Genetiği Değiştirilmiş Gıdalar İçin Test

1. Gıda örneklerinden DNA ekstraksiyonu

1. Bir transfer pipeti veya 200-1.000 μL ayarlanabilir hacimli mikropipet kullanarak 2 vidalı kapaklı tüpün her birine 500 μL satın alınan PCR karışım matrisi ekleyin. PCR matrisini eşit şekilde karıştırmak için her bir alikot arasında pipet ile yukarı ve aşağı pipetleyin.
2. Bir vidalı kapağı "GDO'suz" ve diğerini "test" olarak etiketleyin.
3. 0,5 g sertifikalı GDO'suz gıdayı tartın ve harcın içine koyun.
4. 2,5 mL damıtılmış su ekleyin ve bir bulamaç oluşturmak için havaneli ile 2 dakika öğütün.
5. 2,5 mL daha damıtılmış su ekleyin ve bulamaç pipetlenecek kadar pürüzsüz hale gelene kadar havaneli ile öğütmeye devam edin.
6. Dereceli bir pipet üzerinde 50 μL işaretini kullanarak "GDOSUZ" etiketli 500 μL PCR ön karışımı içeren vidalı kapaklı tüpe 50 μL öğütülmüş bulamaç pipetleyin. Tüpü yeniden kaplayın.
7. Test gıda numunesini hazırlamak için 1.3–1.6 adımlarını tekrarlayın.
8. 50 μL öğütülmüş test gıda bulamacını "test" etiketli vidalı kapaklı tüpe pipetleyin. Tüpü yeniden kaplayın.
9. GDO'suz gıda ve test gıda PCR tüplerini 1 dakika boyunca vorteksleyin ve tüpleri 95 ° C su banyosuna 5 dakika yerleştirin. Girdap yoksa, su banyosuna yerleştirmeden önce karıştırmak için tüpü birkaç kez hafifçe vurun.
10. Tüpleri 5 dakika boyunca bir santrifüje koyun. Tüpün dibinde katı bir pelet oluşmalıdır. 5 dakika sonra pelet oluşmazsa, pelet oluşana kadar 2 dakika aralıklarla tekrar santrifüjleyin.
11. Tüpler PCR için hemen kullanılabilir veya buzdolabında 1 haftaya kadar saklanabilir.

2. PCR reaksiyonlarının ayarlanması

1. PCR tüplerini 1-6 arasında numaralandırın ve başlatın. Numaralar, Tablo 1'de listelenen aşağıdaki tüp içeriğine karşılık gelmelidir.
2. Etiketli her PCR tüpünü, kapakları açık bir mikrotüp tutucuya yerleştirin.
3. Her ekleme için yeni bir uç kullanarak, her bir PCR tüpüne Tablo 1'de belirtilen primerden 20 μL ekleyin. Kapak tüpleri.
4. Her tüp için yeni bir uç kullanarak, Tablo 1'de belirtilen DNA örneğinden 20 μL'yi her bir PCR tüpüne ekleyin, yalnızca süpernatanttan pipetlediğinizden ve tüplerin altındaki katı peletten kaçındığınızdan emin olun.
5. Her DNA örneği ilgili PCR tüpüne pipetlendikten sonra, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek DNA ve astarı karıştırmak için pipet kullanın; tüpleri yeniden başlatın.
6. PCR tüplerini termal döngüleyiciye yerleştirin ve döngüleyiciyi şu şekilde programlayın:
   İlk denatüre: 94 °C'de 2 dakika boyunca 1 döngü.
   Amplifikasyon: 94 °C'de 1 dakika (denatüre), 59 °C'de 1 dakika (tavlama) ve 72 °C'de 2 dakika (uzatma) 40 döngü.
   Son Uzatma: 1 döngü 72 °C'de 10 dakika.
   Basılı tutun: 4 °C süresiz olarak.

