1.6: Genetiği Değiştirilmiş Gıdalar İçin Test

1. Gıda örneklerinden DNA ekstraksiyonu

1. Bir transfer pipeti veya 200-1.000 μL ayarlanabilir hacimli mikropipet kullanarak 2 vidalı kapaklı tüpün her birine 500 μL satın alınan PCR karışım matrisi ekleyin. PCR matrisini eşit şekilde karıştırmak için her bir alikot arasında pipet ile yukarı ve aşağı pipetleyin.
2. Bir vidalı kapağı "GDO'suz" ve diğerini "test" olarak etiketleyin.
3. 0,5 g sertifikalı GDO'suz gıdayı tartın ve harcın içine koyun.
4. 2,5 mL damıtılmış su ekleyin ve bir bulamaç oluşturmak için havaneli ile 2 dakika öğütün.
5. 2,5 mL daha damıtılmış su ekleyin ve bulamaç pipetlenecek kadar pürüzsüz hale gelene kadar havaneli ile öğütmeye devam edin.
6. Dereceli bir pipet üzerinde 50 μL işaretini kullanarak "GDOSUZ" etiketli 500 μL PCR ön karışımı içeren vidalı kapaklı tüpe 50 μL öğütülmüş bulamaç pipetleyin. Tüpü yeniden kaplayın.
7. Test gıda numunesini hazırlamak için 1.3–1.6 adımlarını tekrarlayın.
8. 50 μL öğütülmüş test gıda bulamacını "test" etiketli vidalı kapaklı tüpe pipetleyin. Tüpü yeniden kaplayın.
9. GDO'suz gıda ve test gıda PCR tüplerini 1 dakika boyunca vorteksleyin ve tüpleri 95 ° C su banyosuna 5 dakika yerleştirin. Girdap yoksa, su banyosuna yerleştirmeden önce karıştırmak için tüpü birkaç kez hafifçe vurun.
10. Tüpleri 5 dakika boyunca bir santrifüje koyun. Tüpün dibinde katı bir pelet oluşmalıdır. 5 dakika sonra pelet oluşmazsa, pelet oluşana kadar 2 dakika aralıklarla tekrar santrifüjleyin.
11. Tüpler PCR için hemen kullanılabilir veya buzdolabında 1 haftaya kadar saklanabilir.

2. PCR reaksiyonlarının ayarlanması

1. PCR tüplerini 1-6 arasında numaralandırın ve başlatın. Numaralar, Tablo 1'de listelenen aşağıdaki tüp içeriğine karşılık gelmelidir.
2. Etiketli her PCR tüpünü, kapakları açık bir mikrotüp tutucuya yerleştirin.
3. Her ekleme için yeni bir uç kullanarak, her bir PCR tüpüne Tablo 1'de belirtilen primerden 20 μL ekleyin. Kapak tüpleri.
4. Her tüp için yeni bir uç kullanarak, Tablo 1'de belirtilen DNA örneğinden 20 μL'yi her bir PCR tüpüne ekleyin, yalnızca süpernatanttan pipetlediğinizden ve tüplerin altındaki katı peletten kaçındığınızdan emin olun.
5. Her DNA örneği ilgili PCR tüpüne pipetlendikten sonra, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek DNA ve astarı karıştırmak için pipet kullanın; tüpleri yeniden başlatın.
6. PCR tüplerini termal döngüleyiciye yerleştirin ve döngüleyiciyi şu şekilde programlayın:
   İlk denatüre: 94 °C'de 2 dakika boyunca 1 döngü.
   Amplifikasyon: 94 °C'de 1 dakika (denatüre), 59 °C'de 1 dakika (tavlama) ve 72 °C'de 2 dakika (uzatma) 40 döngü.
   Son Uzatma: 1 döngü 72 °C'de 10 dakika.
   Basılı tutun: 4 °C süresiz olarak.

