$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu veya RT-PCR, ortamdaki RNA virüslerinin ve mikrobiyal gen ekspresyonunun tespit edilmesini sağlar.
Genetik materyal olarak DNA'yı kullanan insanlardan bakterilere kadar hücresel organizmaların aksine, bazı virüslerin grip, Ebola ve HIV gibi birçok patojenik virüs de dahil olmak üzere RNA'dan yapılmış genomları vardır. Bazı virüsler, hücre kültüründeki hücreleri enfekte etmek için kullanıldığında gelişen patojenik fenotipi gözlemleyerek tespit edilebilirken, çoğunluğunun kültüre dayalı karakterizasyon yöntemleri yoktur. RT-PCR, bu virüslerin ortamdaki varlığını yüksek hassasiyetle tespit etmek için kullanılabilir.
Aynı zamanda, DNA bazlı genomlara sahip organizmalar, DNA genomlarında kodlanan genetik bilgileri, onları haberci veya "m" RNA'ya "transkribe ederek" "ifade eder", bu daha sonra hücrelerde enzimatik veya yapısal işlevi yerine getirmek için proteinlere "çevrilebilir". Mikroplar, çeşitli genetik yolları açıp kapatarak çevredeki değişikliklere yanıt verip uyum sağladıkça, RT-PCR, potansiyel ekosistem değerlendiricileri olarak hizmet etmek üzere gen ifadesindeki bu tür değişiklikleri izlemek için kullanılabilir.
Bu video, RT-PCR'nin arkasındaki ilkeleri gözden geçirecek, bu tekniği gerçekleştirmek için genelleştirilmiş bir prosedürün ana hatlarını çizecek ve son olarak, bu yöntemin bugün çevresel mikrobiyolojide uygulanma yollarından bazılarını inceleyecektir.
Bu prosedürün iki önemli bölümü vardır: biyolojik örneklerden RNA'nın çıkarılması ve ardından DNA'ya ters transkripsiyonu.
RNA'nın izolasyonu, lipitleri ve proteinleri parçalayan bir deterjan eklenerek numunedeki hücrelerin parçalanmasını ve ardından mekanik bozulmayı içerir. Virüslerden RNA'nın çıkarılması genellikle, virüslerin kapsidlerini (viral partikülü oluşturan sert protein kaplamaları) parçalamak için protein sindiren enzimler olan proteinazların eklenmesini gerektirir. Öte yandan, hücresel organizmalardan RNA elde edilirken, aşağı akış sonuçlarının kimyasal olarak benzer DNA'nın varlığı ile karıştırılmasını önlemek için lizatın DNA parçalayıcı enzimler veya DNAazlar ile muamele edilmesi gerekebilir.
RNA daha sonra lizatlardan iki yoldan biriyle saflaştırılabilir. Asit guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu olarak bilinen bir yöntemde, lizat, daha sonra fazları ayırmak için santrifüjlenen organik-sulu bir karışım ile karıştırılır. Proteinler organik faza, parçalanmış hücre kalıntıları bulutlu interfaza ve nükleik asitler sulu faza bölünecektir. Üst sulu faz daha sonra toplanabilir ve RNA, nükleik asidin sudaki çözünürlüğünü azaltan izopropanol gibi alkol ilavesiyle çökeltilir.
Sütun bazlı RNA izolasyonunda, lizat alkol ile karıştırılır ve daha sonra silika gibi negatif yüklü bir reçine ile bir jel filtrasyon kolonundan geçirilir. Lizat, tampondaki pozitif yüklü iyonların, nükleik asitlerin negatif yüklü fosfat omurgasının reçineye bağlanmasına izin veren "tuz köprüleri" oluşturması için hazırlanır. Diğer tüm kirleticiler daha sonra yıkanır. Nükleik asitler, düşük tuzlu bir tampon veya su kullanılarak kolondan "ayrıştırılır". Tek sarmallı RNA, çift sarmallı DNA'dan daha az negatif yüke sahip olduğundan, tercihen belirli konsantrasyonlardaki tamponlar kullanılarak ayrıştırılabilir.
İzole edildikten sonra, RNA kimyasal olarak daha kararlı DNA'ya dönüştürülür. Bilim adamları, HIV gibi retrovirüsler tarafından doğal olarak kodlanan bir enzimi kullandılar. Bu enzim ters transkriptaz veya "RT" olarak bilinir.
RT, primer olarak bilinen kısa bir nükleotid dizisinden tamamlayıcı veya "c" DNA'sı sentezler. Bu astar, deneyin amacına bağlı olarak farklı dizilere sahip olabilir. Örneğin, primer, belirli genleri veya organizmaları tespit etmek için belirli bir diziye sahip olacak şekilde tasarlanabilir. Sentezlendikten sonra, bu "ilk iplikçik" cDNA, düzenli PCR ile amplifiye edilebilir.
Artık RT-PCR'nin arkasındaki ilkeleri anladığımıza göre, bu tekniği çevreden toplanan RNA örnekleri üzerinde gerçekleştirmek için bir protokole bakalım.
Prosedüre başlamak için, GPS koordinatlarını veya görüşünü kullanarak bir numune toplama yeri bulun. Mikrobiyal habitatların genel bir araştırmasını almak için bir alan içindeki rastgele noktaları seçin.
Katı numuneyi toplamak için, bir el burgusunu önceden belirlenmiş derinliğe kadar zemin toprağına itin ve bükün. Burgu kaldırıldığında, burgunun içi boş gövdesi içinde toprak bulunabilir.
Bu toprak doğrudan bir toprak toplama torbasına kazınır ve torba, toplama yeri, adı, tarihi, saati ve diğer gerekli bilgilerle etiketlenir.
Toprağı laboratuvara aktarın ve çakıl ve kayayı çıkarmak için toprağı 2 mm'lik bir elekten geçirin. Topraktaki mikrobiyal aktivite seviyesi hakkında bilgilendirici olabilecek nem içeriği için bir toprak örneğini analiz edin. Bunu yapmak için, bu koleksiyonun "Toprağın Nem İçeriğinin Belirlenmesi" videosuna bakın.
Su örneği toplamak için, toprak toplamaya benzer bir ilgi alanı seçin ve suyu steril, kalın duvarlı bir plastik şişeye toplayın. Toplanan su hacmini not edin. Numunede beklenen mikrobiyal seviyeler hakkında önemli bilgiler sağlayabilecek sıcaklık, pH ve tuzluluk gibi parametreler için suyu hemen test edin. Ardından şişeyi soğutucuya yerleştirin ve laboratuvara aktarın.
Virüsler gibi mikroorganizmalar çevresel numuneden toplanır ve konsantre edilir.
RNA, toplanan virüslerden, üreticinin talimatına göre ticari RNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak spin kolon yöntemi ile ekstrakte edilebilir. Etanol ile takviye edilmiş lizis tamponu önce numune ile karıştırılır. Uygun sayıda döndürme kolonunu toplama tüplerine yerleştirin, ardından numuneleri kolon matrisine uygulayın. Nükleik asitlerin kolona bağlanmasını sağlamak için kolonları yaklaşık 12.000 x g'da 1-2 dakika santrifüjleyin ve sıvı akışını atın.
Sütunlara yıkama tamponu ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Sütunları yeni, steril 1,5 mL düşük yapışma özelliğine sahip mikrofüj tüplerine yerleştirin. Ardından, RNA'yı parçalayan enzimler olan RNazlardan arınmış suyu sütunlara ekleyin ve RNA'yı elüte etmek için 30 saniye santrifüjleyin. Ayrıştırılan RNA -80 ° C'de saklanabilir. Kullanana kadar C.
Deneyden önce, belirli mikroorganizmaların varlığı için belirteç görevi görebilecek ilgilenilen dizileri tespit etmek için uygun primerler tasarlanmalıdır.
-20 ° C'de saklanan RT reaktiflerini çıkarın. C ve donmuş reaktifleri buz üzerinde (veya oda sıcaklığında) çözün. Bunlar arasında nükleotidler, ters transkripsiyon tamponu ve primerler bulunur. Çözüldükten sonra reaktifleri buz üzerinde tutun; ters transkriptaz enzimi ve RNaz İnhibitörü her zaman buz üzerinde tutulmalıdır.
Reaktifler çözülürken, reaksiyonun bileşenlerinin hacimlerini ve konsantrasyonlarını hesaplayın. Reaktifler çözüldükten sonra, içeriğin iyice karıştığından emin olmak için her bir tüpü hafifçe girdaplayın ve döndürün.
Kontaminasyonu önlemek için laminer akış başlığında çalışarak, her bir PCR tüpüne eklemek için bileşenleri bir ana karışımda birleştirin. Ana karışımı bir Eppendorf tüpüne monte ederken, kontaminasyonu önlemek için her bir reaktif arasında pipet uçlarını değiştirdiğinizden emin olun. Tüm reaktifler Eppendorf tüpüne eklendikten sonra, homojen bir karışım sağlamak için ana karışım tüpünü nazikçe girdaplayın ve aşağı doğru döndürün.
Kontrolleri dahil ettiğinizden emin olarak bir dizi PCR tüpünü etiketleyin. Her tüpe eşit miktarda ana karışım ekleyin. Ardından, negatif kontrol için RNA özleri veya su gibi reaksiyona özgü bileşenler ekleyin.
Tüm bileşenler eklendikten sonra, tüpleri bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve ters transkripsiyon programını çalışacak şekilde ayarlayın. cDNA daha sonra PCR amplifikasyonuna tabi tutulabilir. Bu adımın ayrıntılı bir açıklaması için bu koleksiyonun PCR ile ilgili videosuna bakın.
PCR tamamlandığında, PCR ürününün bir kısmı ayrılabilir ve bir agaroz jel üzerinde görselleştirilebilir. Örneğin, burada bir RNA virüsünün varlığını tespit etmek için gene özgü bir primer kullanıldı. Beklenen büyüklükteki bantlar RT-PCR reaksiyonundan elde edilir, ancak negatif kontrollerden elde edilmez, bu da test edilen su örneğinde bu virüsün varlığını gösterir.
RNA bazlı mikroorganizmaların RT-PCR ile tanımlanması, ekolojik sağlığın, çevresel risklerin ve biyolojik çeşitliliğin korunmasının analiz edilmesini sağlar.
Kirli toprak ve sudaki hidrokarbonları ve çözücüleri temizlemek için mikroorganizmaların kullanılması, ekolojik sürdürülebilir bir iyileştirme alternatifini temsil eder. Doğal mikrobiyal gen ekspresyonunu anlamak, bu koşullar altında kirleticileri parçalayan spesifik mikrobiyal yolları vurgulayabilir. RT-PCR genellikle bu tür çevresel örneklerden mRNA'yı amplifiye etmek için kullanılır.
Halk sağlığı önlemleri genellikle çevredeki viral enfeksiyon kaynaklarının hızlı bir şekilde izlenmesini gerektirir. Örneğin Kuş Gribi oldukça bulaşıcıdır ve hızla kümes hayvanlarına, çiftlik hayvanlarına ve hatta insanlara yayılabilir. Bu özel örnekte, araştırmacılar yabani kuşlar tarafından yayılan Kuş Gribi tehdidini aradılar.
Taşınabilir bir RT-PCR kurulumu ve aparatı kullanarak, enfeksiyonları erken tespit etmek ve bulaşmayı önlemek için uzak bölgelerde bile bir dizi yabani kuşu taradılar.
Son olarak, RT-PCR, Kuzey Amerika'daki asmalara ciddi şekilde zarar veren bir hastalığa ev sahipliği yapan camsı kanatlı keskin nişancı Homalodisca vitripennis gibi zararlıları hedeflemek için geliştirilen "biyopestisitleri" karakterize etmek için kullanılabilir. Bu böceği enfekte etmek için bir ajan olarak yeni bir tek sarmallı RNA virüsü geliştirilmektedir. Homalodisca hücre kültürü ve viral yükün RT-PCR onayının bir kombinasyonunu kullanarak, bu yazarlar biyolojik kontrol ajanı olarak kullanılmak üzere yüksek konsantrasyonda bir virüsü çoğaltabildiler.
JoVE'nin RNA Tabanlı Çevresel Organizmaları RT-PCR ile Analiz Etme kitabına girişini az önce izlediniz. Artık protokolün arkasındaki teoriyi, tekniği araştırmanıza nasıl uygulayacağınızı ve bugün sahada nasıl kullanıldığını anlamalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler!
