Yöntem makalesi

Meme Kanseri Beyin Metastazının Basitleştirilmiş Çok Hücreli In Vitro Kan-Tümör Bariyeri Modelinin Oluşturulması için Hücre Kültürü İnset Tabanlı Bir Protokol

5 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73693

⸱

21 Ekim 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Breast Oncology and Surgery, The Second Hospital of Dalian Medical University, 2State Key Laboratory of Medical Proteomics, Dalian Institute of Chemical Physics, 3Department of Pathology, The Second Hospital of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, Transwell ko-kültürü ve 3D tümör sferoitlerini birleştiren basitleştirilmiş çok hücreli bir in vitro kan-tümör bariyeri (BTB) modeli kurarak, meme kanseri beyin metastazının incelenmesi ve hedefli terapilerin taranması için fizyolojik olarak uygun bir platform sağlamaktadır.

Özet

Meme kanseri beyin metastazları (BCBM) için etkili tedaviler, büyük ölçüde kan-tümör bariyerinin (BTB) birçok kemoterapötik ve hedefli ajanın merkezi sinir sistemindeki metastatik lezyonlara girişini kısıtlaması nedeniyle sınırlı kalmaya devam etmektedir. Bu karmaşık mikroçevrenin seçili özelliklerini in vitro modellemek için bu çalışma, basitleştirilmiş çok hücreli üç boyutlu bir BTB modeli oluşturmaya yönelik standart bir protokol sunmaktadır. Yöntem üç temel adımdan oluşmaktadır. İlk olarak, 0.4 μm gözenek boyutuna sahip hücre kültürü insertleri kullanılarak bir kan-beyin bariyeri (BBB) kompartımanı oluşturulur. Poröz membranın bazal tarafına insan beyin mikrovasküler endotel hücreleri (HBMECs) ekilir ve 1 gün sonra apikal tarafa insan astrositleri (HA) ve insan mikroglial HMC3 hücreleri (HMC3) ekilir. Örnek olarak SK-BR-3 hücreleri kullanılarak, meme kanseri hücreleri 3 günlük kültürden sonra tekdüze, düzenli şekilli 3D tümör sferoidleri oluşturmak amacıyla asılı damla yöntemiyle kültüre edilir. Sferoidler daha sonra, ko-kültür sırasında bariyer hücreleri ile tümör sferoidleri arasında kimyasal iletişime izin verirken fiziksel ayrım sağlayan, bazal membran matriksi ile kaplanmış poröz bir membranın apikal tarafına aktarılır. Bu platform, deneysel zaman çizelgesinin hassas kontrolüne olanak tanır ve endotel bariyer bütünlüğünün ve parasellüler geçirgenliğin değerlendirilmesine izin verirken, peritümöral reaktif yanıtla tutarlı astrositik morfolojik ve marker değişiklikleri üretir.

Giriş

Beyin metastazı, meme kanseri ve akciğer kanseri dahil olmak üzere çeşitli malign solid tümörlerin geç evrelerinde görülen yaygın bir komplikasyondur1,2. Prognozu oldukça kötüdür ve tedavi seçenekleri sınırlıdır1,2. Sağlıklı merkezi sinir sisteminde kan-beyin bariyeri (KBB), öncelikle sıkıca birbirine bağlı beyin mikrovasküler endotel hücreleri tarafından oluşturulan, oldukça özelleşmiş ve dinamik bir ara yüzeydir; bütünlüğü ve işlevi ise vasküler bazal membran ile perisitler, astrositler, nöronlar, mikroglia, oligodendrosit soyundan gelen hücreler ve nörovasküler ünitenin diğer bileşenleri ile koordineli etkileşimler tarafından desteklenir3. Endotel hücreleri arasındaki sıkı bağlantılar ve periferik glial hücrelerin yardımıyla, eksojen maddelerin merkezi sinir sistemine girişini kesin olarak kısıtlar4. Meme kanseri hücreleri beyne yayılıp yerleştikten sonra, beyin metastatik lezyonları genişler, lokal hipoksi artar, inflamatuar sinyaller yoğunlaşır ve nörovasküler ünite (NVU) yeniden şekillenerek kademeli olarak kan-tümör bariyerini (KTB) yeniden oluşturur5. KTB'nin lokal geçirgenliği KBB'ninkinden daha yüksek olsa da, farklı boyutlardaki moleküllere karşı geçirgenlik farkları ve buna eşlik eden düzensiz kan perfüzyonu, beyin tümörlerinde zayıf ilaç birikimine yol açar6. Bu nedenle, KTB biyolojisini anlamak ve bu bariyeri aşabilen iletim stratejileri geliştirmek, nöro-onkolojide önemli öncelikler haline gelmiştir.

Bugüne kadar, BTB'nin özellikleri ve transformasyon mekanizmaları yalnızca kısmen tanımlanabilmiş olup, meme kanseri beyin metastazı (BCBM) için etkili ilaç seçenekleri klinik uygulamalarda sınırlı kalmaya devam etmektedir. Zorluklardan biri, beyin metastazlarından elde edilen klinik örneklerin kısıtlı erişilebilirliğinin yanı sıra, mevcut BTB modellerinin sınırlı mevcudiyeti ve eksik fonksiyonel karakterizasyonudur. In vivo hayvan modelleri, özellikle de fare modelleri7,8, BTB araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir. Ancak bu modeller; tür farklılıkları, düşük verimlilik, standardizasyon ve tekrarlanabilirlik zorlukları gibi sınırlamalara sahiptir ve bu durum mekanistik çalışmaları ve ilaç geliştirmeyi engelleyebilir9,10. Ayrıca, mevcut in vitro BTB modelleri genellikle hücre kültürü insert sistemlerinde veya mikroakışkan çiplerde tümör hücreleri ile bariyerle ilişkili hücrelerin ko-kültürlerini kullanmaktadır.

Mevcut modeller genellikle tümörlerin üç boyutlu yapısından yoksundur ve bu nedenle hücre yoğunluğu gradyanları, hipoksik/nekrotik bölgeler, kısıtlı moleküler difüzyon ve heterojen hücresel dağılım dahil olmak üzere beyin metastazlarıyla ilgili uzamsal özelliklerin yeniden üretilmesinde sınırlı kalmaktadırlar11,12. Tanımlanmış üç boyutlu bir tümör bileşeni eklemek için basit, tekrarlanabilir ve tarama uygulamalarıyla uyumlu bir sferoid model kullandık. Bunun üzerine, basitleştirilmiş çok hücreli bir insan in vitro KKB bölmesi geliştirdik ve bunu, beyin metastatik mikroçevrenin seçilmiş yapısal ve hücresel özelliklerini yakalayan basitleştirilmiş bir BTB modeli (Şekil 1A) oluşturmak için tümör sferoidleriyle entegre ettik. Modelin işletimi kolaydır, kantitatif bariyer ölçümlerini destekler ve tümörle ilişkili astrositik ve mikroglial popülasyonlardaki uzamsal değişikliklerin görselleştirilmesine olanak tanır.

Bu protokol; hücre hazırlama ve ekiminden tümör sferoid oluşturulmasına, bazal membran matrisi kaplamasına, eşleştirilmiş kontrol hazırlığına ve sferoid transferine kadar olan kritik adımları detaylandırarak, bu basitleştirilmiş BTB modelinin oluşturulması için standartlaştırılmış bir iş akışı sunmaktadır.

Protokol

Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu ilkelerine uygun olarak yürütülmüş ve Dalian Tıp Üniversitesi İkinci Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay No. JW2026-019-01). Tüm hasta ile ilgili veriler analiz öncesinde anonim hale getirilmiştir. Bu protokolde kullanılan araştırma araçları Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Kan-beyin bariyeri (KBB) modelinin hazırlanması

  1. Genel gereksinimler
    1. Tüm işlemleri steril bir laminer akış kabininde gerçekleştirin ve aseptik tekniğe kesinlikle uyun.
    2. 0.4 µm gözenek boyutuna ve 1.12 cm2 efektif membran alanına sahip PET membranlı 12 kuyucuklu hücre kültürü insertleri kullanın.
  2. Kolajen tip I kaplama
    1. Her bir kültür flaskına veya kabına 1–2 mL kolajen tip I kaplama çözeltisi ekleyin ve alt yüzeye eşit şekilde dağıtın.
    2. Her bir hücre kültürü insertinin apikal ve bazal taraflarına sırasıyla 200 µL ve 800 µL kaplama çözeltisi ekleyin. Membran altında hava kabarcığı oluşumunu önleyerek, membranla tam temas sağlandığından emin olmak için plakayı hafifçe çalkalayın.
    3. Kaplanmış kapları ve insertleri 37 °C'de %5 CO₂ ile 1 saat inkübe edin. Kaplama çözeltisini uzaklaştırın ve PBS ile iki kez yıkayın.
    4. Kaplanmış flaskları, kapları ve hücre kültürü insertlerini 37 °C'de %5 CO₂ ile muhafaza edin ve 3 gün içinde kullanın. Kullanmadan hemen önce bir kez PBS ile durulayın.
    5. Hücre kültürü öncesinde HBMEC ve HA kültür kaplarını kolajen tip I ile kaplayın. HMC3-RFP hücreleri kolajen tip I kaplama gerektirmez.
  3. Kolajen tip I kaplama çözeltisinin hazırlanması
    1. 60 µL glacial asetik asidi 50 mL ultrapure su içerisinde çözün ve çözeltiyi 4 °C'de soğutun.
      DİKKAT: Glacial asetik asit korozif bir maddedir. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması dahil uygun kişisel koruyucu donanım kullanarak, kimyasal çeker ocak içerisinde işlem yapın. Asetik asit atıklarını kurumun kimyasal atık prosedürlerine göre bertaraf edin.
    2. Çözeltiyi 0.22 µm'lik bir şırınga filtresinden süzün, 500 µL kolajen tip I (9.45 mg/mL) ekleyin, iyice karıştırın ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
  4. Hücre hazırlığı
    1. HBMEC, HA ve HMC3-RFP hücrelerini kullanmadan önce %80–%90 konfluense ulaşana kadar kültüre edin.
      DİKKAT: İnsan kaynaklı hücre hatları ve insan dokusuyla ilişkili materyaller potansiyel biyotehlike olarak ele alınmalıdır. Kurumsal biyogüvenlik prosedürlerini izleyin ve uygun kişisel koruyucu donanım kullanın. Kontamine olmuş kültür materyallerini biyotehlikeli atık olarak bertaraf edin.
  5. 0. Gün HBMEC ekimi
    1. HBMEC'leri rekombinant tripsin benzeri proteaz (1×) kullanarak ayırın, hücreleri santrifüjleyin ve tek hücre süspansiyonu elde etmek için peleti resüspande edin.
    2. Hücre yoğunluğunu belirleyin ve her bir hücre kültürü inserti için 120 µL'nin 1.5 × 105 HBMEC içerecek şekilde süspansiyonu ayarlayın.
    3. Plakayı ters çevirin ve gözenekli membranın bazal tarafına 120 µL HBMEC süspansiyonu dağıtın. Ekim sırasında hava kabarcığı oluşumundan kaçının (Şekil 1B).
    4. Kuyucukların üzerini kapatın, 12 kuyucuklu plakayı ters konumda tutun ve 6 saat inkübe edin.
    5. Plakayı düz konuma getirin, üst ve alt bölmelere sırasıyla 200 µL ve 800 µL ECM komple kültür medyumu ekleyin ve inkübasyona devam edin.
  6. 1. Gün HA ve HMC3-RFP hücre ekimi
    1. HA hücrelerini rekombinant tripsin benzeri proteaz (1×) ile, HMC3-RFP hücrelerini ise %0.25 tripsin-EDTA ile ayırın. İki hücre tipini ayrı ayrı santrifüjleyin ve resüspande edin.
    2. Hücre yoğunluklarını belirleyin ve her bir hücre kültürü inserti için 2.0 × 105 HA hücresini 4.0 × 103 HMC3-RFP hücresi ile birleştirin.
    3. Karıştırılmış hücreleri santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve peleti 200 µL karışık komple medyumda (AM komple medyum: MEM komple medyum = 5:1) resüspande edin. 200 µL süspansiyonu, hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat ederek üst bölmeye eşit şekilde ekleyin (Şekil 1B). 
    4. Alt bölmeye 800 µL ECM komple kültür medyumu ekleyin, plakayı inkübatörde düz konumda tutun ve medyumu günlük olarak değiştirin.

2. Üç boyutlu tümör sferoidlerinin hazırlanması

  1. SK-BR-3 hücrelerinin hazırlanması
    1. Sferoid oluşumuna geçmeden önce, SK-BR-3 hücrelerini %80-%90 konfluense ulaşana kadar kültüre edin.
    2. SK-BR-3 hücrelerini %0,25'lik tripsin-EDTA ile ayırın, hücreleri santrifüjleyin ve tek hücre süspansiyonu elde etmek için peleti yeniden süspanse edin.
    3. Hücre yoğunluğunu belirleyin ve süspansiyonu, her birinin 30 µL damlacık 2 adet içerir × 104 hücreler
  2. Asılı damlacıkların oluşturulması
    1. 10 cm'lik bir hücre kültür kabını ters çevirin ve dağıtın 30 µL hücre süspansiyonundan damlaları petri kabı kapağına damlatın. Her kapağa yaklaşık 20 damla yerleştirin.
    2. Kabın altını yerleştirin ve birleştirilmiş kabı hızla ters çevirin (Şekil 1B). Damlacıklar kapaktan sızarsa veya şekillerini kaybederse, damlacıkları yeniden hazırlayın.
  3. Sferoid kültürü
    1. Kaba 5 mL PBS ekleyin ve inkübatöre yerleştirin. Kültürün ilk 2 günü boyunca kaba müdahale etmeyin.
    2. Uzun süreli kültür için şunları ekleyin: 10 µL her 2 günde bir her damlacığa tam kültür ortamı ekleyin.
    3. Pipet ucuyla her bir damlanın kenarından besiyeri ekleyin ve tümör sferoitlerine temas etmekten kaçının.