3. %3 Agaroz Jel Hazırlama

1. Laboratuvar veya maskeleme bandı kullanarak jel tepsisinin açık uçlarını güvenli bir şekilde bantlayın. Erimiş agarozun dışarı sızmasını önlemek için tepsinin kenarlarına bant yapıştırıldığından emin olun.
2. 3 g agarozu 250 mL veya daha büyük bir Erlenmeyer şişesine tartın.
3. 100 mL 1x TAE tamponu ekleyin (konsantreden satın alınır veya hazırlanır).
4. Karıştırma çubuklu manyetik bir sıcak plaka kullanarak, agaroz tamponda tamamen eriyene ve çözelti kaynayıp berraklaşana kadar beheri ısıtın. Alternatif olarak, beheri fırına koyarak ve 30 saniye aralıklarla ısıtarak, her 10 saniyede bir karıştırmak için bir karıştırma çubuğu kullanarak, karışım kaynayana ve berraklaşana kadar tekrarlanarak bir mikrodalga fırın kullanılabilir.
5. 50 mL'lik bir Erlenmeyer şişesini, geri akış görevi görmesi için 250 mL'lik şişenin açıklığına ters çevirin ve agaroz çözeltisinin buharlaşmasını önleyin.
6. Agaroz solüsyonunun 60 °C'ye soğumasına izin verin ve bantlanmış her jel tepsisine 30-50 mL dökün.
7. Jel kuyuları oluşturmak için ilk çentik çiftine bir jel tarak yerleştirin.
8. Bandı ve tarağı çıkarmadan önce jelin tamamen soğumasını bekleyin. Jel katılaşacak ve hazır olduğunda yaklaşık 10-20 dakika içinde berraktan bulanıka dönecektir.

4. PCR Ürünlerinin Elektroforezi

1. Önceden hazırlanmış bir %3 agaroz jeli bir jel tepsisine yerleştirin veya dökülmüş %3 agaroz jeli dökmek için kullanılmış bir jel tepsisi kullanın.
2. Jel tepsisini, oyuklar katot (siyah) ucuna en yakın olacak şekilde elektroforez odasına kaydırın.
3. Jel tepsisinin üst kısmının üzerinde 2 mm tampon kalacak kadar hazneye 1x TAE tamponu dökün.
4. Termal döngüleyiciden PCR tüplerini alın ve mikrotüp tutucuya yerleştirin.
5. Her seferinde yeni bir pipet ucu kullanarak, her numuneye 10 μL satın alınan Orange G yükleme boyası (LD) ekleyin ve iyice karıştırın.
6. Belirtilen sırayla jele 20 μl moleküler ağırlık cetveli ve her numuneden 20 μL yükleyin (Tablo 2).
7. Jel elektroforezini 100 V'ta 30 dakika çalıştırın.
8. Jel tepsisini hazneden çıkarın ve tepsiden çıkarmak için jeli kaydırın. Jeli bir boyama tepsisine yerleştirin.
9. Jeli, satın alınan DNA jel lekesine 5 dakika daldırın, lekenin jel boyunca dağılmasına yardımcı olmak için tepsiyi dikkatlice sallayın.
10. Jeli bir yıkama kabına aktarın ve musluk suyuyla (40-55 °C) yaklaşık 10 saniye durulayın.
11. En iyi sonucu elde etmek için her birini 6 dakika boyunca ılık musluk suyunda 3 kez yıkayarak lekeyi çıkarın. Gerekirse, istenen kontrasta ulaşılana kadar ılık suda leke çıkarmaya devam edin.

Tablo 1. Uygun tüp numaralarının, primerlerin ve DNA örneklerinin listesi.

Tablo 2. 20 μL moleküler ağırlık cetvelini ve her numuneden 20 μL'yi jele yüklemek için uygun sıra.

Genetiği değiştirilmiş gıdalar, DNA'sı özel olarak değiştirilmiş bir bileşen veya bileşenler içeren ürünlerdir. Bu modifikasyonların varlığı, polimeraz zincir reaksiyonu adı verilen bir teknik kullanılarak tespit edilebilir.

Gıdaların genetik modifikasyonu, sağlık ve çevre güvenliği konusundaki tartışmalı endişeler nedeniyle tartışmalı bir konu olmuştur. İlgilenilen gıda örneklerinde genetiği değiştirilmiş DNA'yı tespit etme yeteneği, gıda kaynaklarında genetiği değiştirilmiş organizmaların veya GDO'ların kullanılmasının güvenliği ve potansiyel tehlikeleri hakkında eğitimli karar vermeye olanak tanır.

Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, genetik olarak değiştirilmiş dizilerin varlığını veya yokluğunu belirlemek için gıda DNA'sını amplifiye etmek için kullanılır. Jel elektroforezi daha sonra amplifiye edilmiş DNA'yı bir agaroz jel matrisinden çeker ve modifiye edilmiş veya modifiye edilmemiş belirteçlere karşılık gelen farklı boyutlardaki DNA bantlarını ayırır. Bunlar daha sonra GDO içerdiği bilinen veya modifikasyon içermediği bilinen gıdalardan elde edilen kontrol bantlarıyla karşılaştırılır.

Bu video, gıda örneklerinden genetiği değiştirilmiş DNA'nın tespit edilmesinin ardındaki ilkeleri, DNA'nın nasıl çıkarılacağını ve genetik modifikasyon sürecinde kullanılan belirteçlerin nasıl yükseltileceğini ve gıda örneklerinde GDO'ların varlığının veya yokluğunun nasıl belirlenebileceğini gösterecektir.

Polimeraz zincir reaksiyonu, genetiği değiştirilmiş gıdaya yerleştirilmiş DNA dizilerini tanımlar. DNA nispeten kararlı bir moleküldür, bu nedenle amplifikasyon için uygun canlı DNA parçaları, mısır cipsi veya sebze burgerleri gibi yüksek oranda işlenmiş ürünlerden bile izole edilebilir. Eklenen genlerin ekspresyonunu kontrol etmek için az sayıda düzenleyici DNA dizisi kullanılır, bu nedenle bu diziler GDO'lu ürünlerin çoğunda bulunur. Bu prosedür, en sık kullanılanlardan ikisini, 35S promotör genini ve nopalin sentaz sonlandırıcı genini tanımlar. 35S dizisi güçlü bir destekleyicidir ve eklenen bir gene bağlandığında sabit, yüksek düzeyde ifade sağlar. Nopalin sentaz sonlandırıcı, eklenen genin istenen son noktada transkripsiyonunu durdurmak için dahil edilir.

PCR, PCR reaksiyon tüplerinin sıcaklığını sıkı bir şekilde kontrol eden bir makine olan bir termal döngüleyicide tekrarlayan ısıtma ve soğutma döngülerini içerir. Numuneyi 94 ° C'ye ısıtmak ? C, DNA ipliklerinin denatüre olmasına ve ayrılmasına neden olur. 45 ile 65 ° C'ye kadar hızlı soğutma ? C, primerlerin ayrılan DNA zincirlerine tavlanmasına izin verir. Son olarak, 72 ° C'ye yeniden ısıtmak ? C, Taq polimeraz enziminin primerleri uzatmasına ve hedef bölgenin tam kopyalanmasına izin verir.

Satın alınan bitki astarı her numuneye eklenir ve bitki DNA'sı içeren numunelerde amplifiye edilir. GDO'lar için pozitif bir kontrol sağlamak için 35S ve NOS için GDO pozitif şablonlar kullanılır. Negatif kontrol olarak sertifikalı bir GDO'suz kullanılır. Bu kontrol reaksiyonlarından herhangi biri beklenmeyen bantlar gösteriyorsa, test numunelerinin sonuçlarına güvenilemez.

Amplifiye edilmiş DNA, elektroforez yoluyla bir agaroz jelden geçirilir. PCR ürünleri bir boya ile karıştırılır ve kuyucuklara yüklenir. DNA negatif yüklüdür ve odanın katot ucundaki jele yüklendiğinde, akım uygulandığında anot ucuna doğru hareket edecektir. Daha büyük DNA parçaları jel matrisi boyunca o kadar kolay hareket edemez, bu nedenle katoda daha yakın kalırken, daha küçük diziler anot ucuna doğru hareket eder ve bu da farklı büyüklükteki DNA'nın farklı bantlara ayrılmasına neden olur.

Elektroforezden sonra jel boyama, ayrılmış DNA bantlarını görselleştirmeye yardımcı olur.

Artık GDO tespitinin ve GDO tanımlaması için PCR ve elektroforez kullanımının arkasındaki ilkelere aşina olduğumuza göre, bunun laboratuvarda nasıl gerçekleştirilebileceğine bir göz atalım.

İlgilenilen gıda ürünleri belirlendikten sonra analize başlanabilir. DNA'yı çıkarmak için iki temiz vidalı tüp alın ve bunların her birine 500 ? Satın alınan L DNA izolasyon reaktifi, reaktifi eşit şekilde karıştırmak için karışımı alikotlar arasında yukarı ve aşağı pipetlediğinizden emin olun. Tüplerden birini "GDO'suz" ve diğerini "Test" olarak etiketleyin.

Daha sonra, 0,5 g sertifikalı GDO'suz gıdayı tartın ve temiz bir harç içine koyun. 2,5 mL damıtılmış su ekleyin ve bir bulamaç oluşturmak için havaneli ile 2 dakika öğütün. 2,5 mL daha damıtılmış su ekleyin ve bulamacı pipetlemek için yeterince pürüzsüz hale gelene kadar öğütmeye devam edin.

Pipet 50 ? Bilinen GDO'suz bulamacın L'si, DNA izolasyon reaktifini içeren "GDO'suz" etiketli vidalı kapaklı tüpe. Şimdi 50 ekle? Test gıda numunesinin L'si, "Test" olarak işaretlenmiş vidalı kapak tüpüne bulamaçlanır. Gıda örneklerini ve DNA reaktifini içeren iki tüpü 1 dakika boyunca vorteksleyin. Ardından, tüpleri 95 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin. 5 dakika boyunca C. Son olarak, tüpleri 5 dakika boyunca bir santrifüje koyun. İnceleme üzerine, tüpün dibinde katı bir pelet oluşturulmalıdır. 5 dakika sonra bir pelet oluşmazsa, bir pelet oluşana kadar 2 dakikalık aralıklarla tekrar santrifüjleyin. Numuneler artık PCR için hemen kullanılabilir veya buzdolabında 1 haftaya kadar saklanabilir.

İlk olarak, altı numaralı PCR tüpleri. Bu numaralar, Tabloda listelenen tüp içeriğine karşılık gelecektir. Etiketli PCR tüplerinin her birini, kapakları açık bir mikrotüp tutucuya yerleştirin.

Her ekleme için yeni bir uç kullanarak 20 ? L her bir PCR tüpü için Tabloda belirtilen astar. Sonra, 20 ekleyin? Tabloda belirtilen DNA örneklerinin L'si her bir PCR tüpüne. Karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Peletlenmiş numuneler için, yalnızca süpernatanttan pipetlediğinizden emin olun, ve tüplerin altındaki katı peletten kaçının. Son olarak, PCR tüplerini bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve tabloda belirtilen ısıtma ve soğutma adımları arasında geçiş yapacak şekilde programlayın.

Kuyucuklar katot ucuna en yakın olacak şekilde elektroforez odasına% 3'lük bir agaroz jeli yerleştirin. Jel tepsisinin 2 mm üzerini kaplayacak şekilde hazneye TAE tamponu ekleyin. PCR tüplerini termodöngüleyiciden toplayın ve bir mikrotüp tutucuya yerleştirin. Her seferinde yeni bir pipet ucu kullanarak 10 ? Satın alınan DNA'nın L'si her numuneye boya yükler ve iyice karıştırır.

Her seferinde taze bir uç kullanarak, agaroz jelin kuyucuklarını 20 ? L moleküler ağırlık cetveli bir kuyucuğa ve 20 ? Her bir numunenin L'si, bu tabloda gösterildiği gibi sonraki kuyucuklara yerleştirilir. Elektroforez odasını 30 dakika boyunca 100 V'ta çalışacak şekilde ayarlayın.

Jelin çalışması bittiğinde, jel haznesini dikkatlice fişten çekin, tepsiyi çıkarın ve jeli bir boyama tepsisine kaydırın. Jeli satın alınan 100x jel lekesine 5 dakika daldırın, lekeyi dağıtmak için tepsiyi hafifçe sallayın. Lekelendikten sonra jeli bir yıkama kabına aktarın ve yaklaşık 10 saniye musluk suyuyla durulayın. En iyi sonucu elde etmek için her birini hafifçe çalkalayarak ılık musluk suyunda her biri 3 dakika boyunca üç kez yıkayarak lekeden arındırın. Gerekirse, istenen kontrasta ulaşılana kadar ılık suda leke çıkarmaya devam edin.

