Yöntem makalesi

Aedes albopictus Disseksiyonu ve Disseksiyon Sonrası Dokulardan Toplam RNA Ekstraksiyonu

19 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72811

⸱

30 Ekim 2026

 ,  , 
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 3National Health Commission Key Laboratory on Parasitic Disease Prevention and Control, Jiangsu Provincial Key Laboratory on Parasites and Vector Control Technology, Jiangsu Institute of Parasitic Diseases

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, sivrisinek kaynaklı virüs transmisyon çalışmalarında vektör dokularının moleküler karakterizasyonu için, Aedes albopictus türünden orta bağırsak, yumurtalıklar ve tükürük bezlerinin diseksiyonu ve ardından toplam RNA ekstraksiyonuna yönelik bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Temmuz 2025'te Çin'in Guangdong Eyaleti, Foshan şehrinde bir dengue ateşi ve chikungunya salgını meydana gelmiştir. Ae. albopictus, bu virüsler için temel bir vektördür. Bu protokol, Ae. albopictus türünün orta bağırsağının, tükürük bezlerinin ve yumurtalıklarının diseksiyonu ile diseke edilen dokulardan toplam RNA ekstraksiyonu için basit ve standardize edilmiş bir yöntemi tanımlamaktadır. Üç günlük, kan emmemiş dişi sivrisinekler −20 °C'de 2 dk boyunca dondurularak anestezi uygulanmış ve ardından hedef dokuların diseksiyonu gerçekleştirilmiştir. Toplam RNA, bir doku RNA ekstraksiyon kiti ile ekstrakte edilmiş, mikrohacimli bir spektrofotometre ile miktarı belirlenmiş ve kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizi için kullanılmıştır. Sonuçlar, diseksiyon yönteminin dokuları hızlı ve eksiksiz bir şekilde ayırdığını ve ayrılan dokulardan elde edilen RNA'nın nispeten yüksek saflığa ulaşabildiğini göstermektedir. RT-qPCR, üç referans genin (GAPDH, β-actin ve RPS6) ekspresyon paternlerini ve göreceli stabilitesini ortaya koymuştur. Yöntem basit ve doğrulanmıştır; Ae. albopictus ile ilgili araştırmalar için standardize edilmiş teknik destek sağlamaktadır.

Giriş

Aedes albopictus (Ae. albopictus), dengue virüsü (DENV) ve chikungunya virüsü (CHIKV) dahil olmak üzere birçok patojen için bir vektördür1,2,3. Yaygın bir dağılıma sahiptir ve birçok bölgede sivrisinek kaynaklı hastalık salgınlarına yol açmıştır4,5. Ae. albopictus'in patojenleri iletme yeteneği, vektör kompetansı olarak bilinir; popülasyonlar arasında farklılık gösterir ve orta bağırsak, yumurtalıklar ve tükürük bezlerindeki spesifik gen ekspresyonu ile ilişkilidir6. Bu dokuların yapısını anlamak ve yüksek kalitede RNA ekstrakte etmek, vektör kaynaklı virüslerin replikasyonunu, yayılımını ve iletimini anlamak için kritik öneme sahiptir7.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR) ile göreceli gen ekspresyonunun tespiti, Ae. albopictus dokularının hassas diseksiyonuna ve yüksek kaliteli RNA ekstraksiyonuna bağlıdır8,9. Bugüne kadar, orta bağırsak, yumurtalıklar ve tükürük bezlerinin diseksiyonu için yayınlanan video protokolleri öncelikle Aedes aegypti üzerine odaklanmıştır10. Bu nedenle, mevcut protokol Ae. albopictus türünden orta bağırsak, yumurtalıklar ve tükürük bezlerinin diseksiyonunu göstermektedir; bu yöntemde diseke edilen dokular, doku transfer basamaklarından kaçınmak ve transfer kaybını minimize etmek için doğrudan RNA koruma çözeltisi içeren öğütme tüplerine yerleştirilir. Toplam RNA, geleneksel TRIzol yöntemine göre daha az işlem basamağı ve daha az zaman gerektiren kolon tabanlı bir yöntem kullanılarak diseke edilen dokulardan ekstrakte edilir11. Bu ekstraksiyon, tipik olarak beş Ae. albopictus bireyinin tükürük bezlerinden, sonraki RT-qPCR işlemleri için saflık gereksinimlerini karşılayan 1,8–2,0 A260/A280 oranlarıyla 0,1–0,3 µg toplam RNA sağlar. Ae. albopictus dokularında üç referans genin ekspresyonunu ölçmek ve böylece her dokudan ekstrakte edilen RNA'nın kalitesini değerlendirmek için RT-qPCR gerçekleştirilir.

Bu protokolün yalnızca 3 günlük, kan beslenmemiş dişi Ae. albopictus sineklerinin orta bağırsağı, yumurtalıkları ve tükürük bezleri için valide edildiği ve yağ vücudundan RNA ekstraksiyonu için uygun olmadığı unutulmamalıdır. Bozulmamış ve bağımsız dokular elde etmek, sonraki analizlerin temelini oluşturur. Ae. albopictus dokularının sistematik diseksiyonu ve yüksek kaliteli RNA ekstraksiyonu aracılığıyla bu protokol; sonraki gen ekspresyonu tespitleri, popülasyon düzeyinde vektör kapasitesi değerlendirmeleri ve arbovirüs transmisyon kontrolü için teknik destek sağlamaktadır.

Protokol

Bu çalışmada yalnızca laboratuvar ortamında yetiştirilmiş Ae. albopictus sivrisinekleri kullanılmıştır. Buna göre, bu çalışma için kurumsal etik onay gerekmemiştir. Bu deneyde kullanılan  Ae. albopictus suşu, Çin Ulusal Sağlık Komisyonu Paraziter Hastalık Kontrol ve Önleme Ana Laboratuvarı (Jiangsu) tarafından sağlanmıştır. Bu koloni başlangıçta 1980'lerde Wuxi şehrinden toplanmış ve  Jiangsu Paraziter Hastalıklar Enstitüsü  bünyesindeki böcek üretim alanında standart koşullar altında tutulmuştur. Sivrisinek kolonisi, 25 °C ± 1 °C sıcaklık, 75% ± 5% bağıl nem ve 10 sa ışık ile 14 sa karanlık fotoperiyodu olan yapay bir iklim odasında barındırılmıştır. Larvalar ultrapure su içerisinde yetiştirilmiş ve 2:1 oranında domuz karaciğer tozu ve maya özütü (Shanghai Brewery) karışımı ile beslenmiştir. Erişkin sivrisinekler %5'lik glukoz çözeltisi ile beslenmiştir. Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyal Tablosunda listelenmiştir.

1. Materyallerin hazırlanması

  1. Çözeltilerin hazırlanması
    1. 1x PBS tamponunun hazırlanması: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 ve 0,24 g KH2PO4 tartın. Karıştırarak 800 mL ultra saf suda çözün. pH değerini 7,4'e ayarlayın. Final hacmini 1 L'ye tamamlayın. 121 °C'de 20 dk boyunca otoklavlayın.
    2. DEPC çözeltisinin hazırlanması: 1 L ultra saf suya 1 mL DEPC stok çözeltisi ekleyin. Manyetik karıştırıcıda 12–16 saat boyunca kuvvetlice karıştırın. 121 °C'de 20 dk boyunca otoklavlayın.
      UYARI: DEPC oldukça toksik ve karsinojendir. Eldiven ve koruyucu gözlük takın ve işlemleri çeker ocak altında gerçekleştirin.
      NOT: Kuvvetli karıştırma sırasında beherin üzerini alüminyum folyo ile kapatın. DEPC çözeltisini alikotlara ayırın ve -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
  2. Sarf malzemelerinin hazırlanması
    1. Diseksiyon aletlerinin sterilizasyonu: 1 mm'lik diseksiyon iğnelerini ve ince uçlu pensetleri bir alüminyum kaba yerleştirin ve 121 °C'de 20 dk boyunca otoklavlayın.
    2. İçinde 0,5–1,0 mm silika boncuklar bulunan 2 mL'lik öğütme tüplerini hazırlayın. Alüminyum bir kaba yerleştirin ve 121 °C'de 20 dk boyunca otoklavlayın.
    3. Her bir öğütme tüpüne kit ile birlikte verilen RNA koruma çözeltisinden 200 µL ekleyin.
      NOT: Dokulardaki RNA kalitesi, organizmadan çıkarıldıktan sonraki 1 dk içinde önemli ölçüde azalır. Koruma çözeltisi içeren öğütme tüplerini önceden hazırlayın.

2. Ae. albopictus Toplanması

NOT: Beyaz laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin. Koyu renkli giysiler giymeyin, çünkü koyu renkler sivrisinekleri çeker.

  1. Ae. albopictus türünün kaçmasını önlemek için sivrisinek kafesinin bulunduğu odadaki tüm kapıları, pencereleri ve havalandırma sistemlerini kapatın.
  2. Elektrikli aspiratörü çalıştırın ve sivrisinek kafesinin içine yerleştirin. Aspiratörü kafesin iç duvarlarında dinlenen Ae. albopictus sivrisineklerine doğru yönlendirin ve sivrisinekleri toplayın.
  3. Aspiratörü kafesten yavaşça geri çekerken çalıştırmaya devam edin. Kafesi hemen mühürleyin ve aspiratörün kapağını kapatın.
  4. Toplama haznesini çıkarın ve Ae. albopictus türünü soğukla immobilize etmek için -20 °C'de 2 dk boyunca bekletin.
  5. Ön soğutma için 10 cm'lik bir cam tabağı buz üzerine yerleştirin. İmmobilize edilmiş Ae. albopictus örneklerini toplama haznesinden cam tabağa aktarın.
    NOT: Doku hasarını önlemek için soğuk immobilizasyon süresini kesin olarak kontrol edin.

3. Disseksiyon öncesi dişi Ae. albopictus tanımlama

  1. Cam kap içinden morfolojik olarak sağlam, soğukla anestezi edilmiş Ae. albopictus bireylerini seçin ve bunları bir lam üzerine aktarın. 80x büyütmedeki bir stereomikroskop altında inceleyin.
  2. Mezonotum üzerindeki beyaz boyuna şeridi tanımlayın.
  3. Tarsal segmentlerin tabanındaki ve abdominal tergite II-VI tabanındaki beyaz bantları doğrulayın12.
  4. Antenleri 80x büyütmede inceleyin. Dişileri belirlemek için filiform antenleri (dişi), plumoz antenlerden (erkek) ayırt edin.

4. Ae. albopictus abdomen diseksiyonu

  1. Steril bir lam üzerine, soldan sağa doğru her biri yaklaşık 20 µL hacminde ve yaklaşık 5 mm aralıklarla üç damla steril 1x PBS yerleştirin.
    NOT: PBS damlaları, Ae. albopictus örneğinin tamamını kapatacak kadar büyük olmalıdır.
  2. İnce uçlu pensle Ae. albopictus kanatlarını tutun ve sivrisineği en soldaki PBS damlasına yerleştirin.
  3. Ae. albopictus örneğini ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Sol elinizle bir diseksiyon iğnesi tutun ve Ae. albopictus örneğini sabitlemek için ikinci abdominal segmente bastırın.
  4. Sağ elinizle, altıncı abdominal segmentin orta noktasına 1 mm'lik bir diseksiyon iğnesi yerleştirin. Abdominal boşluğu açmak için transvers, yarı dairesel bir insizyon yapın.
  5. Sağ elde tutulan diseksiyon iğnesini yaklaşık 2 mm posteriora hareket ettirin ve karnı sabitlemek için VI–VIII abdominal segmentlerin orta bölgesine bastırın.
    NOT: Overler, II-VI abdominal segmentlerin içinde dorsalde yer alır. Overlerin sağlam morfolojisine zarar vermemek için VI-VIII segmentlere bastırırken iğneyi rastgele hareket ettirmeyin.
  6. Sol elinizle, diseksiyon iğnesi kullanarak ikinci abdominal segmenti kavrayın ve karnı altıncı segmentten ayırmak için nazikçe dışa doğru çekin. Ayırma işlemi sırasında ön bağırsak, orta bağırsak ve Malpighi tübülleri tamamen açığa çıkacaktır.
    NOT: Malpighi tübülleri beyaz ve ince yapılıdır. Orta bağırsak yarı şeffaf ve fusiformdir.
  7. Orta bağırsağı ön bağırsak ve arka bağırsaktan ayırın. Orta bağırsağı merkezi PBS damlasında iki kez yıkayın.
  8. Örneği, ticari RNA ekstraksiyon kitinde sağlanan 200 µL RNA koruma solüsyonu içeren bir ezme tüpüne aktarın.
  9. Her iki yanda bulunan çift overleri açığa çıkarmak için diseksiyon iğnesiyle sekizinci abdominal segmentin ortasına bastırın. Overleri çıkarın, merkezi PBS damlasında iki kez yıkayın ve 200 µL RNA koruma solüsyonu içeren bir ezme tüpüne aktarın.
    NOT: Çift overler simetrik, pirinç tanesi şeklinde ve süt beyazıdır. Çıkarma işlemi sırasında overlerin yapısal bütünlüğünü korumak için dikkatli işlem yapın.

5. Ae. albopictus tükürük bezi diseksiyonu

  1. Mikroskop büyütmesini 400x'e artırın. Abdomeni diseke edilmiş Ae. albopictus örneğini en sağdaki PBS damlasına aktarın.
  2. Kafa hafifçe yükselene kadar sol eldeki diseksiyon iğnesi ile mezotoraks üzerine nazikçe baskı uygulayın.
  3. Sağ eldeki diseksiyon iğnesini kullanarak kafayı serviks bölgesinden kaldırın ve yavaşça dışarı doğru çekin. Tükürük bezlerinin (üç loblu yapı), kafa ile birlikte torakstan ayrılışını gözlemleyin.
    NOT: Tükürük bezleri ön toraksta yer alır ve tükürük kanalı aracılığıyla kafaya bağlanır. Toraksa tutarlı bir basınç uygulamak, tükürük kanalının yırtılmasını önler ve tükürük bezlerinin kafa ile birlikte torakstan bütün halde ayrılmasını sağlar. Bu adımdaki kuvvet kontrolü, tekrarlanan uygulama gerektirir.
  4. Tükürük bezlerini kafadan ayırın. Bunları merkezdeki PBS damlasında iki kez durulayın ve hazırlanmış bir ezme tüpüne aktarın.
    NOT: Tükürük bezleri yaklaşık 1 mm boyutundadır. Bunları 200 µL RNA koruma çözeltisi içeren bir ezme tüpüne aktarın ve çözeltide yüzen küçük beyaz noktaların varlığını onaylamak için beyaz bir ışık kaynağına karşı gözlemleyin.

6. Ae. albopictus ve onun tükürük bezleri, yumurtalıkları ve orta bağırsağından RNA ekstraksiyonu

NOT: Tüm RNA ekstraksiyon adımları, ticari doku RNA ekstraksiyon kitinin üretici talimatlarına uygun olarak, herhangi bir değişiklik yapılmadan gerçekleştirilmiştir.

  1. Doku öğütücüyü 4 °C'ye ön soğutma yapın. Parametreleri 30 Hz, 30 s öğütme süresi, 10 döngü ve 8 s duraklama süresi olarak ayarlayın.
  2. Doku örneklerini içeren öğütme tüplerini öğütücüye yerleştirin ve programı çalıştırın.
    NOT: Öğütme işleminden sonra dokunun RNA koruma solüsyonu içinde tamamen dağılıp dağılmadığını kontrol edin. Öğütme tamamlanmamışsa, 5 döngü daha çalıştırın.
  3. Homojenatı steril bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. 4 °C'de 5 dk boyunca 12.000 x g hızında santrifüjleyin.
  4. Süpernatantı yeni, steril bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. 30 µL kloroform ekleyin.
    UYARI: Kloroform toksik ve kanserojendir. Eldiven ve koruyucu gözlük takın ve işlemi çeker ocak altında gerçekleştirin.
  5. 20 s boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Oda sıcaklığında 15 dk inkübe edin, ardından 4 °C'de 15 dk boyunca 12.000 x g hızında santrifüjleyin.
    NOT: Protein kontaminasyonunu önlemek için ortadaki beyaz tabakaya temas etmeden üstteki sulu fazı dikkatlice aspire edin.
  6. Üstteki sulu fazı yeni, steril bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. 75 µL izopropanol ekleyin.
  7. Tüpleri tersyüz ederek karıştırın ve tüm karışımı bir silika spin kolonuna aktarın. 1 dk boyunca 12.000 x g hızında santrifüjleyin.
  8. Kolona 600 µL yıkama tamponu ekleyin. 30 s boyunca 12.000 x g hızında santrifüjleyin. Akış sıvısını atın.
  9. Kolona 600 µL %80 etanol ekleyin. 30 s boyunca 12.000 x g hızında santrifüjleyin. Akış sıvısını atın. Bu yıkama adımını toplam iki yıkama olacak şekilde bir kez daha tekrarlayın.
  10. Kolon membranının merkezine 30 µL DEPC'li su ekleyin. Oda sıcaklığında 1 dk inkübe edin.
  11. Kolonu steril bir 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. RNA'yı elüe etmek için 1 dk boyunca 12.000 x g hızında santrifüjleyin.
  12. Elüe edilen RNA'dan 1 µL alın ve bir mikrovolüm spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ve saflığı ölçün.

7. RNA ters transkripsiyonu

  1. Reaksiyon sisteminin hazırlanması
    1. 4x ters transkripsiyon master mix'ini, nükleaz içermeyen suyu ve RNA kalıbını buz üzerinde çözdürün.
    2. 200 µL'lik bir PCR tüpünde; 5 µL 4x ters transkripsiyon master mix'i, 10 µL toplam RNA kalıbı ve 5 µL nükleaz içermeyen su ekleyerek 20 µL'lik bir reaksiyon sistemi hazırlayın.
    3. Reaksiyon karışımını tüpün dibinde toplamak için 1.000 x g hızda 1 dk boyunca kısa süreli santrifüjleyin.
    4. PCR tüpünü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve ters transkripsiyon programını çalıştırın: 50 °C'de 5 dk; 85 °C'de 5 sn.
      NOT: Potansiyel inhibitörlerin RT-qPCR üzerindeki etkisini azaltmak için ters transkripsiyon ürününü kullanmadan önce 20 kat seyrelttirin.

8. Gerçek zamanlı kantitatif PCR (RT-qPCR)

  1. RT-qPCR reaksiyon sisteminin hazırlanması
    1. 2x SYBR Green qPCR master mix, cDNA şablonu ile 10 µM ileri ve geri primerleri, süreç boyunca ışıktan koruyarak buz üzerinde çözdürün.
    2. 96 kuyucuklu bir PCR plakasında, her kuyucuğa 10 µL 2x SYBR Green qPCR master mix, 10 µM ileri ve geri primerlerinden 0.8 µL'er (final konsantrasyon 400 nM), 20 kat dilüe edilmiş cDNA şablonundan 2 µL ve 6.4 µL nükleazsız su ekleyerek kuyucuk başına 20 µL'lik bir reaksiyon sistemi hazırlayın.
    3. Tüm kuyucukların tamamen kapatıldığından emin olarak 96 kuyucuklu plakayı optik yapışkan film ile mühürleyin.
    4. Reaksiyon karışımını kuyucukların dibine toplamak için 1.000 x g hızda 1 dk boyunca santrifüjleyin.
    5. PCR plakasını bir gerçek zamanlı PCR tespit sistemine yerleştirin ve termal döngü programını çalıştırın.
      NOT: Termal döngü programı: 95 °C'de 30 sn ön-denatürasyon (1 döngü); amplifikasyon: 95 °C'de 30 sn, 60 °C'de 30 sn (40 döngü); erime eğrisi analizi: 95 °C'de 15 sn, 60 °C'de 1 dk, 0.15 °C/s hızla 95 °C'ye rampa. Her doku RNA örneği, dörtlü teknik tekrarlar şeklinde qPCR'ye tabi tutulur. Her doku örneği, 5 Ae. albopictus'tan havuzlanmış dokulardan oluşur. RT-qPCR için kullanılan primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir.
  2. Veri analizi
    1. Tek ve belirgin bir disosiasyon pikini onaylamak için her primer çiftinin erime eğrisini inceleyin.
    2. Ct değerlerini cihaz yazılımından dışa aktarın. Grafiğe dökme ve veri analizleri, istatistiksel ve grafik yazılımları kullanılarak gerçekleştirilir.
Primer isimleriPrimer dizileri (5''-3')
Ae. albopictus β-aktin İleri Primeri GGAGAAGATCTGGCATCACA
Ae. albopictus β$\beta$-actin Ters PrimerTGTCATCTTCTCGCGGTTAG
Ae. albopictus GAPDH İleri PrimerCTGCCAAGGCTGTCGGTAA
Ae. albopictus GAPDH Ters PrimerTCATAGGAGGCAGGCTTGGA
Ae. albopictus RPS6 İleri PrimerACAAGCTGCGTCACTTCTACGACA
Ae. albopictus RPS6 Ters PrimerCTTGTCGTTTCCACCGGCAATCTT

Tablo 1: RT-qPCR'da kullanılan Ae. albopictus primer dizileri.

Sonuçlar

Bu çalışma iki bölümden oluşmaktadır: Ae. albopictus diseksiyonu ve diseksiyon sonrası dokulardan RNA ekstraksiyonu. Genel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir; burada Şekil 1A Ae. albopictus diseksiyonunu, Şekil 1B ise RNA ekstraksiyonunu ve ardından gelen referans gen ekspresyon seviyelerinin tespitini göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Ae. albopictus diseksiyonunun ve diseksiyon sonrası dokulardan toplam RNA ekstraksiyonunun şeması. (A) Ae. albopictus toplama, anestezi ve diseksiyon işlemleri. (B) Diseksiyon sonrası dokulardan RNA ekstraksiyonu, saflık tayini ve referans gen ekspresyon düzeylerinin saptanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Laboratuvar ortamında yetiştirilmiş beş Ae. albopictus orta bağırsak, tükürük bezleri ve yumurtalıkları izole etmek amacıyla diseke edildi. 80 büyütmede׺effaf önbağırsak, orta bağırsak ve arka bağırsağı olan Ae. albopictus belirgin şekilde görünür durumdaydı; tane benzeri overler her iki yanda konumlanmış ve beyaz Malpighi tübülleri ile örtülmüştü (Şekil 2A). Alan 400'e ayarlandığında×, şeffaf tükürük bezleri Ae. albopictus belirgin bir şekilde gözlemlenebilir hale geldi (Şekil 2B). Şekil 2C,D örneklemek / resmetmek / açıklamak izole edilen orta bağırsak ve over dokuları. Sonuçlar, bu diseksiyon yöntemiyle izole edilen dokuların, diseksiyon sonrası örneklerden yapılacak toplam RNA ekstraksiyonu için temel teşkil eden yapısal bütünlüklerini koruduklarını göstermiştir.

figure-results-2
Şekil 2: Ae. albopictus dokularının diseksiyon sonrası analizi. (A) Dokular, Ae. albopictus abdomeninden izole edilmiştir. (B) Ae. albopictus'in yarı saydam, üç loblu tükürük bezleri. (C) Ae. albopictus'in ön bağırsak ve orta bağırsağı. (D) Ae. albopictus'in pirinç tanesi şeklinde çift yumurtalıkları. I: ön bağırsak; II: orta bağırsak; III: arka bağırsak; IV: Malpighi tübülleri; V: yumurtalıklar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ae. albopictus'ın diseke edilmiş dokularından toplam RNA ekstrakte edildi. Ekstraksiyon öncesinde doku örnekleri (tükürük bezleri, orta bağırsak ve yumurtalıklar) tamamen öğütüldü. RNA konsantrasyonları doku tipine göre farklılık gösterdi: tükürük bezlerinde 7,8 ng/µL iken, dişi Ae. albopictus'ın orta bağırsak, yumurtalık ve tüm vücut homojenatlarında sırasıyla 55,3, 45,7 ve 42,7 ng/µL saptandı. Tüm örnekler, 1,87–2,10 A260/A280 oranları ve 1,73–2,13 A260/A230 oranları ile yüksek saflık sergiledi (Tablo 2). Üç aday referans genin (GAPDH, β-actin ve RPS6) ekspresyon seviyeleri, tüm dokularda RT-qPCR ile değerlendirildi. Ekspresyonları RNA konsantrasyonuna bağlı olarak bir miktar farklılık gösterse de, her üç gen farklı doku tiplerinde nispeten stabil kaldı (Şekil 3). GAPDH, β-actin ve RPS6, Ae. albopictus'ın farklı dokularındaki gen ekspresyonunu normalize etmek için stabil referans genler olarak uygundur.