3. Basitleştirilmiş kan-tümör bariyeri (BTB) modelinin hazırlanması

  1. Materyallerin hazırlanması
    1. Gerekli hücre kültürü kaplarını ve hücre kültürü insertlerini (PET membran, 0.4 µm gözenek boyutu) kolajen tip I ile kaplayın ve kullanıma kadar inkübatörde muhafaza edin.
    2. 200 µL pipet uçlarının uçlarını makasla kesin ve modifiye edilmiş uçları otoklavlayarak sterilize edin.
  2. Modelin kurulması
    1. 0–1. Gün: BBB modelini kurun ve tümör sferoitlerini yukarıda açıklandığı şekilde hazırlayın.
    2. 2. Gün: Bazal membran matriksini buz üzerinde çözdürün. Her iki bölmedeki kültür ortamını uzaklaştırın ve her iki bölmeyi PBS ile yıkayın.
    3. Alt bölmeye 800 µL ECM tam besiyeri ve üst bölmeye 30 µL çözülmüş bazal membran matriksi ekleyin. Bazal membran matriksini gözenekli membran üzerine eşit şekilde yayın.
    4. Plakayı 37 °C'de 20 dk inkübe edin, ardından 200 µL karışık tam besiyerini (AM:MEM = 5:1) üst bölmenin yan duvarı boyunca yavaşça ekleyin. Plakayı inkübatöre geri yerleştirin (Şekil 1B).
    5. Bazal membran matriksini buz üzerinde tutun ve hızlı çalışın. Bazal membran matriksini aspire ederken önceden soğutulmuş bir pipet ucu kullanın.
  3. Eşleştirilmiş sferoit içermeyen/bazal membran matriksi kontrolü
    1. BTB durumuyla aynı bazal membran matriksi hacmi (30 µL), besiyeri kompozisyonu, yıkama basamakları, inkübasyon süreleri ve günlük besiyeri değişim programını kullanarak kontrol insertlerini hazırlayın, ancak 3. Gün'deki tümör sferoit transferini atlayın. Böylece, eşleştirilmiş kontrol grubu, BTB durumundan bazal membran matriksi maruziyeti veya işleminden ziyade, tümör sferoitlerinin varlığı veya yokluğu ile ayrılır.
  4. 3. Gün'de tümör sferoitlerinin transferi
    1. Tümör sferoitlerini dik bir mikroskop altında inceleyin ve düzenli şekilli olduklarını ve kompakt sferoitler oluşturduklarını doğrulayın.
    2. Tümör sferoitlerini ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak 1.5 mL mikro santrifüj tüplerine aspire edin ve PBS ile iki kez yıkayın. Parçalanmayı önlemek için sferoitleri nazikçe taşıyın.
    3. Alt bölmedeki besiyerini yenileyin ve üst bölmedeki kültür ortamını uzaklaştırın.
    4. Ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak her bir üst bölmeye beş tümör sferoidi transfer edin.
    5. Üst bölmeye 200 µL karışık tam kültür besiyeri (AM:MEM = 5:1) ekleyin ve sferoitlerin birbirine temas etmesini veya birleşmesini önlemek için plakayı nazikçe sallayın (Şekil 1B).
    6. Plakayı inkübatörde tutun ve besiyerini günlük olarak değiştirin.
  5. Numune toplama
    1. Sonraki deneyler için 7. Gün'de numuneleri toplayın veya toplama süresini deneysel gereksinimlere göre ayarlayın.

4. Transendotelyal elektriksel direnç (TEER) ölçümü

  1. Elektrot hazırlığı
    1. TEER ölçüm cihazını tamamen şarj edin ve chopstick elektrotlarını 15 dk boyunca %75'lik etanol içinde bekletin.
      UYARI: Etanol yanıcıdır. %75'lik etanolü açık alevlerden, kıvılcımlardan ve diğer tutuşma kaynaklarından uzak tutun ve kurumsal kimyasal güvenlik prosedürlerine uygun olarak kullanın.
    2. Sterilizasyon için biyogüvenlik kabinini 30 dk boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakın. Elektrotları doğrudan ultraviyole ışınımına maruz bırakmayın.
    3. Elektrotları etanolden çıkarın, 15 dk boyunca PBS içinde dengeleyin ve steril koşullar altında kurulayın.
  2. Hücre kültürü insertlerinin dengelenmesi
    1. Hücre kültürü insertlerini içeren 12 kuyucuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve ölçümden önce 15 dk boyunca oda sıcaklığında bekletin.
  3. Direnç ölçümü
    1. Üst ve alt kompartımanlara sırasıyla 200 µL ve 800 µL aynı komple kültür ortamı ekleyerek hücre içermeyen bir boş hücre kültürü inserti hazırlayın.
    2. Chopstick elektrotlarını, gözenekli membrana veya kuyucuk tabanına değdirmeden, hücre kültürü insertinin kenarı boyunca nazikçe yerleştirin.
    3. Elektrotları PBS ile durulayın ve kurulayın. Hücre içeren her bir inserti aynı prosedürü kullanarak ölçün ve direnci R₍measured₎ olarak kaydedin.
  4. TEER hesaplaması
    1. Transendotelyal elektriksel direnç (TEER) değerini aşağıdaki formülü kullanarak hesaplayın13:
      TEER (Ω·cm²) = (R(measured) − R(blank) × S    (1.1)
    2. R(measured) hücre tabakasını içeren gözenekli membran boyunca ölçülen dirençtir (Ω); R(blank) hücre içermeyen gözenekli bir membran boyunca ölçülen dirençtir (Ω) ve S efektif membran alanıdır (cm2). Bu çalışmada kullanılan efektif membran alanı 1,12 cm2’dir.

5. FITC-dekstran parasellüler geçirgenlik testi (apikalden bazale yönlü)

  1. FITC-dekstran hazırlığı
    1. Deneyden önce 2 mg/mL FITC-dekstran (4 kDa) çalışma çözeltisi hazırlayın ve ışıktan koruyun.
  2. Analiz yönünün yorumlanması
    1. HBMEC'ler membranın bazal yüzüne tutunmuşken astrositler, mikroglialar ve tümör sferoitleri apikal bölmede yer aldığından, mevcut analizi apikalden bazale doğru bir parasellüler bariyer bütünlüğü okuması olarak yorumlayın.
      NOT: Sistemik maruziyeti taklit etmeyi amaçlayan çalışmalar için, FITC-dekstranı veya test bileşiğini alt/bazal endotel yüzeyli bölmeye ekleyin ve ayrı ayrı valide edilmiş bir örnekleme şeması ve Papp hesaplaması kullanarak üst/apikal bölmeden örnekler toplayın.
  3. Yıkama ve dengeleme
    1. Her iki bölmedeki tüm kültür ortamını uzaklaştırın. Üst ve alt bölmelere sırasıyla 400 µL ve 1 mL ön ısıtılmış glukozsuz DMEM bazal ortam ekleyin, nazikçe bir kez yıkayın ve ortamı dökün.
    2. Üst ve alt bölmelere sırasıyla 400 µL ve 1 mL taze ön ısıtılmış glukozsuz DMEM bazal ortam ekleyin. 37 °C'de %5 CO₂ ile 15 dk dengeleyin ve ardından tüm sıvıyı aspire edin.
  4. Geçirgenlik ölçümü
    1. Apikal tarafa 200 µL 2 mg/mL FITC-dekstran çalışma çözeltisi ve alt bölmeye 800 µL glukozsuz DMEM bazal ortam ekleyin. 37 °C'de %5 CO₂ ile 30 dk boyunca karanlıkta inkübe edin.
    2. 30 dk sonra her bir deneysel insertin alt bölmesinden 100 µL ortam toplayın. Her insertten üç alikotu siyah bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve ışıktan koruyun.
  5. FITC-dekstran standart eğrisinin hazırlanması
    1. 0, 0.5, 1.0 ve 1.5 mg/mL konsantrasyonlarında FITC-dekstran standartları hazırlayın. Her bir standarttan 100 µL'yi siyah bir 96 kuyucuklu plakaya üç tekrarlı olarak ekleyin ve plakayı ışıktan koruyun.
  6. Floresans ölçümü ve Papp hesaplaması
    1. Çok fonksiyonlu bir mikroplaka okuyucu kullanarak 492 nm eksitasyon dalga boyunda ve 520 nm emisyon dalga boyunda floresans yoğunluğunu ölçün. Verileri kaydedin ve aşağıdaki denklemleri kullanarak görünür geçirgenlik katsayısını (Papp) hesaplayın14.
    2. Öncelikle, bir standart eğri oluşturmak için FITC-dekstran standart çözeltilerinin konsantrasyonlarını (C), karşılık gelen floresans yoğunluklarına (A) karşı lineer olarak uydurun:
       A = kC + b    (1.2)
    3. Burada, k standart eğrinin eğimini ve b kesim noktasını temsil eder.
    4. Ardından, t zamanında ölçülen örneğin floresans yoğunluğunu (At), t zamanındaki bazolateral taraftaki FITC-dekstran konsantrasyonunu (Ca) elde etmek için standart eğri denklemine yerleştirin. Daha sonra Papp (cm/s) değerini hesaplamak için Ca değerini aşağıdaki formüle yerleştirin:
    5. Papp = (Ca × Va)/(t × S × C0)  (1.3)
    6. Burada, Va toplam bazolateral hacimdir (mL); t permeasyon süresidir (s); S gözenekli membranın etkin alanıdır (cm2); ve C₀ apikal taraftaki başlangıç konsantrasyonudur.

6. İmmünofloresan boyama

  1. Fiksasyon, yıkama ve permeabilizasyon
    1. Hücre kültürü insertlerindeki tüm kültür ortamını uzaklaştırın, PBS ile iki kez yıkayın ve kalan tüm sıvıyı aspire edin.
    2. Üst ve alt bölmelere sırasıyla 200 µL ve 800 µL %4 paraformaldehit ekleyin ve hücreleri 4 °C'de gece boyunca fikse edin.
      DİKKAT: Paraformaldehit tehlikelidir; eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması takılıyken sertifikalı bir kimyasal çeker ocak altında kullanılmalıdır. Paraformaldehit atıklarını ayrı olarak toplayın ve kurumsal tehlikeli atık prosedürlerine göre imha edin.
    3. Paraformaldehiti uzaklaştırın ve üst ve alt bölmelere sırasıyla 200 µL ve 800 µL PBS ekleyin. Bir çalkalayıcı üzerinde her biri 5 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın.
    4. Üst ve alt bölmelere sırasıyla 200 µL ve 800 µL %0,5 noniyonik sürfaktan ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca permeabilize edin.
    5. Noniyonik sürfaktan çözeltisini uzaklaştırın ve PBS ile her biri 5 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın.
  2. Membran eksizyonu ve bloklama
    1. Hücre kültürü insertlerini bir hücre kültürü kabı kapağının üzerine ters çevirin, gözenekli membranları kenarları boyunca bir skalpel ile dikkatlice kesin ve 24 kuyucuklu plakaya aktarın.
    2. Her bir membranı kaplayacak şekilde 200 µL PBS içinde %3 BSA ekleyin ve oda sıcaklığında 90 dakika boyunca bloklayın. Gerekiyorsa, ayrı boyama işlemleri için membranları daha küçük parçalara bölün.
  3. Birincil antikor inkübasyonu
    1. Birincil antikorları standart antikor dilüent ile seyreltin ve her bir membranı tamamen kaplayacak kadar çözelti ekleyin.
    2. Buharlanmayı azaltmak için çevredeki boş kuyucuklara ultrapure su ekleyin ve örnekleri 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Spesifik birincil antikor içermeyen örnekleri negatif kontrol olarak kullanın.
    3. Ertesi gün birincil antikor çözeltisini uzaklaştırın ve membranları bir çalkalayıcı üzerinde 1 mL PBS ile her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın.
  4. İkincil antikor ve DAPI boyaması
    1. İkincil antikorları ışık korumalı koşullar altında floresan antikor dilüent ile seyreltin, membranları tamamen kaplayın ve oda sıcaklığında 90 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan korunarak PBS ile her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın.
    2. Membranları kaplayacak şekilde kullanıma hazır DAPI boyama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan korunarak PBS ile her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın.
  5. Şeffaflaştırma, montaj ve görüntüleme
    1. Membranları kaplayacak uygun hacimde 3D hücre kültürü şeffaflaştırma reaktifi ekleyin ve ışık korumalı koşullar altında oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
    2. Membranları oftalmik pensle lamlara aktarın, antifade montaj medyumu ekleyin ve örnekleri ışık korumalı koşullar altında monte edin. Örnekleri konfokal lazer taramalı mikroskop kullanarak gözlemleyin ve görüntüleyin.

7. İstatistiksel raporlama

  1. Fonksiyonel karşılaştırmalar için, n = 3 her koşul başına üç bağımsız biyolojik tekrara karşılık gelir ve her biyolojik tekrar deneysel birim olarak kabul edilmiştir. Tüm üç biyolojik tekrara ait bireysel veri noktaları verilmiştir. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Karşılaştırmalar, kesin t ve p değerleri kullanılarak iki uçlu bağımsız Student t-testleri ile gerçekleştirilmiştir.

figure-protocol-1
Şekil 1: BTB modelinin şematik gösterimi ve kurulum iş akışı. (A) HBMEC'ler gözenekli hücre kültürü insert membranının bazal tarafına ekilirken, HA hücreleri ve HMC3-RFP hücreleri apikal tarafa dağıtılmıştır. Tümör sferoidlerini bariyer hücre bölmesinden ayırmak için bir bazal membran matrisi tabakası kullanılmıştır. Eşleştirilmiş sferoid içermeyen kontrol için aynı bazal membran matrisi kaplaması ve işlemleri uygulanmış, ancak tümör sferoidleri eklenmemiştir. (B) Üstteki daire içindeki sayılar karşılık gelen kültür günlerini göstermektedir. BBB kurulumu ve tümör sferoid hazırlığı eş zamanlı olarak gerçekleştirilmiştir. Hücre kültürü insertinin üst yüzeyine bir bazal membran matrisi tabakası eklendikten sonra, tümör sferoidleri kesilmiş bir pipet ucu kullanılarak üst hazneye aktarılmıştır. BTB modeli, örnek toplama işleminden önce 1 haftaya kadar kültürde tutulmuştur. Örnekler normal şartlarda, sonraki deneyler için 7. Günde toplanabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Sonuçlar

Eşleştirilmiş sferoid içermeyen BBB kontrolünde, aynı miktarda bazal membran matriksi ile kaplandığında HMC3-RFP sinyalleri apikal hücre tabakası boyunca görece yaygın şekilde dağıldı (Şekil 2). BTB koşulunda, son nokta görüntülerinde HMC3-RFP sinyalleri özellikle tümör sferoidleriyle kaplı olmayan bölgelerde görüldü; sferoidlerin altında ve hemen bitişik bölgelerde sinyal azalmıştı (Şekil 2). Bu veriler, tümör sferoidlerinin varlığı ile HMC3-RFP hücrelerinin son nokta dağılımı arasında bir mekânsal ilişki olduğunu göstermektedir. Sferoidlerin eklenmesinden önceki temel HMC3-RFP dağılımı ve uzunlamasına hücre izleme değerlendirmeleri yapılmadığından, mevcut veriler aktif mikroglia göçü, itme ya da tümörle sürülmeyi doğrulamamaktadır.

Astrositler ayrıca BTB koşulunda işaretleyici sinyal ve morfoloji açısından farklılıklar gösterdi (Şekil 2). Eşleştirilmiş sferoid içermeyen/bazal membran matriks kontrolüne kıyasla, temsili görüntüler peri-sferoid ve distal bölgelerde daha güçlü GFAP floresansı gösterdi. Sferoid kenarındaki astro sitler, hücre gövdelerinin büyümesi, daha kalın ve uzun süreçler ile sferoid kenarına doğru yönelmiş süreçler sergiledi (Şekil 2). Bu son nokta özellikleri reaktif astrostatik benzeri bir fenotipi göstermektedir; ancak bunlar tek başlarına spesifik bir reaktif astrogliyoz programını ya da bu programın altında yatan mekanizmayı doğrulamaz. İnsan meme kanseri beyin metastaz doku kesitlerinde morfolojik olarak benzer peritümöral astrositik yapılar gözlemlenmiştir ve immünofloresan boyama, peritümöral reaktif astrogliyozla uyumlu özellikleri göstermiştir.Şekil 3A). AQP4 ile ilişkili astrositik özellikleri daha ayrıntılı karakterize etmek amacıyla, AQP4 immünofloresan boyaması eşleştirilmiş sferoid içermeyen BBB modelinde ve BTB modelinin distal ile peri-sferoid bölgelerinde yapıldı (Şekil 3B). BBB modelinin, BTB modelinin distal bölgesinin ve tümör sferoidlerine bitişik peri-sferoid bölgesinin temsili görüntüleri sırasıyla birinci, ikinci ve üçüncü satırlarda gösterilmiştir (Şekil 3B). BTB modelinde, peri-sferoid astrositler distal astrositlere kıyasla morfolojik farklılıklar gösterdi. Birlikte değerlendirildiğinde, GFAP/AQP4 ve morfolojik gözlemler bu modeldeki tümör-sferoidiyle ilişkili astrositik yeniden yapılanmayı desteklemektedir; hastaya ait dokuyla benzerlik, modelin insan peritümoral astrogliyozunu tamamen yeniden ürettiğine dair kanıt olarak değil, fenotipik benzerlik olarak yorumlanmalıdır.

Tümör-sferoidiyle ilişkili endotelyal bağlantı organizasyonundaki değişiklikleri değerlendirmek amacıyla, basitleştirilmiş BBB ve BTB modellerindeki bazal HBMEC katmanında, eşleştirilmiş sferoid içermeyen ve sferoid içeren koşulların eşit miktarda bazal membran matriksi ile kaplanması sonrasında, sıkı bağlantı proteini ZO-1'in immünofloresan boyamasını gerçekleştirdik. Konfokal görüntüleme, tümör sferoidlerine karşılık gelen bölgeye odaklandı.Şekil 4A). Eşleştirilmiş sferoid içermeyen kontrolde, HBMEC'ler arasındaki ZO-1 sinyalleri göreceli olarak sürekli, çizgisel bir dağılım göstermekte ve hücreler arası sınırlar belirgindi. BTB koşulunda, tümör sferoidlerine karşılık gelen bölgelerde ZO-1 floresansı daha seyrek görülüyordu ve odaklanmış bozulmalar ve süreksizlikler mevcuttu (Şekil 4A). Bu son nokta görüntüler, sıkı bağlantı organizasyonunun lokal kaybıyla uyumludur. Ancak ek BTB'ye özgü moleküler belirteçler veya mekanistik bozucu deneyler olmadan, mevcut veriler spesifik BTB yeniden yapılanmasını, spesifik olmayan tümör-ilişkili endotel hasarı veya bariyer bozulmasından ayırt edemez.

İşlevsel düzeyde, TEER ölçümü ve FITC-dextran geçirgenlik analizleri, 7. Günde eşleştirilmiş sferoid içermeyen/bazal membran matriks kontrolü ve sferoid içeren BTB koşulu üzerinde eşzamanlı olarak gerçekleştirildi (Şekil 4B). Üç bağımsız biyolojik tekrarın her birinden elde edilen bireysel değerler, dağılım grafiği noktaları olarak gösterilmiştir. Şekil 4B, özet veriler ortalama olarak sunulmuştur ± SD. BTB koşulunun TEER değeri (106,0 ± 9.5255 Ω·cm2, n = 3 bağımsız biyolojik replika) eşleştirilmiş kontrolünkinden (168,0) daha düşüktü ± 5.1325 Ω·cm2, n = 3 bağımsız biyolojik tekrar). Tutarlı bir şekilde, apikal-koval FITC-dekstran deneyinde ölçülen görünür permeabilite katsayısı (Papp), BTB koşulunda daha yüksek bulundu (5,851) ± 1.2080 × 10⁻3 cm/s, n = 3 bağımsız biyolojik tekrar) ile eşleştirilmiş kontroldekinden (2.656 ± 1.0937 × 10⁻3 cm/s, n = 3 bağımsız biyolojik replike). İki yönlü eşleştirilmemiş Student’s t-testleri istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterdi [TEER: t(4) = 9,920, p = 0,0006; Papp: t(4) = 3,395, p = 0.0274] (Şekil 4B). Bu deneysel düzende, elektriksel direncin eşzamanlı azalması ve FITC-dekstran geçirgenliğinin artması, tümör sferoidlerinin varlığında bariyer bütünlüğünün azaldığını göstermektedir. Bu ölçümler tek başına BBB'den BTB'ye geçişte spesifik bir remodelling mekanizması ortaya koymaz ve apikal- bazal FITC-dekstran deneyi, fizyolojik kan-tümör ilaç taşıma deneyi olarak yorumlanmamalıdır.

figure-results-1
Şekil 2: BTB modelinde immünofloresan boyama. Eşleştirilmiş sferoid içermeyen BBB kontrolü ve BTB modelinde, her ikisine eşit miktarda bazal membran matriksi eklenmiş şekilde, apikal hücre tabakalarında Pan-CK ve GFAP boyamalarının temsili immünofloresans görüntüleri; HMC3-RFP sinyali de gösterilmiştir. İlk sütun şematik çizimleri sunmakta olup, siyah kare konfokal görüntüleme için izlenen alanı belirtmektedir. İlk satır sferoid içermeyen eşleştirilmiş kontrolü (Sferoid Yok); ikinci satır BTB modelinde tümör sferoidlerinden uzak bölgeleri (Uzak Bölge); üçüncü satır ise BTB modelinde tümör sferoidlerine komşu bölgeleri (Sferoid Çevresi Bölge) göstermektedir. Oklar, reaktif fenotipe uygun astrosit morfolojik özelliklerini sergileyen bölgeleri işaretlemektedir. Hücre çekirdekleri DAPI (mavi) ile karşıt boyanmış, tümör hücreleri pan-sitokeratin (Pan-CK; yeşil) ile etiketlenmiş, RFP ifade eden mikroglialar kırmızı renkte gösterilmiş ve GFAP boyaması cyan renkte gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 µm. Lütfen bu şeklin daha büyük halini görmek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 3: İmmünofloresan boyama, BTB modelinde peritümöral reaktif astrogliyozla uyumlu morfolojik özellikleri gösterir. (A) Meme kanseri beyin metastazları olan hastalardan alınan beyin doku kesitleri H&E boyama. Tümör dokusu ile beyin parankimi ya da damarlar arasındaki arayüzdeki astrositik yapılar, peritümöral reaktif astroglioz ile uyumlu morfolojik özellikler gösterdi. Siyah oklar, temsili bölgeleri göstermektedir. İmmünofloresan boyama ayrıca reaktif fenotip ile uyumlu astrositik morfolojik özellikleri ortaya koydu; kırmızı ok, temsili bir bölgeyi vurgulamaktadır. Ölçek çubukları: 50 µm H için&İlk satırdaki E ile boyanmış görüntüler, 10 µm H için&İkinci satırdaki E ile boyanmış görüntüler ve 50 µm, üçüncü satırdaki immünofloresan görüntüler için. (B) AQP4 immünofloresan boyama, eşleştirilmiş sferoid içermeyen BBB modelinde ve BTB modelinin distal ile peri-sferoid bölgelerinde yapıldı. İlk satır BBB modelinin temsili görüntülerini, ikinci satır BTB modelinin distal bölgesinin temsili görüntülerini ve üçüncü satır tümör sferoidlerine bitişik peri-sferoid bölgenin temsili görüntülerini göstermektedir. Oklar, peri-sferoid bölgedeki astrosit morfolojik değişikliklerini işaret etmektedir. Çekirdekler DAPI ile boyanmış ve mavi renkte gösterilmiştir, AQP4 ise sarı renkte gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 µm. Lütfen bu şeklin daha büyük halini görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 4: BTB modelinin işlevsel karakterizasyonu. (A) BBB ve BTB modellerinde bazal endotelyal hücre katmanında ZO-1'in immünofloresan boyaması, her iki modele eşit miktarda bazal membran matriksi eklenerek oluşturulmuştur. İlk sütun, konfokal görüntüleme için seçilen bölgeleri belirten siyah kutularla birlikte şematik diyagramları gösterir. İlk satır, tümör sferoidi bulunmayan (No Spheroid) BBB modelinde bazal hücre katmanının temsili görüntülerini, ikinci satır ise tümör sferoidi içeren (With Spheroid) BTB modelinde bazal hücre katmanının temsili görüntülerini gösterir. Kırmızı ok, zayıf ZO-1 floresansı ve fokal süreksizlikler gösteren bir bölgeyi işaret etmektedir. Çekirdekler DAPI ile boyanmış ve mavi renkte gösterilmiştir, ZO-1 ise yeşil renkte gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 50 µm. (B) TEER değerleri ve eşleştirilmiş sferoid içermeyen BBB kontrolü (Sferoid Yok) ile BTB koşulu (Sferoid Var) için FITC-doksan (4 kDa) görünür geçirgenlik katsayıları (Papp), her ikisi de eşit miktarda bazal membran matriksi ile kaplanmıştır. Koşul başına n = 3 bağımsız biyolojik tekrar. Üç biyolojik tekrarın her biri için bireysel veri noktaları gösterilmiştir ve özet veriler ortalama olarak sunulmuştur ± SD. FITC-dextran Papp değerleri apikal-koval yönde elde edildi. Lütfen bu şeklin daha büyük halini görmek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Konvansiyonel iki boyutlu tümör hücresi kültürleri tarafından yakalanamayan uzaysal organizasyon ve difüzyon kısıtlamalarını sağlayan üç boyutlu bir tümör bileşeni eklemek için bir sferoid model kullanılmıştır. Basitliği ve tekrarlanabilirliği, bu modeli tarama odaklı iş akışlarıyla da uyumlu hale getirmektedir. Basitleştirilmiş çok hücreli bir insan in vitro BTB modeli oluşturmak için sferoidler; beyin mikrovasküler endotel hücreleri, astrositler ve mikrogliaları içeren üç hücreli bir insan bariyer bölmesi ile birleştirilmiştir. Sistem kullanımı kolaydır, çok kuyucuklu kültüre ve kantitatif bariyer ölçümlerine uygundur (Şekil 1) ve immünofloresan boyama ile hücre morfolojisinin ve uzaysal dağılımın görselleştirilmesine olanak tanır. Gözlemlenen GFAP/AQP4 ile ilişkili astrositik değişiklikler ve bunların meme kanseri beyin metastazı dokusundaki peritümöral astrositlerle morfolojik benzerliği, bu bulgular tam insan BTB ile eşdeğerliği kanıtlamasa da, modelin seçilmiş tümör-glia-endotel etkileşimlerini incelemek için uygunluğunu desteklemektedir5.

Basitleştirilmiş çok hücreli bir insan in vitro BTB platformu oluşturmak amacıyla, tümör sferoidleri üretmek için asılı damla yöntemi kullanılmış ve bu sferoidler insan beyin mikrovasküler endotel hücreleri, insan astrositleri ve insan mikroglia ile birlikte kültürlenmiştir. Test edilen koşullar altında, tümör sferoidlerinin düşük TEER, artmış apikalden bazale FITC-dekstran geçirgenliği, değişmiş ZO-1 organizasyonu ve astrositik marker/morfolojik değişikliklerle ilişkili olduğu görülmüştür. TEER ve geçirgenlik ölçümleri, in vitro bariyer sistemlerinde bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılan yerleşik yaklaşımlardır13,14. Bu bulgular, tanımlanmış bu sistem içinde tümör sferoidi ile ilişkili bariyer bozulmasını ve glial yeniden şekillenmeyi kanıtlamaktadır. Ancak, bu BTB platformu tam bir BBB-BTB dönüşümü, aktif mikroglial göç veya BTB yeniden şekillenmesinin spesifik bir moleküler mekanizmasını kurmamaktadır. Bu nedenle platform, sistemik ilaç iletimi modellenirken yönsel olarak uygun transport analizlerine ihtiyaç duyulmakla birlikte, hipotez üretimi ve tümör-glia-endotel etkileşimlerinin kontrollü çalışmaları için yönetilebilir bir deneysel model olarak değerlendirilmelidir.

Bu basitleştirilmiş modelin birkaç önemli kısıtlaması bulunmaktadır. İlk olarak, tam nörovasküler üniteyi veya beyin-tümör mikroçevresini içermemektedir. Perisitler, nöronlar, fizyolojik olarak eksiksiz bir bazal membran/hücre dışı matris ve dolaşımdaki immün hücreler mevcut değildir. Perisitler, nörovasküler ve bariyer fonksiyonunun önemli düzenleyicileridir15,16,17, ancak primer insan perisitlerin sınırlı bulunurluğu ve lotlar arası değişkenliği nedeniyle, standart bir insan in vitro modeline dahil edilmeleri zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu model tam bir insan BTB olarak değil, basitleştirilmiş bir deneysel platform olarak tanımlanmalıdır. İkinci olarak, mevcut çalışma tek bir meme kanseri hücre hattı olarak SK-BR-3'ü kullanmaktadır. Dolayısıyla, gözlemlenen fenotipler bir bütün olarak BCBM biyolojisine genelleyemez. Genelleyebilirliği ve hasta ile olan ilgiyi belirlemek için ek meme kanseri alt tipleri, beyin tropik modelleri ve hastadan türetilmiş BCBM sferoidleri veya organoidleri ile doğrulama yapılması önemli olacaktır. Üçüncü olarak, mevcut HMC3-RFP verileri uç nokta gözlemleridir ve uzamsal paternin aktif migrasyondan, diferansiyel sağkalımdan veya önceden mevcut dağılımdan mı kaynaklandığını çözmemektedir. Bu olasılıkları ayırt etmek için boylamsal canlı hücre görüntüleme gerekecektir. Dördüncü olarak, ZO-1, TEER ve FITC-dekstran verileri bariyer bozulmasını kanıtlamaktadır ancak BTB'ye özgü yeniden şekillenmeyi spesifik olmayan endotelyal hasardan ayırt etmemektedir; ek moleküler karakterizasyon ve mekanistik kontrollere ihtiyaç vardır. Beşinci olarak, bu konfigürasyonda HBMEC'ler membranın bazal yüzeyine ekildiği için, rapor edilen apikalden-bazale FITC-dekstran analizi, fizyolojik bir kandan-tümöre transport analizinden ziyade bir bariyer bütünlüğü okumasıdır. Sistemik iletim çalışmaları, izleyiciyi veya ilacı alt/bazal endotel karşıt kompartımana tanıtmalı ve üst/apikal tümör kompartımanına doğru transportu doğrulamalıdır. Son olarak, mevcut fonksiyonel ölçümler her koşul için üç bağımsız biyolojik replikata üzerine kurulmuştur. Bu tasarım biyolojik replikasyonu teknik replikasyondan ayırsa da, bağımsız biyolojik replikata sayısının artırılması tekrarlanabilirlik değerlendirmesini daha da güçlendirecektir. Perisitler ve hastadan türetilmiş materyaller de dahil olmak üzere bu iyileştirmelerin eklenmesi, platformun fizyolojik ve translasyonel ilgisini kademeli olarak artırabilir.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması bulunmamaktadır.

Teşekkürler

Bu çalışma, Liaoning Eyaleti Eğitim Reform Projesi (JG24DB110), Dalian Yaşam ve Sağlık Rehberlik Planı Projesi (2025ZDJH01PT101), Dalian Tıp Üniversitesi İkinci Hastanesi 1+X Programı (2024LCJSYL07) ve Çin Bilimler Akademisi Dalian Kimyasal Fizik Enstitüsü ile Dalian Tıp Üniversitesi Birleşik Vakfı (DMU-2&DICP UN202509) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0.25 Trypsin-EDTA (1×) (HMC3-RFP hücrelerini ayırmak için)NCM BiotechC100C1Hücre hazırlama sırasında HMC3-RFP hücrelerini ayırmak için kullanılır.
1.5 mL santrifüj tüpleriJet BiofilCFT001015Tümör sferoitlerini toplamak, yıkamak ve işlemek için kullanılır.
12 kuyucuklu hücre kültürü plakasıJet BiofilTCP011012BBB/BTB model kurulumu sırasında 12 kuyucuklu hücre kültürü insertlerini tutmak için kullanılır.
3D hücre kültürü berraklaştırma reaktifiThermo FisherV11326Boyanmış hücre kültürü membranlarını montaj ve konfokal görüntüleme öncesinde berraklaştırmak için kullanılır.
Alexa Fluor 488 işaretli anti-tavşan sekonder antikorProteintechRGAR002Tavşan primer antikorlarının immünofloresan tespiti için kullanılan floresan sekonder antikordur.
Alexa Fluor 647 işaretli anti-fare sekonder antikorProteintechRGAM005Fare primer antikorlarının immünofloresan tespiti için kullanılan floresan sekonder antikordur.
Antikor dilüentiSolarbioA1800İmmünofloresan boyama için primer antikorları seyreltmek için kullanılır.
Anti-fade montaj medyumuSolarbioS2100Boyanmış membranları monte etmek ve görüntüleme sırasında floresan sönmesini azaltmak için kullanılır.
Astrosit Büyüme Suplementi (AGS)ScienCell1852İnsan astrositlerinin kültürü için kullanılan suplementtir.
Astrosit Medyumu (AM)ScienCell1801İnsan astrositleri için kullanılan ve karışık üst bölme medyumu bileşeni olarak kullanılan kültür medyumu.
Hücre kültürü kabıServicebioCCD-100Rutin hücre kültürü ve asılı damla tümör sferoid hazırlığı için kullanılır.
Kollajen Tip ICorning354249Hücre ekimi öncesinde kültür kaplarını ve hücre kültürü insertlerini kaplamak için kullanılır.
LamellerCitotest10212450CMontaj ve mikroskopi hazırlığı için kullanılır.
DAPI boyama çözeltisiServicebioG1012-10MLİmmünofloresan boyama sırasında nükleer karşıt boyama için kullanılır.
DMEM bazal (1×)GibcoC11995500BTFITC-dekstran geçirgenlik analizinde bazal medyum olarak kullanılır.
Endotelyal Hücre Büyüme Suplementi (ECGS)ScienCell1052İnsan beyin mikrovasküler endotelyal hücrelerinin kültürü için kullanılan suplementtir.
Endotelyal Hücre Medyumu (ECM)ScienCell1001HBMEC'ler ve BBB/BTB modelinin alt bölmesi için kullanılan kültür medyumu.
Fetal Bovin Serum (FBS)GibcoA5669701Tam hücre kültürü medyalarında kullanılan serum suplementi.
FITC işaretli Dekstran (MW 4,000)BeyotimeST2930-50mgParasellüler geçirgenliği değerlendirmek ve Papp değerini hesaplamak için kullanılan floresan izleyicidir.
Floresan antikor dilüentiSolarbioA1840İmmünofloresan boyama için floresan sekonder antikorları seyreltmek için kullanılır.
Buzul asetik asitSigma27225Kollajen tip I kaplama çözeltisini hazırlamak için kullanılır.
HAİnsan astrositNATümörle ilişkili morfolojik ve marker yanıtlarını değerlendirmek için astrositik bileşen
HBMECİnsan beyin mikrovasküler endotelyal hücreleriNABBB/BTB endotelyal bariyer bileşeni
HMC3-RFPRFP işaretli insan mikroglial hücre hattı HMC3NAFloresan izleme için mikroglial bileşen
MatrigelCorning354230Tümör sferoitlerini bariyer hücre bölmesinden ayırmak için üst katman olarak kullanılan bazal membran matrisi.
MEM (NEAA ile) Tam Medyum (10)Procell SystemPM150410BKarışık üst bölme kültür medyumu bileşeni olarak kullanılan medyum.
Mikroskop lamlarıCitotest188105Konfokal görüntüleme için kesilmiş boyalı membranları monte etmek için kullanılır.
Fare anti-insan GFAP antikoruEMD MilliporeMAB360-25μLAstrositlerde GFAP'yi immünofloresan ile tespit etmek için kullanılan primer antikordur.
ParaformaldehitServicebioG1101-500MLİmmünofloresan boyama öncesinde hücreleri fikse etmek için kullanılır.
PBS fosfat tamponlu tuzlu su tozuServicebioG0002-2LProtokol boyunca yıkama, dengeleme ve hazırlık adımları için kullanılır.
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi (P/S)ServicebioG4003-100MLTam hücre kültürü medyalarında kullanılan antibiyotik suplementi.
PipetEppendorf3123000250Hücre kültürü ve analiz prosedürleri boyunca sıvı aktarımı için kullanılır.
Pipet uçlarıMWM Bio800201Rutin sıvı aktarımı için kullanılır; tümör sferoid transferi için modifiye edilmiş kesik uçlar kullanılır.
Tavşan anti-insan PAN-CK poliklonal antikorMedChemExpressHY-P81164Tümör hücrelerini immünofloresan ile tanımlamak için kullanılan primer antikordur.
Tavşan anti-insan ZO-1 antikoruProteintech21773-1-APEndotelyal sıkı bağlantı organizasyonunu immünofloresan ile değerlendirmek için kullanılan primer antikordur.
SK-BR-3İnsan meme kanseri hücre hattıNABTB kurulumu için tümör sferoid bileşeni
Doku Kültürü Plakası Inserti (0.4 μm, PET membran), 12 kuyucuklu plakalarJet BiofilTCS016012BBB/BTB ko-kültür modelini kurmak için kullanılan gözenekli hücre kültürü inserti.
Transepitelyal Elektriksel Direnç (TEER) ÖlçerMillicellERS-2Bariyer bütünlüğü okuması olarak hücre kültürü inserti boyunca elektriksel direnci ölçmek için kullanılır.
TrypLE Express (1×) (HBMEC ve HA hücrelerini ayırmak için)Gibco12605-010Hücre hazırlama sırasında HBMEC ve HA hücrelerini ayırmak için kullanılır.

Kaynaklar

  1. Park M, et al. Breast cancer metastasis: mechanisms and therapeutic implications. Int J Mol Sci. 2022;23(12):6806. doi:10.3390/ijms23126806.
  2. Wang R, et al. The clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 2019;19(1):1091. doi:10.1186/s12885-019-6311-z.
  3. McConnell HL, Mishra A. Cells of the blood-brain barrier: an overview of the neurovascular unit in health and disease. Methods Mol Biol. 2022;2492:3–24.
  4. Dong X. Current strategies for brain drug delivery. Theranostics. 2018;8(6):1481–1493.
  5. Gril B, et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nat Commun. 2018;9(1):2705. doi:10.1038/s41467-018-05030-w.
  6. Pitz MW, Desai A, Grossman SA, Blakeley JO. Tissue concentration of systemically administered antineoplastic agents in human brain tumors. J Neurooncol. 2011;104(3):629–638.
  7. Adkins CE, et al. Characterization of passive permeability at the blood-tumor barrier in five preclinical models of brain metastases of breast cancer. Clin Exp Metastasis. 2016;33(4):373–383.
  8. Lockman PR, et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clin Cancer Res. 2010;16(23):5664–5678.
  9. Song H-T, et al. Rat model of metastatic breast cancer monitored by MRI at 3 tesla and bioluminescence imaging with histological correlation. J Transl Med. 2009;7:88. doi:10.1186/1479-5876-7-88.
  10. Miarka L, Valiente M. Animal models of brain metastasis. Neurooncol Adv. 2021;3(Suppl 5):v144–v156.
  11. Kim J-H, et al. Inflammatory mammary carcinoma with metastasis to the brain and distant organs in a spayed Shih Tzu dog. J Vet Diagn Invest. 2011;23(5):1079–1082.
  12. Wiese DA, Thaiwong T, Yuzbasiyan-Gurkan V, Kiupel M. Feline mammary basal-like adenocarcinomas: a potential model for human triple-negative breast cancer (TNBC) with basal-like subtype. BMC Cancer. 2013;13:403. doi:10.1186/1471-2407-13-403.
  13. Srinivasan B, et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 2015;20(2):107–126.
  14. Harding IC, et al. Developing a transwell millifluidic device for studying blood-brain barrier endothelium. Lab Chip. 2022;22(23):4603–4620.
  15. Liu X, et al. The role of neurovascular unit damage in the occurrence and development of Alzheimer’s disease. Rev Neurosci. 2019;30(5):477–484.
  16. Nikolakopoulou AM, et al. Pericyte loss leads to circulatory failure and pleiotrophin depletion causing neuron loss. Nat Neurosci. 2019;22(7):1089–1098.
  17. Bell RD, et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 2010;68(3):409–427.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Meme Kanseri MetastazıIn Vitro ModelBeyin Mikrovasküler EndotelyalAstrosit Ko-KültürüMikroglial HücrelerTümör SferoidleriAskı Damla YöntemiParaselüler Geçirgenlik

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.