Kalibrasyon Eğrileri

Kalibrasyon eğrileri, bir analite verilen enstrümantal yanıtı anlamak ve bir numunedeki analit konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılır.

Önce analitin bilinen konsantrasyonlarına sahip bir dizi standart çözelti hazırlanarak bir kalibrasyon eğrisi oluşturulur. Cihaz tepkisi her biri için ölçülür ve standart çözeltinin konsantrasyonuna göre çizilir. Bu grafiğin doğrusal kısmı daha sonra, konsantrasyona tepkisini ilişkilendirerek bir analit numunesinin konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılabilir.

Bu video, bir dizi standardın hazırlanmasını ve ardından konsantrasyonu bilinmeyen bir numunenin analizini göstererek kalibrasyon eğrilerini ve bunların kullanımını tanıtacaktır.

Kalibrasyon eğrisini hazırlamak için bir dizi standart çözelti kullanılır. Bu çözeltiler, analitin yaklaşık konsantrasyonunu kapsayan bir dizi konsantrasyondan oluşur.

Standart çözeltiler genellikle seri bir seyreltme ile hazırlanır. Seri bir seyreltme, önce analitin bir stok çözeltisi hazırlanarak gerçekleştirilir. Stok çözeltisi daha sonra bilinen bir miktarla, genellikle bir büyüklük sırası ile seyreltilir. Yeni çözelti daha sonra aynı şekilde seyreltilir ve bu şekilde devam eder. Bu, birkaç büyüklük sırası arasında değişen konsantrasyonlara sahip bir dizi çözelti ile sonuçlanır.

Kalibrasyon eğrisi, enstrümantal sinyale karşı konsantrasyonun bir grafiğidir. Standartların grafiği doğrusal olmalıdır ve y=mx+b denklemine uygun olmalıdır. Grafiğin doğrusal olmayan kısımları, bu konsantrasyon aralıkları doğrusallık sınırının dışında olduğu için atılmalıdır.

En uygun hattın denklemi daha sonra konsantrasyon ile ilişkilendirmek için cihaz sinyali kullanılarak numunenin konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Grafiğin doğrusal aralığının dışında kalan ölçümlere sahip numuneler, doğrusal aralıkta olmak için seyreltilmelidir.

Cihazın algılama limiti veya gürültü üzerinden istatistiksel olarak belirlenebilen en düşük ölçüm, kalibrasyon eğrisinden de hesaplanabilir. Boş bir numune birden çok kez ölçülür. Algılama limiti genellikle ortalama boş sinyal artı standart sapmasının 3 katı olarak tanımlanır.

Son olarak, nicelik sınırı da hesaplanabilir. Kantifikasyon limiti, doğru bir şekilde ölçülebilen en düşük analit miktarıdır. Bu, boş sinyalin üzerinde 10 standart sapma olarak hesaplanır.

Artık bir kalibrasyon eğrisinin temellerini öğrendiğinize göre, laboratuvarda nasıl hazırlanacağını ve kullanılacağını görelim.

İlk olarak, standardın konsantre bir stok çözeltisini hazırlayın. Standardı doğru bir şekilde tartın ve hacimsel bir şişeye aktarın. Az miktarda çözücü ekleyin ve numunenin çözülmesi için karıştırın. Ardından, çözücü ile çizgiye kadar doldurun. Numune ile aynı çözücüyü kullanmak önemlidir.

Standartları hazırlamak için, hacimsel şişeye gerekli miktarı pipetleyin. Daha sonra şişeyi çözücü ile aynı çizgiye kadar doldurun ve karıştırın.

Stok çözeltisinden pipetleyerek ve seyrelterek standartları oluşturmaya devam edin. İyi bir kalibrasyon eğrisi için en az 5 konsantrasyona ihtiyaç vardır.

Şimdi, kalibrasyon eğrisi için gereken enstrümantal yanıtı belirlemek için numuneleri analitik cihazla, bu durumda bir UV-Vis spektrofotometresiyle çalıştırın.

İlk standardın ölçümünü alın. Herhangi bir sistematik hata olması durumunda standartları rastgele sırayla çalıştırın. Gürültü tahmini elde etmek için her standardı 3?5x ölçün.

Standartların geri kalanını ölçün, her biri için ölçümleri tekrarlayın. Tüm verileri kaydedin.

Son olarak, örneği çalıştırın. Standartlar için kullanılanla aynı numune matrisini ve ölçüm koşullarını kullanın. Numunenin standartlar aralığında ve cihazın limiti dahilinde olduğundan emin olun.

Kalibrasyon eğrisini oluşturmak için, verileri sinyal ve konsantrasyon olarak çizmek için bir bilgisayar programı kullanın. Hata çubukları oluşturmak için her veri noktası için tekrarlanan ölçümlerin standart sapmasını kullanın.

Eğrinin doğrusal olmayan kısımlarını çıkarın, ardından doğrusal bir regresyon gerçekleştirin ve en uygun çizgiyi belirleyin. Çıktı, y = m x + b şeklinde bir denklem olmalıdır. 1'e yakın bir R2 değeri, iyi bir uyumu gösterir.

Bu, 631 nm'de ölçülen mavi boya #1 için kalibrasyon eğrisidir. Yanıt 0 ile 15 mM arasında doğrusaldır.

En uygun çizginin denklemini kullanarak numunenin konsantrasyonunu hesaplayın. Numune için absorbans 0.141 idi ve 6.02 mM'lik bir konsantrasyona karşılık geldi.

Artık bir kalibrasyon eğrisinin bir UV-Vis spektrofotometresi ile nasıl kullanılabileceğini gördüğünüze göre, diğer bazı kullanışlı uygulamalara bir göz atalım.

Elektrot sinyalinin çözeltideki iyonların konsantrasyonuna göre kalibre edilmesi gerektiğinden, kalibrasyon eğrileri genellikle elektrokimya uygulamalarında kullanılır. Bu örnekte, florür için iyon seçici bir elektrot için veriler toplanmıştır.

Bir çizgi elde etmek için konsantrasyon verileri günlük ölçeğinde çizilmelidir. Bu kalibrasyon eğrisi, diş macunu veya içme suyu gibi bir çözeltideki florür konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabilir.

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC, analitik kimyada yoğun olarak kullanılan bir ayırma ve analiz tekniğidir. HPLC, moleküllerin kromatografi kolonunun uzunluğunu kat etmesi için gereken süreye bağlı olarak bir karışımın bileşenlerini ayırır. Bu süre, moleküllerin bir dizi kimyasal özelliğine bağlı olarak değişir.

Moleküllerin elüsyonu bir dedektör kullanılarak ölçülür ve bu da bir kromatogram ile sonuçlanır. Tepe alanı, bu popüler soda bileşenleri örneğinde olduğu gibi, bir dizi standart çözeltinin basit bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak konsantrasyonla ilişkilendirilebilir.

Çözelti matrisinin çözünen maddenin ölçümüne müdahale ettiği bazı durumlarda, klasik bir kalibrasyon eğrisi yanlış olabilir. Bu durumlarda, değiştirilmiş bir kalibrasyon eğrisi hazırlanır. Bunun için numuneye bir dizi standart çözelti hacmi eklenir. Konsantrasyon grafiğine sinyal, x kesişiminin numune çözeltisinin orijinal konsantrasyonuna eşit olduğu yerde oluşturulur. Bu teknik hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen JoVE fen eğitimi videosunu izleyin, "Standart toplama yöntemi".

Az önce JoVE'nin kalibrasyon eğrisine girişini izlediniz. Artık kalibrasyon eğrisinin nerede kullanıldığını, nasıl oluşturulacağını ve numune konsantrasyonlarını hesaplamak için nasıl kullanılacağını anlamalısınız.

Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!