DokuÖrnek sayısıRNA kons. (ng/μL)A260/A280A260/A230
Tükürük bezi57.81.871.73
Orta bağırsak555.31.941.98
Yumurtalık545.72.102.13
Dişi142.72.041.92

Tablo 2: Ae. albopictus dokusundan ekstrakte edilen RNA'nın konsantrasyonu ve saflığı.

figure-results-3
Şekil 3: RT-qPCR ile tespit edilen referans genlerin (GAPDH, β-actin, ve RPS6) Ct değerleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Ae. albopictus, Antarktika hariç tüm kıtalardaki ılıman, subtropikal ve tropikal bölgelerde yaygın olarak dağılım göstermektedir13,14. Deng humması virüsü (DENV), Zika virüsü (ZIKV) ve chikungunya virüsü (CHIKV) gibi arbovirüsler için önemli bir vektör olan bu tür, Çin'in Guangdong bölgesinde defalarca sivrisinek kaynaklı hastalık salgınlarına neden olmuştur15.

Ae. albopictus ile ilişkili virüsler ve bunların iletimi üzerine yapılan araştırmalara yardımcı olmak amacıyla, Ae. albopictus dokularının diseksiyonu için basit bir yöntem geliştirdik. Geleneksel diseksiyon protokollerinde, tükürük bezi diseksiyonu sırasında baş toraksdan ayrılırken, uygulanan kuvvete bağlı olarak tükürük bezleri ya toraksa ya da başa yapışık kalabilmektedir; tükürük bezleri yalnızca yaklaşık 1 mm boyutunda olduğundan, bunların toraks içinde konumlandırılması zorlaşmaktadır16. Bu yöntem, standart sivrisinek organ izolasyon protokolleri üzerine kurulmuştur ve 400× büyütme altında gözlemlenmesi gereken, prosternal ve mesosternal sternitlerin altında yer alan tükürük bezlerinin ayrılmasını optimize eder17. Diseksiyon için, bir iğne ile mesotoraksa hafifçe bastırırken, diğer iğneyle başı ayıracak basıncı uygulayarak tükürük bezlerinin bütün halde ayrılmasını sağlayın. Bu yaklaşım, tükürük bezlerini toraks içinde arama ihtiyacını ortadan kaldırır, bezlerin kontaminasyonunu ve zarar görmesini önler ve toplam diseksiyon süresini kısaltır. Overler, abdominal segment VI–VIII yakınında yer alır ve diseksiyona altıncı abdominal segmentten başlanıp midgut, Malpighi tüpleri ve overlerin abdomenden dikkatlice çıkarılmasıyla korunurlar18. Bu yöntem; bütün tükürük bezleri, yapışıklıklardan arınmış tipik over şekilleri ve kopmamış bir midgut sağlar (Şekil 2). Bu diseksiyon tekniği, Ae. albopictus ile vektör kaynaklı virüslerin replikasyonu, yayılımı ve iletimi üzerine yapılan çalışmalar için değerli bir rehberlik sunmaktadır.

Ae. albopictus dokularından RNA ekstraksiyonu, sivrisinek kaynaklı virüslerin tespiti için kritik öneme sahiptir. Geleneksel TRIzol yöntemi zaman alıcı ve teknik olarak zahmetlidir, ancak doğru uygulandığında genellikle yüksek RNA verimi sağlar ve yüksek kaliteli RNA üretebilir. Buna karşılık, kolon tabanlı yöntem daha iyi tekrarlanabilirlik sunar ve uygulanması daha kolaydır; ancak daha düşük RNA geri kazanımı ile sonuçlanabilir ve yağ cismi üzerine uygulandığında verimsiz çalışır19,20. Bu çalışmada, diseke edilen dokular hızla bir nükleik asit stabilize edicide korunmuş, tamamen öğütülmüş ve cDNA sentezi için RNA ekstrakt etmek amacıyla spin kolon yöntemi kullanılarak işlenmiştir21. cDNA kalitesindeki varyasyonlar arasında RT-qPCR verilerinin doğru normalizasyonunu sağlamak için stabil referans genler gereklidir22. Ae. albopictus'un çeşitli gelişim aşamaları için referans genler belirlenmiş olsa da, dokuya özgü referans genlerin daha fazla doğrulanmaya ihtiyacı vardır23,24. Tüm diseke edilen dokulardan elde edilen ters transkripsiyonlu RNA'ların RT-qPCR analizi; GAPDH, β-actin ve RPS6'nın tutarlı amplifikasyonunu sağlamış ve bu diseksiyon protokolü ile elde edilen RNA kalitesinin, Ae. albopictus'taki sonraki dokuya özgü gen ekspresyon çalışmalarını desteklemek için yeterli olduğunu doğrulamıştır.