3. %3 Agaroz Jel Hazırlama

1. Laboratuvar veya maskeleme bandı kullanarak jel tepsisinin açık uçlarını güvenli bir şekilde bantlayın. Erimiş agarozun dışarı sızmasını önlemek için tepsinin kenarlarına bant yapıştırıldığından emin olun.
2. 3 g agarozu 250 mL veya daha büyük bir Erlenmeyer şişesine tartın.
3. 100 mL 1x TAE tamponu ekleyin (konsantreden satın alınır veya hazırlanır).
4. Karıştırma çubuklu manyetik bir sıcak plaka kullanarak, agaroz tamponda tamamen eriyene ve çözelti kaynayıp berraklaşana kadar beheri ısıtın. Alternatif olarak, beheri fırına koyarak ve 30 saniye aralıklarla ısıtarak, her 10 saniyede bir karıştırmak için bir karıştırma çubuğu kullanarak, karışım kaynayana ve berraklaşana kadar tekrarlanarak bir mikrodalga fırın kullanılabilir.
5. 50 mL'lik bir Erlenmeyer şişesini, geri akış görevi görmesi için 250 mL'lik şişenin açıklığına ters çevirin ve agaroz çözeltisinin buharlaşmasını önleyin.
6. Agaroz solüsyonunun 60 °C'ye soğumasına izin verin ve bantlanmış her jel tepsisine 30-50 mL dökün.
7. Jel kuyuları oluşturmak için ilk çentik çiftine bir jel tarak yerleştirin.
8. Bandı ve tarağı çıkarmadan önce jelin tamamen soğumasını bekleyin. Jel katılaşacak ve hazır olduğunda yaklaşık 10-20 dakika içinde berraktan bulanıka dönecektir.

4. PCR Ürünlerinin Elektroforezi

1. Önceden hazırlanmış bir %3 agaroz jeli bir jel tepsisine yerleştirin veya dökülmüş %3 agaroz jeli dökmek için kullanılmış bir jel tepsisi kullanın.
2. Jel tepsisini, oyuklar katot (siyah) ucuna en yakın olacak şekilde elektroforez odasına kaydırın.
3. Jel tepsisinin üst kısmının üzerinde 2 mm tampon kalacak kadar hazneye 1x TAE tamponu dökün.
4. Termal döngüleyiciden PCR tüplerini alın ve mikrotüp tutucuya yerleştirin.
5. Her seferinde yeni bir pipet ucu kullanarak, her numuneye 10 μL satın alınan Orange G yükleme boyası (LD) ekleyin ve iyice karıştırın.
6. Belirtilen sırayla jele 20 μl moleküler ağırlık cetveli ve her numuneden 20 μL yükleyin (Tablo 2).
7. Jel elektroforezini 100 V'ta 30 dakika çalıştırın.
8. Jel tepsisini hazneden çıkarın ve tepsiden çıkarmak için jeli kaydırın. Jeli bir boyama tepsisine yerleştirin.
9. Jeli, satın alınan DNA jel lekesine 5 dakika daldırın, lekenin jel boyunca dağılmasına yardımcı olmak için tepsiyi dikkatlice sallayın.
10. Jeli bir yıkama kabına aktarın ve musluk suyuyla (40-55 °C) yaklaşık 10 saniye durulayın.
11. En iyi sonucu elde etmek için her birini 6 dakika boyunca ılık musluk suyunda 3 kez yıkayarak lekeyi çıkarın. Gerekirse, istenen kontrasta ulaşılana kadar ılık suda leke çıkarmaya devam edin.

Tüp numarası	Astar	DNA Örneği
1	20 μL Bitki astarı (yeşil)	20 μL GDO'suz gıda kontrol DNA'sı
2	20 μL GDO'lu astar (kırmızı)	20 μL GDO'suz gıda kontrol DNA'sı
3	20 μL Bitki astarı (yeşil)	20 μL Test gıda DNA'sı
4	20 μL GDO'lu astar (kırmızı)	20 μL Test gıda DNA
5	20 μL Bitki astarı (yeşil)	20 μL GDO pozitif kontrol DNA'sı
6	20 μL GDO'lu astar (kırmızı)	20 μL GDO pozitif kontrol DNA'sı

Tablo 1. Uygun tüp numaralarının, primerlerin ve DNA örneklerinin listesi.

Kuyu 1	Örnek 1: Bitki primerleri ile GDO'suz gıda kontrolü 20 μL.
Kuyu 2	Örnek 2: GDO'lu primerler ile GDO'suz gıda kontrolü 20 μL.
Kuyu 3	Örnek 3: Yemleri 20 μL, bitki primerleri ile test edin.
Kuyu 4	Örnek 4: Gıdaları GDO'lu primerlerle test edin 20 μL.
Kuyu 5	Örnek 5: Bitki primerleri 20 μL olan GDO pozitif DNA.
Kuyu 6	Örnek 6 GDO pozitif DNA, GDO primerleri 20 μL.
Kuyu 7	PCR moleküler ağırlık cetveli 20 μL.
Kuyu 8	Boş bırakın.

Tablo 2. 20 μL moleküler ağırlık cetvelini ve her numuneden 20 μL'yi jele yüklemek için uygun sıra.