RT-PCR Kullanarak Çevresel Örneklerin RNA Analizi

1. Numune Toplama: Toprak Numunesi

1. GPS, koordinatlar veya görüş yoluyla örnek bir konum bulun.
2. Rastgele örnekleme için, mikrobiyal habitatların genel bir sayımını elde etmek için bir alan içindeki rastgele noktaları seçin. Transect örneklemesi, bir dere yatağına bitişik , örneğin düz bir çizgi boyunca noktalardan toplanır. Izgara örnekleri sistematik olarak düzenli aralıklarla noktalardan alınır ve bilinmeyen veya değişken bir alandaki mikrobiyal toplulukları haritalamak için kullanışlıdır.
3. 3-6 inç (7,5-15 cm) derinlikte numune alma, rizosferin (bitki kökleri ve bunlarla ilişkili mikroorganizmalar tarafından doğrudan etkilenen dar toprak bölgesi) yakınında olan ancak içinde olmayan en bol mikrobiyal aktiviteye erişim sağlar.
4. Toprak örneğini toplamak için, bir el burgusunu önceden belirlenen derinliğe kadar zemine itin ve bükün.
5. Burguyu kaldırın. Toprak, burgunun içi boş gövdesinin içinde bulunur.
6. Burgunun altındaki toprağı bir toprak toplama torbasına kazıyın. Toprağa dokunmadığınızdan veya kirletmediğinizden emin olun.
7. Çantayı konum, ad, tarih ve saat ile uygun şekilde etiketleyin.
8. Laboratuvarda, çakıl ve kayaları çıkarmak için toprağı 2 mm'lik bir elekten geçirin.
9. Toprak nem içeriği için toprağın bir kısmını analiz edin. Bu adımın ayrıntıları için lütfen toprak nemi ile ilgili JoVE Bilim Eğitimi videosuna bakın.

2. Numune Toplama: Su Numunesi

1. Örnek konumunu GPS, koordinatlar veya görüş yoluyla bulun.
2. Suyu bir saklama şişesinde toplayın. Toplanan su hacmini kaydedin; Numunedeki mikroplar kantitatif olarak test edilirse, mikrobiyal konsantrasyon toplanan hacme göre belirlenebilir.
3. Uygun elektronik probları kullanarak deney için gerekli herhangi bir parametre (sıcaklık, pH, iletkenlik, tuzluluk, nitrojen ve fosfor içeriği vb.) için suyu hemen test edin.
4. Su örneğini içeren şişeyi buzlu bir soğutucuya yerleştirin. Soğutucuyu laboratuvara aktarın.

3. RNA Ekstraksiyonu

1. Çevresel numuneden mikroorganizmaları toplamak ve konsantre etmek için lütfen topluluk nükleik asit ekstraksiyonu hakkındaki JoVE Bilim Eğitimi videosuna bakın.
2. Üreticinin talimatlarına göre ticari bir ekstraksiyon kiti kullanarak virüslerden RNA'yı çıkarın.
3. Kısaca, numuneleri önce etanol ile takviye edilmiş lizis tamponu ile karıştırın, ardından numuneleri döndürme kolonlarına ekleyin.
4. Sütunları yaklaşık 12.000 x g'da santrifüjleyin, akışı atın. Sütunlara yıkama tamponu ekleyin ve tekrar santrifüjleyin.
5. Sütunlara RNaz içermeyen su ekleyin ve RNA'yı steril 1,5 mL düşük yapışmalı mikrofüj tüplerine aktarmak için 30 saniye santrifüjleyin.

4. Ters Transkripsiyon - PCR

1. -20 °C dondurucudan aşağıdaki reaktifleri alın: dNTP, konsantre (, örneğin , 10x) ters transkripsiyon tamponu, primerler (bu örnekte, rastgele primerler). Bunları buz üzerinde veya oda sıcaklığında temiz bir kaputun içinde çözdürün ve çözüldükten sonra buz üzerinde tutun. Ayrıca ters transkriptaz ve RNaz inhibitörünü alın ve buz üzerinde tutun.
2. Her reaksiyon arasında sabit olan tüm reaktifleri birleştiren bir "ana karışım" yapmak için gereken reaktif hacimlerini hesaplayın (örnek reaksiyon için Tablo 1'ye bakın). Her numune için yeterli ana karışımın yanı sıra bir pozitif kontrol (bilinen bir transkript şablonu kullanarak) ve negatif kontrol (, örneğin , ters transkriptaz olmadan, şablon olarak sadece su ile, vb.) reaksiyonları hazırlayın. Hacme fazladan ekleyin.
3. Ana karışımı 1,5 mL'lik düşük yapışma özelliğine sahip mikrofüj tüplerinde birleştirin. Bu, reaktif moleküllerinin tüplerin plastik duvarlarına bağlanmasını en aza indirir.
4. Reaktifler çözüldüğünde, mikrofüj tüpüne hesaplanan hacimleri ekleyin. Eklemeden önce her tüpü nazikçe girdap haline getirin ve santrifüjleyin. Kontaminasyonu önlemek için her bir reaktifi eklerken pipet uçlarını değiştirdiğinizden emin olun.
5. Tüm reaktifler eklendikten sonra, homojen bir karışım sağlamak için ana karışımı vorteksleyin ve santrifüjleyin. Reaktifleri -20 °C'de tekrar depoya koyun.
6. Her numune veya kontrol reaksiyonu için bir tüp belirleyerek 8 tüplü PCR şeritlerini hazırlayın ve etiketleyin.
7. Her tüpe eşit miktarda ana karışım ekleyin. Ardından, RNA özleri gibi reaksiyona özgü bileşenleri ekleyin.
8. Şerit kapağını PCR şeridine güvenli bir şekilde yerleştirin ve tüm sıvının her tüpün dibinde toplandığından emin olmak için bir şerit tüp adaptörü ile bir mini santrifüjde santrifüjleyin (Şekil 2).
9. PCR şeridini termocycler'a güvenli bir şekilde yerleştirin. Tüplerin sabitlendiğinden emin olmak için aşağı bastırın.
10. Termocycler'ı, kullanılan RT'ye uygun programı çalıştıracak şekilde ayarlayın (örnek bir protokol için Tablo 2'ye bakın). Program tamamlandığında, tüpler daha sonra PCR amplifikasyonuna tabi tutulabilecek cDNA ürünleri içerecektir. Ayrıntılar için lütfen PCR ve kantitatif PCR ile ilgili JoVE Science Education videolarına bakın. cDNA'yı kullanana kadar -20 °C'de saklayın.

Şekil 2. Ana karışım ve ekstrakt içeren kapaklı 8 tüplü şerit.

Reaktif	1 reaksiyon başına hacim (μL)
10x RT Arabelleği	2.0
25x dNTP	0.8
10x Rastgele Primer	2.0
Çoğalt	1.0
Rnaz İnhibitörü	1.0
Moleküler Sınıf H2O	3.2
Toplam Hacim	10

Tablo 1. RT Master Karışım Malzemeleri.

Adım 1	Adım 2	Adım 3	Adım 4
25 °C , 10 dk	37 °C , 120 dk	85 °C , 5 dk	4 °C , ∞

Tablo 2. RT Reaksiyon Termodöngüleyici Programı.