Bu protokolle Ae. albopictus dokularının diseksiyonu sırasında, tükürük bezlerinin başla birlikte ayrılmaması durumu bazen meydana gelebilir. Bu durum genellikle toraksa yetersiz basınç uygulanması ve başın aşırı hızlı ayrılmasından kaynaklanır. Bunu gidermek için mezotoraksa tutarlı bir basınç uygulayın ve tükürük bezlerinin başla birlikte bütün halde ayrılmasını sağlayarak başı yavaşça dışarı doğru çekin. Tükürük bezlerini RNA koruma solüsyonu içeren bir öğütme tüpüne aktarırken, solüsyonu bir ışık kaynağına karşı küçük yüzen beyaz lekeler açısından dikkatlice inceleyin. Tükürük bezleri tüpte bulunamazsa, diseksiyon iğnesine yapışık kalıp kalmadıklarını hemen kontrol edin. RNA ekstraksiyonu sırasında, kit üreticisinin protokolüne kesinlikle uyun. Elde edilen RNA konsantrasyonu düşükse, elüsyon tamponu ile ikinci bir elüsyon gerçekleştirilebilir. RT-qPCR'da, erime eğrisinde birden fazla pik oluşabilir; bu durumda önce primer özgüllüğünü doğrulayın. Ct değerleri yüksekse, programın bağlanma sıcaklığını primer erime sıcaklığına göre ayarlayın. Genel olarak, programdaki bağlanma sıcaklığı, primer erime sıcaklığının 1–2 °C altına ayarlanmalıdır25.

Bu çalışmanın bazı kısıtlamaları bulunmaktadır. Örneklem kapsamı nispeten dardır; Malpighian tübülleri ve yağ cisimciği gibi diğer dokular araştırılmadan yalnızca orta bağırsak, tükürük bezleri ve yumurtalık dokularına odaklanılmıştır26. Ayrıca, analizler kanla beslenmiş ve virüs enfekte bireyler hariç tutularak, 3 günlük laboratuvar ortamında yetiştirilmiş dişi sivrisineklerle sınırlandırılmıştır27. Gelecekteki geliştirmeler, örneklem kapsamının Malpighian tübülleri gibi dokuları içerecek şekilde genişletilmesini ve farklı fizyolojik durumlardaki Ae. albopictus bireylerinin değerlendirilmesini kapsamalıdır.

Özetle, Ae. albopictus'tan orta bağırsak, yumurtalıklar ve tükürük bezlerinin diseksiyonu ve ardından toplam RNA ekstraksiyonu, vektör yeteneği değerlendirmeleri ve arbovirüs iletim çalışmaları için teknik bir temel oluşturur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3 mL Ekstra Uzun Pasteur PipetiWHBWHB-S43 mL
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711-02500 reaksiyon
HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCR kitiVazymeR433-01100 reaksiyon
Mikro Total RNA Ekstraksiyon KitiMedTeknolojiMDT-CFR07100T/kutu
Mikropipetler 0,5-10μLEppendorf4043444
Mikroskop lamlarıCITOTEST80302-210475 mm×25 mm
MikrospektrofotometreKAIAOK5600C
Nükleik asit ekstraksiyon tamponuMedTeknolojiMDT-TP01100 mL
PBS Fosfat Tamponlu Salin (Steril)ServicebioG4202500 mL
PCR Termal DöngüleyiciEppendorfMastercycler X50s
QuantStudioTM 7 Pro Gerçek Zamanlı PCR SistemiApplied BiosystemsEN61326-1
Stemi 305 LAB Mikroskop SetiZEISS435063-9010-000

Kaynaklar

  1. Hafsia S et al. Vector competence of Aedes albopictus and Aedes aegypti from the islands of the Southwestern Indian Ocean for epidemic Zika, dengue, and chikungunya viruses. Parasit Vectors. 2025;19(1):34.
  2. Zhang W, Wang J, Liu Q, Gong Z. A review of pathogens transmitted by the container-inhabiting mosquitoes, Aedes albopictus, a global public health threat. China CDC Wkly. 2023;5(44):984-990.
  3. Kraemer MUG et al. Past and future spread of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus. Nat Microbiol. 2019;4(5):854-863.
  4. Zhang M et al. Epidemiological characteristics and transmission dynamics of the early stage Chikungunya fever outbreak in Foshan City, Guangdong Province, China in 2025. Infect Dis Poverty. 2025;14(1):93.
  5. Meyer AD, Guerrero SM, Dean NE, Anderson KB, Stoddard ST, Perkins TA. Predictability of infectious disease outbreak severity: Chikungunya as a case study. Sci Adv. 2025;11(40):eadt5419.
  6. Wu Y et al. The making of a dangerous vector: factors shaping the vector competence of Aedes mosquitoes. Front Cell Infect Microbiol. 2025;15:1718737.
  7. Zhu C et al. Transcriptome analysis of Aedes aegypti midgut and salivary gland post-Zika virus infection. Curr Res Parasitol Vector Borne Dis. 2025;7:100251.
  8. Liu X, Yang S, Yao Y, Wu S, Wu P, Zhai Z. Opsin1 regulates light-evoked avoidance behavior in Aedes albopictus. BMC Biol. 2022;20(1):110.
  9. Zhang Y et al. Rapid differential detection of Japanese encephalitis virus and Getah virus in pigs or mosquitos by a duplex TaqMan real-time RT-PCR assay. Front Vet Sci. 2022;9:839443.
  10. Coleman J, Juhn J, James AA. Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes. J Vis Exp. 2007;4(5):228.
  11. Tesena P, Korchunjit W, Taylor J, Wongtawan T. Comparison of commercial RNA extraction kits and qPCR master mixes for studying gene expression in small biopsy tissue samples from the equine gastric epithelium. J Equine Sci. 2017;28(4):135-141.
  12. Ramdini C et al. First report of Aedes albopictus in Saint Barthélemy (French West Indies) confirmed by morphological, molecular and MALDI-TOF mass spectrometry approaches. Parasit Vectors. 2025;18(1):258.
  13. Battaglia V et al. The worldwide spread of Aedes albopictus: new insights from mitogenomes. Front Genet. 2022;13:931163.
  14. Laporta GZ, Potter AM, Oliveira JFA, Bourke BP, Pecor DB, Linton YM. Global distribution of Aedes aegypti and Aedes albopictus in a climate change scenario of regional rivalry. Insects. 2023;14(1):49.
  15. Yip SSW, Charm CYC, Ng KS, Lam SC. Chikungunya fever: a re-emerging mosquito-borne threat demanding proactive prevention strategies in Asia. Front Public Health. 2026;14:1745145.
  16. Tutagata J, Pocquet N, Trouche B, Reveillaud J. Dissection of mosquito ovaries, midgut, and salivary glands for microbiome analyses at the organ level. J Vis Exp. 2024;(212):67128.
  17. Schmid MA, Kauffman E, Payne A, Harris E, Kramer LD. Preparation of mosquito salivary gland extract and intradermal inoculation of mice. Bio Protoc. 2017;7(14):e2407.
  18. Airs PM, Nazarchyk MJ, Tucker BJ, Bartholomay LC. Characterizing oogenesis and programmed cell death in the eastern tree hole mosquito Aedes (Protomacleaya) triseriatus. Front Insect Sci. 2022;2:1073308.
  19. Chomczynski P, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006;1(2):581-585.
  20. De Azevedo N, Lozano A, Parsons RE, Martin TC. Optimized protocols to extract total transcripts and proteins from lipid-rich tissues. Methods Protoc. 2026;9(2):65.
  21. García-Longoria L, Ahrén D, Berthomieu A, Kalbskopf V, Rivero A, Hellgren O. Immune gene expression in the mosquito vector Culex quinquefasciatus during an avian malaria infection. Mol Ecol. 2023;32(4):904-919.
  22. Lü J, Yang C, Zhang Y, Pan H. Selection of reference genes for the normalization of RT-qPCR data in gene expression studies in insects: a systematic review. Front Physiol. 2018;9:1560.
  23. Dzaki N, Azzam G. Assessment of Aedes albopictus reference genes for quantitative PCR at different stages of development. PLoS One. 2018;13(3):e0194664.
  24. Vedururu RK et al. RNASeq analysis of Aedes albopictus mosquito midguts after chikungunya virus infection. Viruses. 2019;11(6):513.
  25. Bustin SA et al. MIQE 2.0: revision of the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments guidelines. Clin Chem. 2025;71(6):634-651.
  26. Skowronek P, Wójcik Ł, Strachecka A. Fat body-multifunctional insect tissue. Insects. 2021;12(6):547.
  27. Goldman OV et al. A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult Aedes aegypti mosquito. Cell. 2025;188(25):7267-90.e26.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Sivrisinek DiseksiyonuOrta Bağırsak DiseksiyonuTükürük Bezi DiseksiyonuOver DiseksiyonuRT-qPCR AnaliziReferans Gen EkspresyonuDoku RNA Saflığı
Aedes albopictus Disseksiyonu ve Disseksiyon Sonrası Dokulardan Toplam RNA Ekstraksiyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.