Su Örneklerinden Fekal Bakterilerin Filtrasyon ile İzolasyonu

1. Su Numunesi Toplama ve İşleme

1. Test suyu kaynağından ( örneğin su çeşmeleri, yüzme havuzları, rezervuarlar, su dağıtım sistemleri, ham veya arıtılmış kanalizasyon) birkaç 1-L su örneği toplayın ve mikrobiyal analiz için buz üzerinde laboratuvara taşıyın.
2. Kullanmadan önce otoklavlama, UV radyasyonuna maruz kalma (2 dakika) veya etanol alevi ateşlemesi ile membran filtrasyon manifoldu tertibatını sterilize edin veya sterilize edin.
3. Tüm parçaların soğutulmasından sonra, manifoldu bir vakum pompasına ve ağartıcı içeren vakum filtrasyon atık şişesine düzgün şekilde bağlayın.
4. Etanol alevi bir çift forseps sterilize eder ve bunlarla birlikte steril, ızgaralı bir membran filtreyi ambalajından çıkarın. Tipik olarak 47 mm çapında ve 0,45 μm gözenek boyutuna sahip membranlar kullanılır. Bununla birlikte, gözenek boyutunun hedef mikroorganizma(lar)ı yeterince hapsedebilmesi ve filtre alanının en az %70'inin gözenek alanından oluşması koşuluyla alternatif çaplar ve gözenek boyutları kullanılabilir.
5. Filtreyi manifoldun membran filtrasyon alanının ortasına yerleştirin ve üniteye steril bir filtre hunisi uygulayın ve yerine sabitleyin.
6. İstenen hacimde test suyunu ölçün (, örneğin 100 mL) ve huniye ekleyin (huni üzerinde 100 mL'lik bir çizgi işareti görünür).
7. Test numunesini filtreden çekmek için kısmi bir vakum [34 ila 51 kPa (kiloPaskal) basınç farkı] uygulayın. Bakteriler ve çürüyen organik maddeler de dahil olmak üzere, filtrenin ortalama gözenek boyutundan daha büyük olan toplam askıda katı madde 0,45 μm'lik filtre üzerinde tutulur. Virüsler ve az miktarda organik madde ve tuzlar gibi çözünmüş katılar dahil olmak üzere daha küçük parçacıklar, zardan ve ağartıcı içeren atık kabı vakum şişesine geçecektir.
8. Numunenin filtreden tamamen geçmesini takiben, huninin içini iki ila üç adet 20-30 mL hacimde steril su ile durulayın.
9. Vakumu kapatın ve son durulama kapatıldıktan sonra huniyi manifolddan çıkarın.
10. Etanol alevi ile sterilize edilmiş forsepslerle, membran filtreyi hemen üniteden çıkarın ve derhal hedef mikroorganizma için uygun büyüme agaroz ortamına yerleştirin (Tablo 1, her biri için önerilen büyüme ortamını ve inkübasyon koşullarını listeler).
11. Membranın büyüme ortamı ile tam temasını sağlamak ve hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek için membran filtreyi agaroz yüzeyine rulo tipi bir hareketle uygulayın.
12. Kullanılan filtrasyon hunisini her numunenin işlenmesi arasında steril bir ünite ile değiştirin ve çapraz kontaminasyonu önlemek için paslanmaz çelik manifoldu etanol ile sterilize edin.

2. Koloni Sayımı

1. Kuluçka dönemini takiben, sayım için büyüme plakalarını inkübatörden çıkarın.
2. İdeal olarak, koloni sayımlarını serin, beyaz bir ışık kaynağı kullanarak düşük güçte büyütme altında gerçekleştirin.
3. Toplam koliformlar
   1. Toplam koliform koloniler tipik olarak pembe ila koyu kırmızı renktedir ve metalik bir yüzey parlaklığına sahiptir. Parlaklığın kendisi koloniyi kısmen veya tamamen kaplayabilir. Atipik toplam koliform koloni morfolojileri koyu kırmızı, mukoid veya parlaklığı olmayan çekirdekli olabilir.
   2. Parlaklığı yokken pembe, mavi, beyaz veya renksiz olan koloniler koliform olmayan olarak kabul edilir.
4. Fekal koliformlar
   1. Fekal koliform koloniler mavinin çeşitli tonlarında görülür.
   2. Fekal olmayan koliform koloniler gri ila krem rengindedir.
5. Fekal enterokoklar
   1. Fekal enterokok kolonileri pembe ila koyu kırmızı renk arasında değişir.

3. Koloni Doğrulaması

1. Toplam koliformlar
   1. Varlık-yokluk doğrulaması için, steril bir aşılama halkası kullanarak tüm zarı temizleyin. Koloniler için, tipik ve atipik morfolojilerin her birinin en az beşinin doğrulanması tercih edilir.
   2. Seçilen koloniyi bir Durham tüpü ile lauril triptoz suyu içeren bir cam kaba aktarın. Aşılanmış tüpleri 35±0.5 ° C'de 48 saat inkübe edin. Gaz üretimi ile bağlantılı olarak büyümeyi gösteren bulanıklığın varlığı, koloniyi bir koliform olarak doğrular.
2. Fekal koliformlar
   1. Mavi renkli kolonileri aseptik olarak bir Durham tüpü ile steril EC ortamı içeren cam kaplara aktarın. Aşılanmış tüpleri 44.5 ± 0.2 ° C'de 24 saat inkübe edin. Gaz üretimi ile bağlantılı olarak büyümeyi gösteren bulanıklığın varlığı, koloniyi fekal koliform olarak doğrular.
3. Fekal enterokoklar
   1. Beyin-Kalp İnfüzyon Agarına (BHIA) aseptik olarak izolasyon için fekal enterokok morfolojisini karakterize eden kolonileri vurun ve 35 ±ila 0.5 ° C'de 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin.
   2. BHIA'daki izole edilmiş bir koloniden büyümeyi önceden temizlenmiş iki cam slayta aktarın.
   3. Slaytlarda hazırlanan lekelere iki ila üç damla% 3 hidrojen peroksit ekleyin. Kabarcıkların hızlı görünümü "katalaz pozitif" bir sonucu gösterir ve izolat bir dışkı streptokok bakterisi değildir.
   4. "Katalaz negatif" olarak test etmek için bir Gram boyama yapın (kabarcık gözlenmedi). Fekal enterokoklar Gram pozitif, ovaldir ve çoğunlukla çiftler veya kısa zincirler halinde görülürler.

Dışkı Bakteriyel İndikatörü	Önerilen Medya (Kuluçka Sıcaklığı, Süresi)1
Toplam koliformlar	LES Endo Agar (35 ± 5 °C, 24 saat) M-Endo Orta (35 ± 5 °C, 24 saat)
Fekal koliformlar	m-FC Orta (44,5 ± 0,2 °C, 24 saat)
Fekal enterokoklar	m Enterococcus Agar (35 ± 0.5 °C, 48 saat)

Tablo 1. Çevresel örneklerde dışkı bakteri indikatörlerinin tespiti için yaygın olarak kullanılan kültür büyüme ortamı
¹ Su ve Atık Suların İncelenmesi için Standart Yöntemler (Amerikan Halk Sağlığı Derneği ve Amerikan Su İşleri Derneği, 22^nd Baskı, 2012)