2.3: Çevresel Kaynaklardan Gelen Bakterilerin Gram Boyanması

1. Örnek Koleksiyonu

1. Toprak örneği toplayın ve mikrobiyal analiz için laboratuvara taşıyın.
2. Laboratuvarda 10 g'lık bir numuneyi analitik terazi kullanarak tartın.
3. Numuneyi 1:10 oranında 95 mL fosfat tamponlu tuzlu suya (10 kısım toprak, 5 kısım sulu sıvıya eşdeğerdir) seyreltin ve karıştırmak için girdap yapın (Şekil 2, Adım 1).
4. mL başına en az 10^-5 g toprağa kadar müteakip 1:10 seyreltme gerçekleştirin ve seçilen seyreltmeleri iki veya üç kopya halinde düşük besinli bir agar ortamına yayın ( örneğin , R2A) (Şekil 2, Adım 2-3).
5. Plakaları oda sıcaklığında bir hafta boyunca inkübe edin (Şekil 2, Adım 4).
6. İzolasyon için bir veya iki koloni seçin ve taze agar plakalarına sürün (Şekil 3, Adım 1-3).
7. Çizgi plakalarını oda sıcaklığında iki ila üç gün inkübe edin (Şekil 3, Adım 4).

2. Bakteriyel Yaymaların Hazırlanması

1. İzole koloniler için çizgi plakalarını gözlemleyin.
2. Her bir smear hazırlığını hazırlamak için, bir aşılama halkasını etanole batırın, alevle sterilize edin ve önceden temizlenmiş cam slaytların ortasına 1 ila 2 ilmek dolusu steril damıtılmış su yerleştirin.
3. Aşılama döngüsünü daha önce tarif edildiği gibi tekrar sterilize edin. Soğuduktan sonra, izole edilmiş tek bir koloniden az miktarda kültürü çıkarın ve slayt üzerindeki su damlacıkları ile karıştırın (smear seyreltilmiş yağsız süte benzemelidir). Aşılama döngüsü, koloni izolasyonundan önce soğutulmalıdır. Çok sıcak bir döngü, koloninin ve/veya ortamın sıçramasına neden olur ve bu da bakterilerin aerosolleşmesine yol açabilir. Genel olarak, döngü kullanım için çok sıcak olduğunda, agar veya koloniye uygulandığında bir "tıslama" sesi duyulacaktır. Döngünün uygun olmayan şekilde soğutulması, kültürden slayta transferin daha az verimli olmasına ve hücre morfolojisinin bozulmasına neden olabilir.
4. Lekeyi sürgünün yüzeyine yaklaşık 2,5 cm x 2,5 cm ölçülerinde yayın ve kurumaya bırakın. Havayla kurutmanın laminer akış koşulları altında gerçekleşmesi önemlidir. Lekeyi bozmamak için slaytlar fön ile kurutulmamalıdır. Ayrıca, hücre morfolojisini korumak için slaytlar alevle kurutulmamalıdır.
5. Kuruduktan sonra, slaytı 2-3 kez alevden hızlı bir şekilde geçirerek lekeyi ısıyla sabitleyin. Hücre morfolojisinin bozulmasını ve/veya cam sürgünün hasar görmesini önlemek için sürgü alevde sabit tutulmamalıdır.

3. Gram Boyama

1. Temiz bir mandal kullanarak sürgüyü bir ucundan sabitleyin.
2. Smear'ı kristal viyole (birincil leke) ile örtün ve 2 ila 3 dakika bekleyin.
3. Slaytı damıtılmış suyla dikkatlice yıkayın. Cam slaytın hasar görmesini ve/veya ayrılmasını önlemek için su akışı lekeye yönlendirilmemelidir.
4. Smear'ı Gram'ın iyotuyla örtün ve 2 dakika bekleyin, ardından slaytı suyla nazikçe durulayın.
5. Leke artık slayttan yıkanmayana kadar% 95 etanol kullanarak lekenin rengini giderin (bu, lekenin kalınlığına bağlı olarak genellikle 20 saniyeden fazla sürmez), ardından hemen damıtılmış suyla durulayın. Bu adım, yanlış bir Gram leke atamasına (, yani Gram değişkeni) yol açabilecek slaytın aşırı renginin açılmasını önlemek için kritik öneme sahiptir.
6. Karşı lekeyi (safranin) lekeye ekleyin ve 30 saniye bekleyin. Ardından slaytı damıtılmış suyla nazikçe durulayın ve emici kağıt kullanarak kurulayın.

4. Slaytların mikroskobik gözlemi

1. Düşük ( ör. , 4X veya 10X), yüksek kuru ( örneğin , 40X) ve yağa daldırma (100X) hedeflerini kullanarak slaytları gözlemleyin. Yağa daldırmak için, yağı doğrudan lekeye ekleyin.
2. Gram-pozitif ve Gram-negatif toprak bakterilerinin temsili sonuçları için bakınız Şekil 4 ve 5.

Şekil 2. Seyreltme ve yayma kaplama tekniği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Çizgi Plakası tekniği kullanılarak koloni izolasyonu.

Şekil 4. Gram pozitif toprak bakterisi Staphylococcus aureus.

Şekil 5. Gram negatif toprak bakterisi Escherichia coli.

Gram boyama, bakteri morfolojisinin hızlı bir şekilde görselleştirilmesini ve çok çeşitli çevresel örneklerden geniş hücresel ayrımın sağlanmasını sağlar. Bakterileri lekelemek için, cam bir tarafa düzgün bir leke uygulanır ve kurumaya bırakılır. Smear ısıyla sabitlendikten sonra kristal viyole uygulanır.

Renk giderici bir ajan, kristal viyoleyi Gram negatif hücrelerden durular, ancak Gram pozitif hücrelerden durulamaz. İkinci bir boya, tipik olarak safranin, Gram-negatif hücreleri görselleştirmek için bir arka plan boyası olarak kullanılır. Boyandıktan sonra hücreler, hücre morfolojisi, boyutu ve zincirler veya kümeler gibi düzenlemeler açısından değerlendirilebilir.

Bu video, çevresel bir numunenin nasıl hazırlanacağını, burada bulunan bakteri türlerinin nasıl izole edileceğini ve izole edilen koloniler üzerinde bir Gram boyamanın nasıl gerçekleştirileceğini gösterecektir

Gram boyama, çoğu bakterinin iki geniş yapısal sınıfa sınıflandırılmasına olanak tanır: Gram-pozitif ve Gram-negatif. Her iki sınıf da altta yatan bir fosfolipid plazma zarına sahipken, hücresel duvarın yapısı büyük ölçüde değişir. Gram pozitif hücre duvarı, esas olarak şekerler ve amino asitlerden oluşan bir polimer olan kalın bir peptidoglikan tabakasından oluşur. Gram-negatif hücre duvarları, ikinci bir lipit zarı arasına sıkıştırılmış daha ince bir peptidoglikan tabakasına sahiptir. Bu dış zar tipik olarak lipopolisakkaritler içerir.

Pozitif yüklü kristal viyole, negatif yüklü bakteri hücre duvarına zayıf bir şekilde bağlanır. Gram iyot, kristal viyole boya ile çözünmeyen bir kompleks oluşturur ve böylece hücre duvarına sabitlenir.

Renk giderme aşaması sırasında, Gram pozitif hücrelerdeki peptidoglikan kurutulur, bu da kristal viyole-iyot komplekslerini kasılmasına ve hapsetmesine neden olur. Gram-negatif hücrelerde, renk giderici ajan dış zarı tehlikeye atarak gözenekliliğini arttırır. Bu, kristal viyole-iyot komplekslerinin yıkanmasına izin verir.

Artık Gram boyama toprak bakterilerinin arkasındaki prensipleri anladığınıza göre, laboratuvarda toprak bakterileri üzerinde yapılan işlemi görelim.

Tarlada bir toprak örneği topladıktan sonra, analiz için laboratuvara getirin. Numuneyi bir elek ile rafine edin ve analitik bir terazi kullanarak elenmiş toprağın 10 g'ını tartın.

Numuneyi 95 mL fosfat tamponlu tuzlu su içine seyreltin ve karıştırmak için girdap haline getirin. Her seyreltme arasında girdap oluşturarak 1 ila 10 seyreltme daha gerçekleştirin. En az 3 ardışık seyreltmenin alikotlarını replike düşük besinli agaroz plakalarına aktarın.

Etanol alevi sterilizasyonu ve bükülmüş bir cam çubuğun ortama hafifçe vurularak soğutulmasının ardından, numuneyi plakaların yüzeyine yayın. Plakaları oda sıcaklığında inkübe edin. 3 ila 5 gün inkübe ettikten sonra, 30 ila 300 ayrı koloni ile en yüksek seyreltmeyi seçin. Steril bir aşılama döngüsü ile, izolasyon için ilgilenilen kolonileri seçin.

Koloniyi taze bir tabağın bir bölümüne sürün. Çizgiler arasındaki döngüyü sterilize ederek, ayrı tek kolonilerin daha sonra izole edilmesine izin vermek için plakanın her bir bölümüne zikzak şeklinde ardışık çizgiler yapın. Plakaları oda sıcaklığında 1 ila 2 gün inkübe edin.

Bakteriyel yaymaların hazırlanmasına başlamak için, kullanım kolaylığı için önceden temizlenmiş bir cam slayta bir klips takın. Her bakteri bulaşması için, bir aşılama halkasını temizleyin ve alevle sterilize edin. Slaytın ortasına 2 ilmek dolusu steril damıtılmış su yerleştirin.

Döngüyü tekrar sterilize ettikten sonra, izole edilmiş bir koloniden az miktarda kültür çıkarın ve slayttaki su ile karıştırın. Kültüre dokunmadan önce, agarın aşılanmamış bir kısmına birkaç kez vurarak döngüyü soğutmak önemlidir. Smear seyreltilmiş süte benzemelidir. Slaytın oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra, lekeyi hızlı bir şekilde alevden geçirerek ısıyla sabitleyin.

Kuruduktan sonra kristal viyole üzerine pipetleyin ve 2-3 dakika bekletin. Doğrudan akışı kaydırağın üst kısmına doğru hedefleyerek kaydırağı damıtılmış suyla dikkatlice durulayın ve suyun yavaşça aşağı akmasına izin verin. Su akışını doğrudan lekeye doğrultmayın.

Slaytı Gram'ın iyotu ile örtün. 2 dakika sonra damıtılmış su ile nazikçe durulayın. Leke artık yıkanmayana kadar slaytın rengini %95 etanol ile giderin. Hemen damıtılmış su ile durulayın. Bu, lekenin aşırı renginin açılmasını sınırlayacaktır.

30 saniye boyunca lekeye karşı leke olarak safranin ekleyin. Bu, mevcut tüm Gram-negatif hücreleri lekeleyecektir. Damıtılmış suyla nazikçe durulayın ve emici kağıtla kurulayın. Ortaya çıkan slaydı mikroskopla gözlemleyin. Daha yüksek büyütme oranlarının daha küçük görüş alanına geçmeden önce kaba ayarlamalar yapmak ve lekenin ideal bir bölümünü bulmak için önce düşük güçlü bir objektif kullanın.

Daha fazla görüntüleme ve smear'ı orta güç objektifi ile ayarladıktan sonra, doğrudan smear'a daldırma yağı ekleyin. Yağ, en iyi mikrografları sağlayacak yüksek güç hedefleri için gereklidir. Gram pozitif bakteriler mavi veya mor renkte görünürken, Gram negatif hücreler kırmızı veya pembe olacaktır. Hücre duvarı yapısına ek olarak, ortaya çıkan mikrograflardan şekil ve düzenleme de açıklanır.

Gram boyamanın bakterileri kalitatif olarak inceleme yeteneği, çok çeşitli bilimsel alanlar için önemlidir.

Toprak, bakterilerin izole edilebileceği ve analiz edilebileceği çevresel kaynaklardan sadece bir tanesidir. İçme suyu için numune hazırlama değiştirilmelidir. Musluk suyu örnekleri bir musluktan çekilebilir ve çeşitli, heterotrofik bakteri kolonilerinin büyümesini kolaylaştıran büyüme ortamı üzerine kaplanabilir. R2A gibi bir ortam üzerine kaplama yapıldıktan sonra, işlem toprak prosedürü ile hemen hemen aynıdır.

Bazı bakteri tanımlama teknikleri için, parametreler ilgilenilen bakterinin hücre duvarı tipine bağlıdır. Bu örnekte, septik bir hastanın kanı test edildi ve Gram pozitif bakterileri barındırdığı bulundu.

Bu bilgiyle, hücrelerin rRNA'sına bağlanacak türe özgü peptit nükleik asit probları seçildi. Bu sondalar, mevcut türleri tanımlamak için kullanılan floresan boyalara bağlandı.

Gram-pozitif ve -negatif hücresel yapıdaki temel farklılıklar nedeniyle, bakterilerin kristal viyole dışındaki diğer bileşiklere benzersiz tepkileri vardır. Bu deney, Gram pozitif bir bakteri olan Clostridium difficile'yi dışkı örneklerinden izole etmeye çalıştı. Gram-negatif hücrelerin büyümesini engelleyen sikloserin, agar plakasına eklendi. Plaka üzerinde büyüyen Gram-pozitif hücreler, diğer yöntemlerle daha da izole edildi.

JoVE'nin çevre çalışmaları için Gram boyamaya girişini yeni izlediniz. Artık sürecin faydalarını ve tekniğin nasıl uygulanacağını ve sonuçların nasıl kullanılacağını anlamalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler!