Su Örneklerinden Fekal Bakterilerin Filtrasyon ile İzolasyonu

Membran filtrasyonu ve ardından toplanan bakterilerin kültürlenmesi, bir su kaynağının kalitesini ve temizliğini değerlendirmek için yararlı bir tekniktir.

Tarım, eğlence veya evsel ortamlarda kullanılmak üzere tasarlanan suyun kalitesi, su kaynaklı hastalık salgınları potansiyeli nedeniyle büyük önem taşımaktadır. Su, hayvanlardan veya insanlardan gelen dışkı maddesi ile kontamine olmuşsa, patojenik parazitler, bakteriler veya virüsler yutulduktan sonra yeni konakçılara yayılabilir. Bu nedenle, hastalığa neden olan bu tür organizmalar için su kaynaklarının izlenmesi, halk sağlığını sağlamak için kritik öneme sahiptir.

Bir su kaynağında bulunabilecek fekal-oral patojenlerin sayısı ve çeşitliliği, her biri için bağımsız ve düzenli olarak test yapmayı pratik hale getirir. Bunun yerine, su kalitesi için yaygın mikrobiyolojik analizler koliform indikatör bakterileri kullanır. Bu süreç hakkında daha fazla bilgi için, bu koleksiyonun indikatör organizmalar hakkındaki videosuna bakın.

Bu video, bir çevresel su numunesi üzerinde membran filtrasyon sürecini gösterecek, toplam koliformlar, fekal koliformlar ve fekal enterkoklar dahil olmak üzere çeşitli fekal indikatör bakteri türlerinin nasıl kültürleneceğini gösterecek ve fekal kontaminasyonun varlığının nasıl doğrulanacağını açıklayacaktır.

Membran filtrasyon tekniği, su örneklerini bir filtreden çekmek ve bakterileri yakalamak için negatif basınç kullanır. Filtre, tipik olarak yaklaşık 1 μm boyutunda olan bakterilerin yakalanmasına izin veren, minimum ortalama 0,45 μm gözenek boyutuna sahip özel bir zardır. Filtrasyondan sonra, zar agaroz büyüme ortamına uygulanır ve hedef mikroorganizmaları kültürlemek için uygun koşullarda inkübe edilir.

Bu teknik, içme suyu, yüzme havuzları veya göller ve rezervuarlar gibi düşük bulanıklıklı kaynaklar için en idealdir. Partikül madde içeriği yüksek su, filtrenin kirlenmesine veya tıkanmasına neden olarak işlenebilecek hacmi sınırlayabilir. Ek olarak, membran filtrasyonu, çok sayıda arka plan içeren su kaynakları veya ham kanalizasyon gibi koliform olmayan bakteriler için pratik değildir, çünkü bu, kültür ve inkübasyon sırasında hedef koliformların numaralandırılmasının zorluğunu artırabilir.

Bakteri numuneleri filtrede tutulduktan sonra, su numunelerinde bulunan indikatör bakteri türlerini belirlemek için büyüme plakalarına aktarılabilir. Farklı ortam türleri üzerine kaplama, farklı bakteri türleri için seçim yapar ve hızlı tanımlamaya izin verebilir.

Kültüre özgü plakalar üzerinde büyümeden sonra, indikatör bakteri kimliklerinin daha fazla doğrulanması, kolonilerin sıvı ortama alınması ve yalnızca fekal koliformların varlığında üretilmesi gereken gazları yakalamak için Durham tüplerinin kullanılması gibi teknikler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ek olarak, şüpheli fekal enterokoklar, negatif bir hidrojen peroksit-katalaz testi ile birlikte pozitif bir Gram boyamanın bir kombinasyonu ile doğrulanabilir.

Artık su numunelerinin membran filtrasyonunun arkasındaki ilkelere aşina olduğumuza göre, bu prosedürün nasıl gerçekleştirildiğine bir göz atalım.

Prosedüre başlamak için önce ilgilenilen test suyu kaynaklarından su örnekleri toplayın. Numunelerin steril 1 litrelik şişelerde toplandığından emin olun. Toplama işlemi tamamlandıktan sonra, numuneleri buzun üzerine koyun ve mikrobiyal analiz için laboratuvara taşıyın.

Analize başlamak için önce bir membran filtrasyon manifoldunu sterilize edin. Ardından, manifoldu bir vakum pompasına ve ağartıcı içeren filtrasyon atığı şişesine bağlayın.

Etanol forsepsleri alevle sterilize edin ve steril ızgaralı bir zarı ambalajdan çıkarın. Filtreyi manifoldun membran filtrasyon alanının ortasına yerleştirin ve üniteye steril bir filtre hunisi uygulayın, ardından yerine sabitleyin.

Huniye istenen hacimde test suyu ölçün. Test numunesini filtreden çekmek için kısmi bir vakum uygulayın. Bakteriler ve diğer organik maddeler de dahil olmak üzere 0,45 μm'den büyük askıda katı maddeler filtrenin üzerinde veya içinde tutulurken, daha küçük partiküller, virüsler ve çözünmüş katılar ağartıcı içeren atık şişeye geçecektir.

Numune filtreden geçtikten sonra, huninin içini 3 kez 25 mL steril su ile durulayın ve bunun filtreden geçmesine izin verin. Son durulama tamamlandığında, vakumun bağlantısını kesin ve huniyi manifolddan çıkarın.

Daha sonra, etanol forsepsleri alevle sterilize edin ve membran filtreyi hemen üniteden çıkarın. Yüzeyle tam teması sağlamak ve hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek için yuvarlanma hareketi kullanarak hedef mikroorganizma için uygun büyüme plakasına yerleştirin.

Diğer her numunenin işlenmesi için paslanmaz çelik manifoldu sterilize edin ve çapraz kontaminasyonu önlemek için steril bir huni kullanın. Son olarak, uygun inkübasyon süresi için plakaları bir inkübatöre yerleştirin.

Kuluçka süresinin ardından, sayım için plakaları inkübatörden çıkarın. Mümkünse, koloni sayımlarını soğuk beyaz bir ışık kaynağı kullanarak düşük güç büyütme altında gerçekleştirin. Toplam koliformları belirlemek için, pembe ila koyu kırmızı renkte görünen ve koloniyi tamamen veya kısmen kaplayan metalik bir yüzey parlaklığına sahip kolonileri tanımlayın ve sayın. Atipik toplam koliform koloniler koyu kırmızı, mukoid veya parlaklıksız çekirdekli görünebilir.

Parlaklığı olmadan mavi, beyaz, renksiz veya pembe görünen koloniler koliform olmayan olarak kabul edilir ve toplam koliform sayısına dahil edilmemelidir.

Fekal koliform koloniler mavinin çeşitli tonlarında görünecektir ve bunlar ayrı bir kategori olarak sayılmalıdır. Fekal olmayan koliform koloniler tipik olarak gri ila krem rengindedir ve ayrıca ayrı bir kategoride kaydedilmelidir. Son olarak, fekal enterokok kolonilerinin rengi pembeden koyu kırmızıya kadar değişecektir ve ayrı ayrı sayılmalıdır.

Toplam koliform kolonileri doğrulamak için, ilgilenilen tek bir koloniye sterilize edilmiş ve soğutulmuş bir aşılama halkası uygulayın. Seçilen koloniyi lauril triptoz suyu ve bir Durham tüpü içeren bir cam kaba aktarın. Ardından, kültürleri bir kuluçka makinesine yerleştirin. Durham tüpü tarafından yakalanan gaz üretimi ile birlikte bulanıklığın varlığı, koloniyi toplam koliform olarak doğrular.

Fekal koliform doğrulaması için, mavi renkli kolonileri aseptik olarak steril EC ortamı ve bir Durham tüpü içeren cam kaplara aktarın. Aşılanmış tüpleri bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyondan sonra, gaz üretimi ile bağlantılı olarak bulanık aşılamalar, koloninin bir fekal koliform olduğunu doğrular.

Fekal enterokokları doğrulamak için, doğru morfolojiye sahip şüpheli kolonileri aseptik olarak Beyin-Kalp İnfüzyon Agar plakalarına aktarın ve inkübe edin. Daha sonra, BHIA'daki izole bir koloniden büyümeyi iki steril cam slayta aktarın.

Cam slaytlardan birine 2-3 damla% 3 hidrojen peroksit ekleyin. Hızlı gaz üretimi, Citrobacter gibi katalaz pozitif bir bakteriyi gösterir. Fekal enterokok bakterileri katalaz negatiftir; bu nedenle kabarcıklanma gözlenmez. Kabarcıklanma göstermeyen katalaz negatif koloniler için bir Gram boyama yapın. Fekal enterokoklar olarak, bunlar Gram pozitif, oval şekilli görünmeli ve çoğunlukla çiftler veya kısa zincirler halinde gruplandırılmalıdır.

Bir su kaynağında bu gösterge bakterilerden herhangi birinin bulunması, bir kontaminasyonun varlığını gösterir. Numunelerin %5'inden fazlasının bir aylık süre içinde kontamine olduğu tespit edilirse, kaynağın insan tüketimine uygun olmadığı düşünülebilir.

Membran filtrasyonu, bir dizi biyolojik uygulamada yaygın olarak kullanılmaktadır ve dışkı indikatör organizmalar diğer deneysel prosedürlerle de tespit edilebilir. Bu uygulamalardan bazıları burada incelenmiştir.

Membran filtrasyonu, su örneklerinden virüs yakalamada da kullanılabilir. Virüsler tipik olarak çok düşük seviyelerde bulunacağından, analiz için onları yakalamak için su örneklerinin konsantre edilmesi gerekir. Yakalanan virüsler daha sonra filtrelerden serbest bırakılabilir ve hücre kültürü enfektivite testleri veya PCR gibi teknikler kullanılarak tanımlanabilir.

Membran filtrasyonu, endüstriyel veya laboratuvar kullanımı için yüksek saflıkta su üretiminde de kullanılır. Birçok endüstri, operasyonel süreçleri için yüksek oranda arıtılmış suya ihtiyaç duyar ve membran filtrasyonu, istenmeyen çözünmüş metaller ve tuzlar dahil olmak üzere kirleticileri sudan uzaklaştırmaya hizmet edebilir. İçme suyu üretmek için tuzlu suyun tuzdan arındırılmasında da kullanılabilir.

JoVE'nin membran filtrasyonu ile sudaki indikatör organizmaları tanımlamaya yönelik tanıtımını az önce izlediniz. Artık su numunelerinin nasıl membran filtreleneceğini, membrandan çeşitli dışkı indikatör bakteri türlerinin nasıl kültürleneceğini ve bunların indikatör organizmalar olarak nasıl doğrulanacağını anlamalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler!