$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonunun veya qPCR'nin ortaya çıkışı, çevresel bir numunedeki herhangi bir mikroorganizmanın miktarını kantitatif olarak belirlemeyi mümkün kılmıştır.
Standart PCR gibi, qPCR de ilgilenilen organizmalara özgü DNA dizilerinin varlığını veya yokluğunu tespit ederek mikroorganizmaları tanımlar. Bu, laboratuvarda kültürlenemeyen mikropların tespit edilmesine izin vererek, çok daha geniş bir çevresel organizma yelpazesinin test edilmesini mümkün kılar. Ek olarak, qPCR, DNA miktarının kantitatif olarak değerlendirilmesine izin verir. Ancak aynı zamanda, PCR metodolojileri, ölü veya diri tüm organizmalardan alınan DNA'yı tespit ederek, numunede yalnızca aktif olarak büyüyen mikropları arama yeteneğini sınırlar.
Bu video, qPCR'yi normal PCR'den ayıran kimyasal yenilikleri gözden geçirecek, qPCR'nin DNA'yı kantitatif olarak ölçmek için nasıl kullanılabileceğini açıklayacak, toprak örneklerinden bir RNA virüsünü tespit etmek için qPCR kullanmak için bir protokol gösterecek ve son olarak, qPCR'nin bugün çevresel mikrobiyolojiye nasıl uygulandığını gösterecektir.
qPCR'nin arkasındaki temel ilkeler, normal PCR ile aynıdır - şablona tekrarlanan primer tavlama döngüleri, PCR ürününün uzaması ve ürünün şablondan denatürasyonu, amplikon olarak bilinen bir hedef ilgi dizisinin üstel amplifikasyonuna yol açar, bir başlangıç materyali havuzundan.
qPCR'nin yeniliği, reaksiyona floresan kimyasalların eklenmesidir, bu da her döngüde PCR ürününün sentezinin özel termodöngüleyiciler tarafından doğrudan "gerçek zamanlı" olarak görselleştirilmesini sağlar ve bu da orijinal numunedeki şablon dizisi miktarını ölçmeyi mümkün kılar. Miktar genellikle, floresan ürün miktarının arka plan seviyesini aştığı PCR döngüsü olan PCR döngüsü olan miktar belirleme döngüsü veya Cq olarak da bilinen kısaltılmış Ct olan eşik döngüsü cinsinden ölçülür.
Kuantifikasyon, bir dizinin Ct değerinin başka bir standart veya kontrol dizisininkiyle karşılaştırıldığı göreceli olabilir; bağıl miktar, Ct'deki farkın gücüne yükseltilmiş ikiye eşittir. Alternatif olarak, reaksiyondaki numunelerin yanında bilinen miktarda bir DNA dizisi çalıştırılırsa, floresan değerini DNA miktarıyla karşılaştıran standart bir eğri üretilebilir, ve örnek DNA'nın mutlak olarak nicelleştirilmesine izin verir.
qPCR'de kullanılan iki geniş floresan molekül türü vardır. Bir durumda, spesifik olarak çift sarmallı DNA'ya bağlanan floresan boyalar reaksiyona dahil edilir. Boya sadece DNA'ya bağlandığında floresan verir, böylece çift sarmallı DNA ürününün miktarının ölçülmesine izin verir.
Diğer yöntemde, prob olarak bilinen kısa bir DNA dizisi, belirli bir hedef ilgilenilen diziye karşı tasarlanmıştır. Prob, kimyasal olarak bir floresan boyaya ve ayrıca yakın olduğunda boyadan gelen floresan sinyalini bastıran bir "söndürücü" molekülüne bağlanır. DNA ürününü sentezleyen polimeraz enzimi, floresan molekülünün probdan "salınmasına" neden olacak, böylece boyayı söndürücüden ayıracak ve floresan sinyalinin tespit edilmesini sağlayacak bir DNA parçalayıcı aktiviteye sahiptir.
Artık qPCR'nin arkasındaki ilkeleri anladığınıza göre, bitkileri enfekte eden bir RNA virüsünü, biber hafif benek virüsünü toprak örneklerinden tanımlamak için bu tekniği kullanmak için bir protokole bakalım.
Bu demonstrasyonda, köklerden ve onların simbiyotik mikroorganizmalarından etkilenen bitki köklerinin etrafındaki yaklaşık 7 mm'lik toprak bölgesi olan rizosferden numune toplanacaktır.
Rizosfer toprağını toplamak için, önce ilgilenilen bitkiyi yerden dikkatlice çıkarın ve mümkün olduğunca fazla dökme toprağı çıkarmak için ona vurun. Tesisi laboratuvarda daha fazla işlenmek üzere paketleyin.
Numuneleri laboratuvara geri getirdikten sonra, istenen toprağı bir toplama kabına sıyırmak için steril bir spatula kullanın. Daha sonra virüsü topraktan toplayın ve RNA'yı çıkarın.
Numuneden RNA toplandıktan sonra, ters transkripsiyon yoluyla tamamlayıcı veya cDNA'ya dönüştürün. Bu prosedürün ayrıntıları için lütfen ters transkripsiyon-PCR ile ilgili JoVE SciEd videosuna bakın.
qPCR'yi gerçekleştirmeye hazır olduğunuzda, donmuş reaktifleri oda sıcaklığında özel bir laminer akış başlığı içinde çözdürün ve çözüldükten sonra buzun üzerine yerleştirin. DNA polimeraz enzimini içeren reaktif bileşenleri her zaman buz üzerinde tutulmalıdır.
Örnek cDNA'yı ve içine klonlanmış ilgi amplikonuna sahip bir plazmit olarak bilinen dairesel bir DNA parçası gibi pozitif bir kontrol DNA'sını çözün.
Reaksiyonları 96 oyuklu bir qPCR plakasına monte etmeden önce, kağıt üzerinde 96 hücreli bir tablo şablonu hazırlayın ve her hücreyi plakaya yüklenecek reaksiyonla etiketleyin. Her numune için reaksiyonları ve standardı üç nüsha halinde dahil edin, ayrıca DNA'sız reaksiyon gibi pozitif kontrol ve negatif kontrol için de reaksiyonları dahil edin.
Reaksiyonlar arasında sabit olan tüm reaktifleri içeren bir reaksiyon "ana karışımı" için gereken reaktif hacimlerini hesaplayın. Tüm numuneler ve kontroller için üçlü reaksiyonlar için yeterli ana karışım ve pipetleme hatasını hesaba katmak için ek %10 ana karışım hazırlayın.
Reaktifler çözüldükten sonra, ana karışımı 1.5 mL'lik düşük adsorpsiyonlu bir mikrofüj tüpünde birleştirin. Bunu yapmak için, her bir reaktifi iyice karıştırmak için kısaca girdaplayın, bir mini santrifüj kullanarak tüplerin yan tarafındaki herhangi bir sıvıyı toplayın ve reaktifi mikrofüj tüpüne pipetleyin. Her reaksiyon bileşeni için yeni pipet uçları kullandığınızdan emin olun. Tüm reaktifler eklendikten sonra, karıştırmak ve santrifüjlemek için girdap. Ardından, uygun miktarda ana karışımı PCR plakası üzerinde belirtilen oyuklara alikot edin.
Daha sonra, her bir tüpü numune ve kontrol DNA'sı ile girdaplayın ve santrifüjleyin ve uygun miktarı PCR plakasındaki ilgili kuyucuklara pipetleyin. Numuneler eklendikten sonra, plakayı bir sızdırmazlık folyosu ile kapatın ve contayı tamamen düzleştirmek ve hava kabarcıklarını dışarı itmek için sızdırmazlık aletini kullanın. Yapışkan olmayan tırnakları contanın uçlarından dikkatlice yırtın.
Reaksiyon karışımını kuyucukların dibine tam olarak toplamak için, reaksiyon plakasını bir plaka tutuculu bir santrifüje yerleştirin ve rotoru bir karşı ağırlık plakası ile uygun şekilde dengeleyin. Plakayı 1.000 rpm'ye kadar nabız santrifüjü yapın, ardından santrifüjün frenler olmadan yavaşça durmasına izin verin.
Reaksiyon plakasını qPCR makinesine yerleştirin. PCR programını üreticinin spesifikasyonuna göre ayarlayın ve erime sıcaklığını kullanılan astar çiftine göre ayarlayın. Reaksiyon programını çalışacak şekilde ayarlayın.
qPCR programı tamamlandıktan sonra, yazılım her reaksiyondaki cDNA miktarını hesaplamak için pozitif kontrolün bilinen konsantrasyonlarını kullanabilecektir. Orijinal numunedeki virüs miktarı daha sonra hesaplanabilir.
qPCR programı tamamlandıktan sonra, yazılım her reaksiyondaki cDNA miktarını hesaplamak için pozitif kontrolün bilinen konsantrasyonlarını kullanabilecektir.
qPCR'den elde edilen sonuçlar, kuyulara aktarılan hacim, topraktan ekstraksiyon ve ters transkripsiyondan elde edilen faktör ile ilk toprak numunesindeki virüs sayısı hesaplanabilir.
Artık qPCR'nin nasıl yapıldığını bildiğinize göre, farklı çevresel örnekleri analiz etmek için nasıl kullanılabileceğine bakalım.
qPCR, birçok farklı numune türünden kurtarılan virüs miktarını ölçmek için kullanılabilir. Bu uygulamada, su örneklerinden iki farklı türde adenovirüs bir dizi farklı yöntemle konsantre edilmiştir. DNA daha sonra virüslerden ekstrakte edildi ve konsantrasyon yöntemlerinin nispi verimliliğini değerlendirmek için qPCR'ye tabi tutuldu.
qPCR tabanlı mikrobiyal sayım için başka bir uygulama, gıda ve tarım numunelerindeki bakteri içeriğinin miktarını belirlemektir - bu örnekte, tavuk çiftliklerinden alınan dışkı ve çöp numuneleri. Bilim adamları, tek tek türleri hedeflemek yerine, tüm bakterilerde bulunan yüksek oranda korunmuş bir gene karşı primerler kullanarak qPCR gerçekleştirdiler ve örneklerde bulunan toplam bakteri topluluğunu ölçtüler.
Son olarak, daha önce de belirtildiği gibi, geleneksel qPCR metodolojisinin bir dezavantajı, canlı ve ölü mikropların ayırt edilememesidir. Bununla birlikte, propidium monoazid veya PMA olarak bilinen ve PCR gibi sonraki enzimatik reaksiyonları inhibe etmek için DNA'ya bağlandığı yerde ölü hücrelere girebilen bir kimyasal ekleyerek, buradaki araştırmacılar, kontamine gıda ve suda bulunan yaygın bir patojenik suş olan E. coli O157: H7'nin canlı ve ölü kültürlerini ayırt edebildiler.
JoVE'nin qPCR kullanarak çevresel mikroorganizmaları ve virüsleri ölçmeye yönelik tanıtımını izlediniz. Artık qPCR'nin nasıl çalıştığını, çevresel bir numunedeki bir mikrop miktarını ölçmek için qPCR'nin nasıl kullanılacağını ve bu tekniğin bazı uygulamalarını anlamalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler!