2.12: X-ışını Kırınım Analizi için Büyüyen Kristaller

1. Kristal Tüp ve Filtrenin Hazırlanması

1. Bir Erlenmeyer şişesine bir NMR tüpü yerleştirin.
2. Bir pipet filtresi hazırlayın.
   1. Pipete tüy bırakmayan bir mendil (1 inç x 1 inç) yerleştirerek filtreyi oluşturun, ardından mendili pipetin darboğaz kısmına sıkıca sıkıştırmak için bir çubuk kullanın (Şekil 1).
   2. İhtiyaç duyulan her kristal tüp için iki pipet filtresi yapın.

2. Numunenin kristal tüpe eklenmesi

1. Bileşiği (tetrafenilporfirin, 10 mg) 0.75 mL çözücü (diklorometan) içinde çözün.
2. Bir pipetle, karışımı filtreden geçirerek yavaşça tüpün üstüne ekleyin.
   1. Parçacıklar, istenen daha büyük tek kristaller yerine küçük çoklu kristallere yol açabilen çekirdeklenme bölgelerinin oluşmasını önlemek için filtrelenir.
3. Numune kristal tüpe yerleştirildikten sonra, çok yavaş ve nazikçe, anti-çözücüyü (1,5 mL metanol) yeni bir filtre pipeti aracılığıyla tüpe ekleyin. Anti-çözücünün önceden eklenen çözelti üzerinde yavaşça katmanlanmasına izin verin (Şekil 2). Çözücüyü pipetten geçirmek için bir ampul kullanmayın, bunun yerine çözücünün filtreden kendi kendine akmasına izin verin.
   1. Önce kristal tüpe daha yüksek yoğunluklu çözücü eklendiğinden emin olun.
   2. İki çözücünün birbiriyle karışabilir olup olmadığını kontrol edin. Bu, çözücü eklenmeden önce yapılır.
4. Tüpü bir NMR kapağıyla kapatın.

3. Kristal Büyümesi

1. İki çözücünün karışmasına neden olmadan, kristal tüp(ler)i rahatsız edilmeyecekleri bir dolaba yerleştirin.
2. Kristalleşme süresi her bileşikte değişecektir - tipik olarak kristal tüpler bir hafta boyunca bozulmadan bırakılmalıdır.
3. Bir hafta sonra, tüpleri kristal büyümesi açısından inceleyin.
   1. Kristal büyümesi tipik olarak iki çözücünün arayüzünde meydana gelir.
   2. Kristal büyümesinin kanıtı için tüpleri görsel olarak inceleyin. Bileşiğin kristal oluşumu için ek zamana ihtiyaç duyması durumunda, çözücülerin karıştırılmasını kolaylaştırmamaya dikkat edin.
   3. Kristal büyümesinin meydana geldiği görülüyorsa, tüpleri bir mikroskop kullanarak daha fazla inceleyin.

4. Kristal Seçimi

1. X-ışını kırınım kristalleri iyi tanımlanmış yüzlere sahip olmalıdır.
2. Mümkünse bir araya toplanmış kristallerden kaçınılmalıdır.
3. Kristali difraktometreye yerleştirmeden hemen önce, kristali toplamaya hazır olana kadar kristalleri kristal tüpte bırakın.
   1. Kristallerin tüp içinde tutulması, kristallerin çözünmüş halde kalmasını sağlayacaktır. Çözünme, kristallerin çatlamasına neden olabilir ve kristalin kırınımını engelleyebilir.

Şekil 1. Pipet filtresinin bir görüntüsü. Pipetin darboğazına küçük bir parça tüy bırakmayan mendil sıkıca sıkıştırılmıştır. Çözeltiler, kristal tüpe verilmeden önce bu pipet filtrelerinden geçirilir.

Şekil 2. Hedeflenen bileşiği içeren çözelti kristal tüpe yerleştirildikten sonra, anti-solvent yeni bir pipet filtresinden geçirilerek yavaşça üstüne katmanlanır.

Yapısının belirlenmesi için tek bir kristal gereklidir. Kristalin kalitesi, yapısal belirlemenin kalitesini ve doğruluğunu büyük ölçüde etkiler.

Tek bir kristal, molekül düzenlemesinin her üç boyutta da tekrar ettiği bir katıdır. Kristal katı içindeki atomların uzamsal düzenlemesi, X-ışını kristalografisi kullanılarak belirlenebilir. Bu teknikte, saf kristal bir numune, bir X-ışını demeti ile sarılır. Kristal, X-ışınlarını, kristallerin yapısı ve moleküler bileşimi ile ilgili belirgin bir düzende kırınır. Bir kristal çok hızlı bir şekilde oluşursa, moleküller bozulabilir, kristale safsızlıklar dahil edilebilir veya tek bir kristal yerine iki veya daha fazla kaynaşmış kristal oluşabilir. Bu nedenle, X-ışını kristalografisi için yeterli kalitede kristaller üretmek için yavaş büyümeye vurgu yapan özel yöntemlere ihtiyaç vardır.

Bu video, X-ışını kalitesinde kristallerin istenen özelliklerini gösterecek, onları büyütmek için bir prosedür gösterecek ve bu tekniğin kimyadaki birkaç uygulamasını tanıtacaktır.

Elektronlar, çarptıklarında küresel bir X-ışını dalgası yayarak X-ışınlarını saçarlar. Atomlar düzenli bir düzendeyse, dalgalar arasındaki yapıcı girişim, bir X-ışını dedektöründe karakteristik bir kırınım modeli oluşturur. Kristal, birden çok açıdan kırınım desenlerini toplamak için ışın içinde döndürülür. Yeterli kırınım desenleri ile moleküler yapı türetilebilir.

X ışını kalitesinde kristaller genellikle simetrik şekiller oluşturur ve pürüzsüz, ışığı yansıtan yüzlere sahiptir. Polarize mikroskop altında bakıldığında şeffaf olacaklar, ancak çoğu 90 döndürüldüğünde kararmalı. Bu, çok sıralı bir yapıyı gösterir. Bu kristalleri büyütmek için genellikle sıvı-sıvı difüzyonu kullanılır. Bu, iki karışabilir çözücü kullanır: yeniden kristalleştirilecek bileşiğin çözünmez olduğu düşük yoğunluklu bir çözücü veya çökelti; ve bileşiğin çözünür olduğu yüksek yoğunluklu bir çözücü. Tipik olarak, çökelticinin çözücüye hacimsel oranı 2:1'dir.

Düşük yoğunluklu çökeltici, yüksek yoğunluklu çözücü içindeki bileşiğin konsantre bir çözeltisi üzerine katmanlanır. Zamanla, çökeltici çözelti ile karıştıkça bileşik daha az çözünür hale gelir. Daha küçük bir çözücü arayüzü, daha yavaş bir difüzyon hızı ile sonuçlanır, böylece daha büyük, daha saf kristaller elde edilir. Artık X-ışını kalitesinde kristaller yetiştirmenin ilkelerini anladığınıza göre, onları sıvı-sıvı difüzyonu ile büyütme prosedürünü inceleyelim.

Başlamak için, metin protokolünde bulunan gerekli ekipmanı edinin. Bileşik için bir çözücü ve daha az yoğun bir çökeltici elde edin.

Bir pipet filtresi hazırlamak için, bir cam pipetin üst kısmına küçük bir parça Kimwipe yerleştirin ve kağıdı delmemeye dikkat ederek bir çubuk veya başka bir pipetin sapını kullanarak kağıdı pipet gövdesinin altına kadar hafifçe bastırın. İki pipet filtresi hazırlayın. Birini NMR tüpüne yerleştirin. Gerekirse, tertibatı bir laboratuvar cl ile sabitleyinamp ve halka standı. Yeniden kristalleştirilecek bileşiğin yaklaşık 10 mg'ını 0.75 mL çözücü içinde çözün.

Şimdi, numune çözeltisini dikkatlice pipet filtresine ekleyin. Üstüne bir ampul yapıştırın ve katı kirleri gidermek için çözeltiyi NMR tüpüne geçirmek için yavaşça sıkın. Emme filtre kağıdını yerinden çıkaracağından, ampulün takılıyken yeniden genişlemesine izin vermeyin.

Ardından, kullanılmış pipet filtresini çıkarın ve ikinci filtreyi NMR tüpüne yerleştirin. Tüpe yaklaşık 1,5 mL çökeltici pipetleyin. Çözücünün yerçekimi ile filtreden geçmesine izin verin. Şu andan itibaren, herhangi bir manipülasyon sırasında filtreyi rahatsız etmemeye dikkat edin. Çökelticinin tamamı tüpe süzüldükten sonra, filtreyi çıkarın ve tüpü kapatın. Çalkalanmayacağı bir dolaba veya kolayca kontrol edilen başka bir yere yerleştirin.

En az bir gün sonra, tüpleri kristal büyümesi açısından inceleyin. Kristal yoksa veya kristaller çok küçükse, numune tüpünü rahatsız etmeden bırakın. Kristaller görünüyorsa, çözücü katmanlarını bozmadan boyutlarını ve şekillerini kontrol edin.

Kristaller büyükse, iyi tanımlanmışsa ve bir araya toplanmamışsa, X-ışını kalitesinde olma potansiyellerini doğrulamak için kristalleri mikroskop altında inceleyin. Difraktometre taramaya başlamaya hazır olana kadar kristalleri tüpten çıkarmayın. Çözücü molekülleri kristal yapıya dahil edilirse, kristalin kurumasına izin vermek kristali bozacaktır. X-ışını kristalografisi kullanılarak, bu koyu kırmızımsı-mor kristallerin moleküler yapısının tetrafenilporfirin olduğu doğrulandı.

X-ışını kristalografisi, kimya ve biyokimyada önemli bir analitik araçtır.

Yeniden kristalleştirme yöntemleri, ısıtma ve soğutma, sıvı-sıvı difüzyonu, buhar difüzyonu ve yavaş buharlaşmayı içerir. Tek bir çözücü sisteminin yavaş buharlaşmasında, bileşik az miktarda çözücü içinde çözülür ve kapağında küçük bir delik bulunan bir kaba yerleştirilir. Çözücü buharlaştıkça, bileşik kristalleşmeye başlayana kadar konsantrasyon artar.

Proteinlerin işlevselliği genellikle yapıları ile ilgilidir. Bununla birlikte, proteinlerin kristalleşmesi çok zor olabilir. X-ışını kalitesinde protein kristallerini büyütmek için özel teknikler geliştirilmelidir. Burada, bir damla protein çözeltisi bir damla çökeltici ile karıştırılır ve bu karışım saf çökeltici içeren bir odaya kapatılır. Çözücü buharı damladan dışarı çıktıkça, damladaki proteinin çözünürlüğü azalır ve protein yavaş yavaş kristalleşir. Başka bir teknik, protein çözeltisini ve çökelticiyi mineral yağ altında karıştırır. Bu teknikler kullanılarak, analiz için çeşitli proteinler kristalleştirilebilir.

Toz kırınımında, her olası uzamsal yönelim numunede aynı anda temsil edilir. Toz kırınımı, üç boyutlu yapı verilerinin kaybı nedeniyle tek kristal X-ışını kırınımı kadar yapı hakkında bilgilendirici değildir. Bunun yerine, toz kırınımı, kristal katıların karışımlarını analiz etmede ve amorf yapıların kristalliğini değerlendirmede mükemmeldir.

JoVE'nin X-ışını kristalografisi için büyüyen kristallerle tanışmasını az önce izlediniz. Artık X-ışını kalitesinde kristallerin özelliklerine, onları büyütmek için bir prosedüre ve bu tekniğin kimyadaki birkaç uygulamasına aşina olmalısınız.

İzlediğiniz için teşekkürler!