Bakteri Büyüme Eğrisi Analizi ve Çevresel Uygulamaları

1. Bakteri Kültürü Alikotlarının Toplanması

1. Büyüme zaman noktalarının toplanmasından bir gün önce, 50 mL'lik bir şişede 20 mL triptikaz soya suyu (TSB) ortamını E. coli ile aşılayın.
2. Gece boyunca 27 °C'de inkübe edin. Bu nispeten uzun inkübasyon süresi, yaklaşık 10⁹ CFU / mL'lik yabani tip E. coli'nin durağan bir faz popülasyonu ile sonuçlanır.
3. Ertesi gün, 250 mL TSB'yi (500 mL'lik bir şişede) aşılamak için hazırlanan kültürün 100 μL'sini kullanın. İyice karıştırın. 5 mL'lik bir alikotu çıkarın ve hemen 4 °C'de soğutun. Bu T = 0 veya T₀ zaman noktasıdır ve yaklaşık 4 x 10⁵ CFU/mL içermelidir.
4. Kalan E. coli'nin (245 mL) şişesini 37 ° C'lik çalkalama makinesine yerleştirin. Her saat 8 saate kadar 5 mL kültür alikotlarını çıkarın. Her alikotu 4 °C'de saklayın. Bu alikotları T_{1'den T 8'e} kadar belirtin.

2. Seri Seyreltme

1. E. coli'nin alikotlarını buzdolabından çıkarın ve taşımak için buzun üzerine koyun. Kullanana kadar tüm kültürleri buz üzerinde tutun.
2. Her E. coli kültürünün çeşitli dilüsyonlarını elde etmek için bir dizi seyreltme tüpü ayarlayın (Şekil 3). Mikrofuj tüpleri bu işlev için uygundur. Her seyreltme tüpünde 900 μL seyreltme sıvısı (steril tuzlu su) bulunmalıdır. Her E. coli kültürü için bir seyreltme serisi gereklidir (T₀ ila T₈); her tüpü Tablo 2.
   'ye göre etiketleyin
   Şekil 3. E. coli kaplama prosedürünü gösteren şematik.
3. T 0 etiketli tüpten (ilk E. coli kültürü) T 0'ın 10-1 dilüksiyonu olan tüp A'ya ¹⁰⁰ μL E. coli ekleyerek seyreltmeye başlayın. Tüpü 5 saniye boyunca vorteksleyin.
4. Daha sonra, bir sonraki salin tüpü olan Tüp B'ye, T_0'ın ^10-2 seyreltilmesi olan 100 μL Tüp A ekleyin. Her zaman noktası alikotu için gerekli seyreltme serisine devam edin. Transferden önce her tüpü girdaplamayı unutmayın. Her aktarım için yeni bir pipet ucu kullanmak da önemlidir.

E. coli kültürü	Seyreltme gerekli ve Tüp #
	Bir	B	Ç	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

Tablo 2. Her E. coli kültürü için gerekli seyreltme serisi.

3. Kaplama

1. Tablo 3'e göre, her bir E. coli kültürü zaman noktası alikotu için üç seyreltme kaplanacaktır. Plakaları zaman noktası (T₁ ila T₈), seyreltme faktörü ve eklenecek hacim ile etiketleyin. Her seyreltme için üçlü plakalar kullanın.
2. Her seyreltmeden 100 μL'yi, miktarı agar plakasının ortasına pipetleyerek plakaya ekleyin (Şekil 3). Alevle sterilize edilmiş "L" şeklinde bir cam çubuk kullanarak alikotu hemen yayın. Alikot hemen yayılmazsa, plaka üzerinde yerinde emilir ve ilk aşılama noktasında bakteri üremesine neden olur.
3. T_{1'den T 8'e} kadar olan zaman noktaları için her seyreltme serisi için kaplamayı tekrarlayın. Çubuğu plakalar arasında ve özellikle farklı seyreltmeler arasında sterilize etmeyi unutmayın.
4. Plakalar birkaç dakika kuruduktan sonra ters çevirin ve gece boyunca 37 °C inkübatöre koyun. Plakaların ters çevrilmesi, yoğuşmanın agar plakasına düşmesini engeller. Gece boyunca inkübasyondan sonra, plakalar buzdolabında saklanmalıdır.

arası

E.coli kültürü	Kaplanacak dilüsyonlar
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7*	10-5	10-6	10-7
T8*	10-4	10-5	10-6

^*Daha düşük seyreltmeler, ölüm evresi nedeniyle daha düşük popülasyonları hesaba katar.

Tablo 3. E. coli kültürleri için kaplama protokolü.

4. Kolonileri Sayma ve Ortalama Üretim Süresini Hesaplama

1. Plakaları kolonilerin homojenliği ve kontaminasyon eksikliği açısından inceleyin.
2. Her zaman noktası için (T₀ ila T₈), 30 ila 300 koloni içeren bir seyreltme seçin ve üçlü plakaları sayın.
3. Seyreltme faktörünü kullanarak, T₀ ila T₈ zaman noktalarında orijinal kültürün mL başına hücre sayısını geriye doğru hesaplayın. Örneğin, ^10-4 seyreltmeden kaynaklanan koloni sayısı 30, 28 ve 32:
   Ortalama koloni sayısı = 30 koloni
   Bunlar, 0.1 mL'lik ^10-4 seyreltme
   mL başına koloni sayısı = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Çizim günlüğü zamana karşı₁₀ CFU/mL (saat olarak).
5. Grafikten, büyümenin üstel aşamasını tanımlayın. Üstel büyüme fazı içinde 2 zaman noktası ve her seferinde karşılık gelen hücre numaralarını kullanarak ortalama üretim süresini hesaplayın.