 2018;101:115-22.
  23. Sun Q, Zhen P, Li D, Liu X, Ding X, Liu H. Amentoflavone promotes ferroptosis by regulating reactive oxygen species (ROS) /5'AMP-activated protein kinase (AMPK)/mammalian target of rapamycin (mTOR) to inhibit the malignant progression of endometrial carcinoma cells. Bioengineered. 2022;13(5):13269-79.
  24. Carlsen CU, Kurtmann L, Brüggemann DA, Hoff S, Risbo J, Skibsted LH. Investigation of oxidation in freeze-dried membranes using the fluorescent probe C11-BODIPY(581/591). Cryobiology. 2009;58(3):262-7.
  25. Liu J, Yuan S, Yao Y, Wang J, Scalabrino G, Jiang S, et al. Network pharmacology and molecular docking elucidate the underlying pharmacological mechanisms of Houttuynia cordata in treating SARS-CoV-2 pneumonia. Viruses. 2022;14(7).
  26. Zhu W, Li Y, Zhao J, Wang Y, Li Y, Wang Y. The mechanism of triptolide in the treatment of connective tissue disease-related interstitial lung disease based on network pharmacology and molecular docking. Ann Med. 2022;54(1):541-52.
  27. Lee AWM, Ng WT, Chan JYW, Corry J, Mäkitie A, Mendenhall WM, et al. Management of locally recurrent nasopharyngeal carcinoma. Cancer Treat Rev. 2019;79:101890.
  28. Li BH, Ma H, Zhu J, Chen J, Dai YQ, Zhang XJ, et al. Semisynthesis and anti-cancer properties of novel honokiol derivatives in human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells. J Enzyme Inhib Med Chem. 2023;38(1):2244694.
  29. Qiao H, Zhang W, Liu P, Zhu R, Zhang J, Gao J, et al. Ropivacaine inhibits proliferation and invasion and promotes apoptosis and autophagy in bladder cancer cells via inhibiting the PI3K/AKT pathway. J Biochem Mol Toxicol. 2023;37(1):e23233.
  30. Zhao L, Han S, Hou J, Shi W, Zhao Y, Chen Y. The local anesthetic ropivacaine suppresses the progression of breast cancer by regulating miR-27b-3p/YAP axis. Aging (Albany, NY). 2021;13(12):16341-52.
  31. Ghasemi A, Khanzadeh T, Zadi Heydarabad M, Khorrami A, Jahanban Esfahlan A, Ghavipanjeh S, et al. Evaluation of BAX and BCL-2 gene expression and apoptosis induction in acute lymphoblastic leukemia cell line CCRFCEM after high-dose prednisolone treatment. Asian Pac J Cancer Prev. 2018;19(8):2319-23.
  32. Wadey KS, Johnson JL, George SJ. Monitoring cellular proliferation and apoptosis in atherosclerotic plaques and intimal thickenings. Methods Mol Biol. 2022;2419:507-19.
  33. Chen P, Wang D, Xiao T, Gu W, Yang H, Yang M, et al. ACSL4 promotes ferroptosis and M1 macrophage polarization to regulate nasopharyngeal carcinoma tumorigenesis. Int Immunopharmacol. 2023;122:110629.
  34. Forcina GC, Dixon SJ. GPX4 at the crossroads of lipid homeostasis and ferroptosis. Proteomics. 2019;19(18):e1800311.
  35. Zhao Y, Li Y, Zhang R, Wang F, Wang T, Jiao Y. The role of erastin in ferroptosis and its prospects in cancer therapy. Onco Targets Ther. 2020;13:5429-41.
  36. Sareddy GR, Nair BC, Krishnan SK, Gonugunta VK, Zhang QG, Suzuki T, et al. KDM1 is a novel therapeutic target for glioma treatment. Oncotarget. 2013;4(1):18-28.
  37. Ferrari-Amorotti G, Fragliasso V, Esteki R, Prudente Z, Soliera AR, Cattelani S, et al. Inhibiting the interactions between the lysine demethylase LSD1 and snail/slug blocks cancer cell invasion. Cancer Res. 2013;73(1):235-45.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Ruscogenin TedavisiKDM1A DownregülasyonuFerroptoz İndüksiyonuApoptoz İndüksiyonuC666-1 HücreleriHücre ProliferasyonuWestern BlotLipid PeroksidasyonuKaspaz-3 Aktivasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.