Şerit 200'te 4 bp'lik bir bandın varlığı veya yokluğu, test gıdasının GDO içerip içermediğini gösterir. Bitki primerleri, bitki DNA'sının numuneden başarılı bir şekilde ekstrakte edilip edilmediğini belirler. GDO'suz gıda kontrolü, ortaya çıkması durumunda yanlış pozitif sonuçların bir göstergesidir. GDO'suz gıda kontrolü pozitif çıkarsa, PCR'nin bir noktada kontamine olduğu anlamına gelir. GDO pozitif şablon kontrolü, yanlış negatiflerin bir göstergesidir. GDO pozitif şablon kontrolü artmazsa, PCR reaksiyonunda bir sorun vardır ve test gıdasından elde edilen GDO negatif sonucuna güvenilemez.

Jeller, DNA bantlarını vurgulamak için kontrast arka plan sağlamak için beyaz veya sarı bir kağıda yerleştirilebilir veya bir UV ışık kutusu kullanılarak daha fazla kontrast elde edilebilir.

Gıda maddelerini veya ürünlerini genetiği değiştirilmiş bileşenler için test etme yeteneği, bir dizi bilimsel veya düzenleyici uygulama ile ilgilidir.

Genetiği değiştirilmiş ürünlerden elde edilen transgenik DNA'nın yabani mahsul popülasyonlarının genomlarına girebileceğine dair bazı kanıtlar vardır. Örneğin, tozlayıcılar, yabani tip bitkileri genetiği değiştirilmiş bir kaynaktan gelen polenle gübreleyerek bu transferi kolaylaştırabilir. Bu eklenen genlerin yayılmasının bir bütün olarak ekosistemler üzerindeki etkileri iyi anlaşılmadığı için bu bir endişe kaynağıdır. Yabani popülasyonların PCR testi, genetik eklerin potansiyel yayılması veya başarılı bir şekilde kontrol altına alınması hakkında veri sağlayabilir.

Etiketleme eksikliği veya genetiği değiştirilmiş bileşenlerin yanlış etiketlenmesi tüketiciyi endişelendirebilir. Bu, tüketicinin tüketim tercihine veya GM işlemi sırasında alerjenlerin potansiyel olarak ortaya çıkmasına bağlı olabilir, ancak ikincisi tartışmalıdır. Bazı ülkelerde, genetiği değiştirilmiş bileşenlerin gıda ambalajlarında listelenmesi gerekmektedir. Bu tür ülkelerdeki düzenleyici kurullar, gıda etiketlemesinin doğruluğunu kontrol etmek için PCR testini kullanabilir.

Bir ürüne uygulanan genetik modifikasyonun pestisit direnci sağladığı durumlarda, bazı çalışmalar "süper yabani otların" üretimi ile ilgili endişeleri dile getirmiştir. Esasen bunlar, introgresyon veya hibridizasyon gibi mekanizmalar yoluyla pestisitlere karşı direnç elde eden, başlangıçta modifikasyon için hedeflenmeyen herhangi bir bitki olabilir. Bu bitkiler daha sonra daha başarılı bir şekilde yayılabilir ve ek parçası olmayanlara göre kontrol edilmesi daha zor olabilir. Genetik modifikasyon için PCR testi, bu yayılmanın sorunlu olup olmayacağını belirlemek için bu tür potansiyel popülasyonları vurgulamaya ve izlemeye yardımcı olabilir.

JoVE'nin GDO'lu Gıdalar için Test'e girişini izlediniz. Artık PCR kullanarak genetiği değiştirilmiş gıdaları tanımlamanın ardındaki ilkeleri, gıdalardan DNA'yı nasıl çıkaracağınızı ve çoğaltacağınızı ve gıda numunenizin genetik olarak değiştirilip değiştirilmediğini nasıl belirleyeceğinizi anlamalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler!