Nötrofiller inflamatuar immün yanıt sitesinde ulaşmak için ilk hücreleri arasında olup, görevlerini ve mekanizmalar in vitro yoğun çalışmalar yapılmıştır. Biz piyasada bulunan ayırma medya kullanılarak, tam kan, insan nötrofil izole etmek için standart bir yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Polimorfonükleer nötrofil granülositler (PMN), insanlarda ve inflamatuar immün yanıt sitesinde ulaşmak için ilk hücreleri arasındaki en bol lökosit vardır. Inflamasyon kilit rol nedeniyle, hareketlilik, sitokin üretimi, fagositoz ve tümör hücre mücadele gibi nötrofil işlevlerini yoğun olarak çalışılmaktadır. Nötrofil kısa ömürlü ve toplama 2-4 saat içinde kullanılması gereken bu yana özellikle nötrofil özel fonksiyonlar karakterize için diğer kan hücreleri ayırarak, temiz, hızlı ve güvenilir bir yöntem, in vitro çalışmalar için arzu edilir. Burada, piyasada bulunan sodyum metrizoate ve Dextran'ın 500 karışımı ayırma medya kullanılarak, tam kan, insan nötrofil izole etmek için standart bir yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi göstermektedir. Prosedür yoğunluk gradiyenti orta, santrifüj, nötrofil tabakasının ayrılması ve kalıntı eritrositlerin parçalanması üzerine katman tam kan oluşur. Hücreler daha sonra, yıkanmış, sayılır ve istenilen konsantrasyon için tampon yeniden süspanse. Doğru yapıldığında, bu yöntem>>% 95 canlılığı% 95 nötrofil örnekleri verim görülmüştür.
Protokol
Nötrofil İzolasyon Protokolü
- Tüm reaktifler oda sıcaklığına getirin.
- 5.0 ml santrifüj tüpüne nötrofil izolasyon medya toplayın. Ayrılması medya üzerindeki kan dikkatlice katman 5.0 ml. Yavaş ve dikkatli bir şekilde ve medya yüzeyine yakın kan ve medya karışmasını önlemek için pipet ile bu adımı gerçekleştirin.
- 20-25 dakika süreyle 35 500 RCF santrifüjleyin ° C Plazma, monositler, izolasyon medya, nötrofiller, daha fazla izolasyon medya ve kırmızı kan hücre pelletini (Şekil 1): kan, 6 farklı bölümlere ayırmalıdır. Bu bantları açık değilse, ayırma işlemi temiz değil ve tekrar edilmesi gerekecektir.
- Bir pipet kullanarak en üst üç....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi tam kan sodyum metrizoate ve Dextran'ın 500 karışımı kullanarak insan nötrofil izole etmek için kullanılır. Bu yöntem, nötrofil ayrılması için Ferrante ve Thong (1980) tarafından güncellenmiştir Boyum (1968) tarafından mononükleer lökosit ayırma yöntemi dayanıyor.
Bir bağış toplama sonra, tam kan, EDTA, sitrat veya heparin ile antikoagüle olabilir. Kısa ömürlü olduğundan, nötrofil toplama 2-4 saat içinde kullanılmalıdır. Prosedür yoğunluk gradiyenti orta, santrifüj, nötrofil tabakasının ayrılma.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
NIH R01 HL56621 fon.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| Lymphocyte Poly(R) | Reaktif | Cedarlane Labs | Alternatif olarak PolymorphprepTM kullanılabilir | |
| Kalsiyum Klorür içermeyen Hank’s Dengeli Tuz Çözeltisi | Reaktif | Invitrogen | ||
| İnsan Serum Albümini | Reaktif | ZLB Bioplasma | ||
| Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu | Reaktif | Roche Group | ||
| Santrifüj | Araç | |||
| Vorteksleyici | Araç | |||
| Pasteur Pipetleri ve pompası | Araç | |||
| PolymorphprepTM | Reaktif | Axis-Shield | Lymphocyte-Poly (R) için alternatif reaktif | |
| Şırınga Filtresi | Diğer | EMD Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gama sterilize edilebilir |
| Kalsiyum Klorür içeren Hank’s Dengeli Tuz Çözeltisi | Reaktif | Invitrogen |
Kaynaklar
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
