Bu cam mikropipetler şeklini değiştirerek bir kılavuzdur. Özellikle, ısı ve hava basıncı ile konik pipet direnci azaltmak için, ucu açıklığı artırmadan genişletilinceye. Bu küçük hücrelerin düşük gürültü kayıtları elde etmek için kritik öneme sahiptir, ancak birçok uygulamada yararlıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Geliştirilmiş Patch-kelepçe kayıt için Basınç-parlatma Pipetler
Bu makalede
Özet
Özet
Basınç-parlatma yama klemp kayıt için cam pipetler şekillendirmek için kullanılan bir yöntemdir. Biz ilk olarak küçük (<3 m) nöronal hücre gövdeleri kayıt için uygun pipetler imalatı için bu yöntemi geliştirdi. Temel prensip, cam üfleme benzer ve geleneksel bir mikropipet çektirmenin tarafından hazırlanan yama pipetler şeklini değiştirmek için, hava basıncı ve ısı birleştirir. Bu sözde yumuşak (kostik soda) ve sert (borosilikat) gözlük uygulanabilir. Genel olarak konuşmak gerekirse, basınç parlatma ucu açıklığı (Goodman ve Lockery, 2000) çapı düşürmeden, pipetle direnci% 25 oranında azaltabilir. Hemen her tür cam uygulanan ve bir yüksek basınç valfi ve bir microforge monte sadece ek gerektirir. Bu teknik ultrasmall hücreleri (<5 m) kayıt için gerekli ve ayrıca pipet direnci en aza indirerek, tek kanallı kayıt artırabilirsiniz. Künt şekli delikli yama kelepçe kayıt için de yararlıdır perforasyonu için daha büyük bir membran bleb bu ucu şeklini sonuçları.
Protokol
Çekme pipetler
Çektirmesi gibi filament kullanarak bir Sutter P-97 / Kahverengi Mikroelektrod Çektirme Flaming, yaklaşık 10-20 pipetler bir set çekin.
- Cam seçin. Biz borosilikat (BF150-86-10, OD = 1.5 mm, ID = 0.86 mm) kullanın. Temiz ve tozsuz kalır cam dikkatlice saklayın.
- Çekme programı tasarlayın. Birincil amacı, uygulamaya bağlı olacaktır yaklaşık istenen boyut, açılan bir ucu. Sutter P-97-Pipet Yemek Tarifleri 2 mükemmel bir referans.
- Açılış çap ve pürüzsüzlük belirlemek için mikroskop altında pipetler uyun. Kaba, düzensiz ya da düzensiz ipuçları atın. Karşısında 2-4 mikron olan bir ucu açılış standart y....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz aslında C. 2-3 mikron nöronlardan gelen patch-klemp kayıt için pipetler yararlı hale getirmek için bu yöntem geliştirdi elegans 1. Goodman laboratuvarda rutin olarak kullanılması. Biz sadece kayıt için küçük C. basınç lehçe pipetler elegans nöronlar, aynı zamanda iyon kanalları Xenopus oositleri ifade macropatch ve tek kanallı kayıtları elde etmek için. Belirli bir ucu açılması çapı için, künt şekli, düşük bir direnç pipet oluşturur. Alt pipet direnci düşük seri direnç ve düşük gürültü kayı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
SR Lockery ile işbirliği içinde basınç parlatma tekniği geliştirildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| Cam Kılcal Borular | Sarf Malzemesi | Sutter Instrument Co. | BF150-85-10 (veya benzeri) | Yöntem, kuvarstan yapılmış olanlar dışındaki her türlü kılcal boru ile çalışır. Ancak, filamentli kılcal boruların kullanılması önerilir. |
| Evirme Mikroskop | Mikroskop | Leica Microsystems | DM IL (veya benzeri) | Herhangi bir basit evirme mikroskop yeterli olacaktır. Ancak, parlatma sırasında pipetleri görebilmek için yeterli büyütmeye sahip olmak esastır. Bu amaçla, uzun çalışma mesafeli 100x metalurjik lens kullanıyoruz. |
| Mikroforge Kiti | Araç | ALA Science | CPM-2 | Parlatma bobini, kontrolör ve ayak pedalı sağlar. |
| Hava basınç kaynağı | Araç | ALA Science | PR-60 | Yüksek basınç sağlamak için aksesuar, uygun bir valf içerir. Alternatif olarak, binadan gelen basınçlı hava, bir filtre/regülatör (40 PSI'a ayarlı) ve 4 yollu bir valf (aşağıya bakınız) ile birlikte kullanılabilir. |
| 4 yollu valf | Araç | Cole-Parmer | A-98150-01 | Valfi boruya bağlamak için bağlantı parçaları gerekecektir. |
| Luer Konnektörlü Pipet Tutucu | Araç | World Precision Instruments, Inc. | MPH-6S20 | Pipet tutucuyu yüksek basınçlı boruya bağlamak için erkek luer-barb bağlantı parçası kullanın. |
| Tygon® boru | Araç | Cole-Parmer | 06408-62 | Pipet tutucuyu 4 yollu valfe bağlamak için bu boruyu kullanın. |
Kaynaklar
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. . J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).
- Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
