Yöntem makalesi

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

DOI:

10.3791/833

⸱

15 Ağustos 2008

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alabama

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu video transgenik hayvanlar oluşturmak için C. elegans gonad içine mikroenjeksiyon tekniği göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgenik Caenorhabditis elegans gonad 1 DNA plazmid çözüm mikroenjeksiyon ile kolayca oluşturulabilir. Plazmid DNA, stabil bir şekilde olsa da gerçek kromozom 2 olarak aynı verimlilikle değil, miras alınır ekstrakromozomal concatamers oluşturmak için yeniden düzenler . Diseksiyon mikroskobu altında transgenik hayvanlar seçimi izin vermek, ilgi bir gen rol-6 ya da GFP gibi bariz bir fenotipik işaretleyici ile ortak enjekte edilir. Eksojen gen hücresel yerelleştirme çalışmaları için ana organizatörü ifade edilebilir. Alternatif olarak, transgen, bu belirli bir hücre ya da doku gen ürünü rolünü değerlendirmek için farklı bir doku-spesifik organizatörü tarafından sürülebilir. Bu teknikte verimli C. elegans germline ya da erken embriyo 3 hariç bütün dokularda gen ekspresyonu sürücüler. Transgenik hayvanlar oluşturulması, deneysel paradigmalar bir dizi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu video transgenik solucanları oluşturmak için mikroenjeksiyon işlemi göstermektedir. Ayrıca, istikrarlı transgenik C. elegans hatları seçimi ve bakım açıklanmıştır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İfade Plazmid yapı

İki plazmid gereklidir: doku özel ilgi gen ekspresyonu ve seçilebilir dönüşüm belirteci olarak ikinci bir biri.

Deneysel Plazmid

  1. Örneğin faiz doku / hücre tipi, bir sinir ya da kas-özel organizatörü olarak ifade organizatörü seçin. Aynı doku içinde birden fazla genin ifade etmek için ise, Gateway sisteminin (Invitrogen) plazmid bir yararlanıcı kaset kullanılabilir. Bu yaklaşım, recombinational klonlama 4 organizatörü faiz downstream herhangi bir gen ekleme sağlar. Genellikle 2-5 kb upstream dizilerinin doğru ve doğru ifade etmek için yeterli.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu işlemi yaparken, hatırlamak önemlidir:
- Gonad merkezi içine doğrudan enjekte
- Çok fazla sıvı enjekte
- Kuruma önlemek için hızlı bir şekilde çalışır.

Çok büyük kırık gibi iğne ile ilgili sorunlar yaşarsanız, bu daha az ideal bir iğne ile enjekte etmeye çalışıyor yerine, taze bir iğne yeniden en iyisidir.

Transgenik solucanlar nesil gibi birçok uygulama vardır:
- Mutant genlerin belirlenmesi, dönüşüm kurtarma yöntemi denir
- Kesilmiş proteinleri ifade ile protein etki haritalama
.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz tüm Caldwell Lab üyeleri işbirliği ruhu kabul etmek istiyoruz. Bachmann-Strauss Distoni ve Parkinson Vakfı, Birleşik Parkinson Vakfı, Amerikan Parkinson Hastalığı Derneği, Parkinson Hastalığı Derneği Alabama, Michael J. Fox Parkinson Araştırma Vakfı ve Lisans Araştırma laboratuarında Hareket bozuklukları araştırma tarafından desteklenmektedir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgaroseUltrapureInvitrogen15510-027
Halokarbon Yağı, VoltalefHulle 10Selfatochem, Fransa
Kapak Camı 18x18 mmFisher Scientific12-548-A
Kapak Camı 20x30 mmFisher Scientific12-548-5A
Kapak Camı 22x50 mmFisher Bilimsel12-545-E
100 ul KılcalVWR uluslararası53432-921
İğneler için Cam Kılcal"Kwik-Fil"World Precision Instruments, Inc.1B100F-4
İğne ÇektirmeAletiNarishige UluslararasıModel PP-830
microINJECTOR SistemiTritech Araştırma A.Ş.MINJ-1000Kapsam, Aşama, Manipülatör
Diseksiyon, FloresanMikroskobuile Nikon InstrumentsSMZ800
DiseksiyonMikroskobuNikon InstrumentsSMZ645

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans:....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

C elegans TransgenikMikroenjeksiyon Prosed rPlazmid DNA EnjeksiyonuFloresan Mark r Se imiGonad Mikroenjeksiyon Tekni iStabil Transgenik HatlarSolucan Se im Y ntemiFloresan Stereo MikroskopiAgaroz Ped Haz rlamane Y kleyici Haz rlama

İlgili makaleler