3.2: İç Standartlar

1. Uygun Numune İşleme: Bir Çözüm Oluşturma

1. Temiz bir beher alın ve içine doğru miktarda numune koyun. Kullanılan gerçek kütleyi kaydedin. Bu örnekte, bir sonraki analiz için dahili bir standart olarak kullanılmak üzere hacimsel bir şişede bir adenin çözeltisi yapılır. Adenin kütlesi 100 mg'dır. Uzun bir boynu olduğu ve adenin kolayca eklenip çıkarılamadığı için doğrudan hacimsel bir şişeye kütle koymayın.
2. Behere kabaca 25 mL çözücü (bu durumda dimetil sülfoksit (DMSO)) ekleyin ve çözünmesi için karıştırmasına izin verin. Bu örnekte, nihai çözelti 50 mL'lik hacimsel bir şişede yapılır, bu nedenle beherin durulanması ve çözeltinin son hacme kadar yapılabilmesi için yalnızca yaklaşık 25 mL ekleyin.
3. Katı çözündükten sonra, çözeltiyi hacimsel şişeye dökün.
4. Beheri ve karıştırma çubuğunu az miktarda çözücü ile yaklaşık 10 mL durulayın ve durulamayı hacimsel şişeye dökün. İki kez daha tekrarlayın. Bu, uygun çözüm aktarımının sağlanmasına yardımcı olur.

2. Dahili Standart Kalibrasyon Eğrisinin Hazırlanması

1. Gaz kromatografisi analizi için istenen standart numuneleri hazırlayın. Bu örnekte, kafein asetonitril kullanılarak kahveden ekstrakte edilir ve daha sonra ölçüm için dahili bir standart olarak adenin kullanılır.
2. Kafein numuneleri için, 1 mg/mL numune yapmak için gereken numune miktarını tartın. 10 mL'lik hacimsel bir şişe kullanılıyorsa, bu 10 mg'dır.
3. Analiti bir behere tartın, çözünmesi için birkaç mL çözücü (burada metanol) ekleyin, ardından 3 durulama kullanarak kantitatif olarak hacimsel şişeye aktarın.
4. 0.2, 0.5 ve 2 mg / mL kafein ile benzer şekilde 3 standart daha yapın.
5. Her kafein standardından 1 mL'yi bir numune şişesine koyun.
6. Her numune şişesine 0.2 mL 2 mg / mL adenin iç standardı ekleyin.
7. Her kafein standardıyla gaz kromatografisi deneyini çalıştırın. Her kromatogram için, kafein için tepe alanlarının standarda karşı oranını hesaplayın.
8. Alan oranına karşı konsantrasyon oranının bir grafiğini yapın. Bu arsanın eğimi tepki faktörüdür.

3. Gaz Kromatografisi için Dahili Standart ile Gerçek Bir Numunenin Hazırlanması

1. İstenilen numuneyi gaz kromatografisi analizi için hazırlayın. Bu örnekte, kafein asetrontril kullanılarak kahveden ekstrakte edilir.
2. Kahve numunesi için 2 g kahveyi 100 mL'lik bir behere koyun. Kahvenin tam ağırlığını kaydedin.
3. Behere 20 mL asetonitril ekleyin.
4. Sık sık karıştırarak 20 dakika bekletin.
5. Kahve telvesini bir hunide bir filtre kağıdı kullanarak süzün.
6. Filtre kağıdını 3x az miktarda asetonitril (5 mL) ile durulayın.
7. Filtratın son hacmini ölçün. Yaklaşık 35 mL olmalıdır.

4. Numuneyi çalıştırın ve konsantrasyonu hesaplayın

1. 1 mL kahve özü örneğini alın ve bir şişeye 0.2 mL iç standart ekleyin. Şişeyi otomatik örnekleyici rafına yerleştirin.
2. Numunenin GC analizini çalıştırın. GC koşullarının, kafein ve adenin ayrılacak şekilde olduğundan emin olun. Bu örnekte, izotermal ayırma işlemleri 200 °C'de gerçekleştirilmiştir.
3. Analizden sonra, hem dahili standart tepe noktası hem de analit tepe noktası için tepe alanını hesaplayın. Oranlarını kullanarak, numunedeki kafein miktarını hesaplayın.

5. Bulgular: Dahili Standart ile Kafeinin GC Analizi

1. Kafeinin GC analizi Şekil 1'de gösterilmiştir. Adenin, dahili bir standart olarak kullanılır. Tepe alanlarının oranı, konsantrasyonların oranına karşı ölçülebilir ve çizilebilir. Arsanın eğimi tepki faktörüdür (bu durumda 1.8).
2. Şekil 2, adenin iç standardına sahip bir kahve örneğinin kromatogramını göstermektedir. Tepe alanının oranı 1.78'dir. Yanıt faktörü ve bilinen adenin konsantrasyonu (0.33 mg / mL) kullanılarak, bilinmeyen numunedeki kafein konsantrasyonu 0.33 mg / mL olarak hesaplanır.

Şekil 1. Dahili bir standart kullanarak kalibrasyon grafiği. Her birine 0,33 mg/mL adenin iç standardı eklenmiş 3 standart kafein numunesi (1, 0,5 ve 0,2 mg/mL) için alan oranlarına karşı konsantrasyon oranlarının bir grafiği. Çizginin eğimi, tepki faktörü olan 1.8'dir.

Şekil 2. Adenin iç standardına sahip kahvenin kromatogramı. FID dedektörünün örneklere verdiği yanıtın bir grafiği. Üç ana tepe noktası adenin (IS), kafein ve palmitik asittir.

Bir numune her işlendiğinde veya aktarıldığında numune kaybı meydana gelebilir, bu da konsantrasyonun doğru hesaplanmasını zorlaştırır.

Doğruluğu sağlamak için, dikkatli numune hazırlama ve numune işleme ve transfer adımlarının sayısı sınırlandırılarak numune kaybının etkileri en aza indirilmelidir. Bununla birlikte, eksik numune manipülasyonu, matris etkileri ve analitik prosedürdeki farklılıklar gibi sistematik hatalar nedeniyle de numune kaybı meydana gelebilir.

Bu kayıp kaynakları, ilgilenilen bileşiğe benzer, ancak aynı olmayan bir türün bilinen bir konsantrasyonunun eklenmesiyle açıklanabilir. Buna dahili standart denir. Dahili standartta meydana gelen herhangi bir numune kaybı, analit için benzer olmalı ve konsantrasyonun doğru bir şekilde hesaplanmasına izin vermelidir.

Bu video, bilinmeyen bir maddenin konsantrasyonunu belirlerken numune kaybını hesaba katmak için dahili bir standardın ve uygun laboratuvar tekniğinin kullanımını gösterecektir.

Dahili standart, bir analiz sırasında standartlara, numunelere ve boşluklara bilinen bir miktarda eklenen bir maddedir.

Kromatografi ve spektroskopide, dahili standart ve analit için sinyalin oranı hesaplanır. Yanıt faktörü olarak adlandırılan bu oran, analit ve standart konsantrasyonların oranı ile orantılıdır.

Yanıt faktörü, R, aşağıdaki denklemle ifade edilebilir, burada A, numunenin ve dahili standardın analitik sinyallerini temsil eder ve C, numunenin ve dahili standardın konsantrasyonlarını temsil eder.

Dahili bir standart hem sistematik hem de rastgele hataları telafi edebilir. Örneğin, bir numuneyi ölçerken meydana gelen tutarsızlıklar gibi rastgele hatalar hem dahili standart hem de analit için aynı olacaktır. Bu nedenle, sinyallerinin oranı değişmeyecektir.

Çözeltideki matris etkileri gibi sistematik hatalar için, matris etkisi hem standart hem de analit için eşit olduğu sürece oran etkilenmeyecektir.

İç standartlar büyük fayda sağlarken, uygun olanı seçmek zor olabilir. Dahili bir standart, analite benzer, ancak aynı olmayan bir sinyale sahip olmalıdır. Ayrıca analitin ölçümünü hiçbir şekilde etkileyemez.

Son olarak, konsantrasyon iyi bilinmelidir. Bu, dahili standardın numunede doğal olarak bulunmamasını sağlayarak elde edilir; Bu nedenle, çözelti içindeki tek kaynağı, eklenen bilinen konsantrasyondur.

Aşağıdaki deneyde, bilinmeyen bir numunedeki kafein konsantrasyonu gaz kromatografisi ile belirlenecektir.

Bu, dahili standart olarak adenin ile bilinen kafein çözeltileri kullanılarak bir kalibrasyon eğrisi oluşturularak elde edilir. Kalibrasyon eğrisinin eğimi, yanıt faktörüne eşittir.

Yanıt faktörü bilindikten sonra, bilinmeyenin konsantrasyonu, ölçülen kromatogram alan oranından hesaplanabilir.

Artık dahili standartların temellerini anladığınıza göre, prosedüre bir göz atalım.

Prosedüre başlamak için, 100 mg iç standart olan adenin'i temiz bir behere doğru bir şekilde tartın.

Daha sonra, kabaca 20 mL dimetil sülfoksit içinde çözün ve çözeltiyi karıştırın.

Adenin çözündükten sonra, çözeltiyi 50 mL'lik hacimsel bir şişeye dökün.

Beheri durulayın ve çubuğu 10 mL DMSO ile karıştırın ve durulamayı şişeye dökün. Uygun çözelti transferini sağlamak için bu durulamayı iki kez tekrarlayın. Kalibrasyon işaretine kadar doldurun, bu da 2 mg / mL konsantrasyonlu bir dahili standart ile sonuçlanır.

Daha sonra, bir stok çözeltisi hazırlamak için 100 mg kafeini bir behere tartın. Kafeini az miktarda metanol ile çözün. Ardından, bu çözeltiyi 25 mL'lik taze bir hacimsel şişeye aktarmak için 3 durulama kullanın. Bu 4 mg / mL stok çözeltisidir. 3 kafein standardı oluşturmak için kullanın.

Daha sonra, her şişeye 0.2 mL iç standart olan adenin ekleyin. Her birini son hacme kadar metanol ile doldurun. Her çözeltiyi bir numune şişesine aktarın.

Her kafein standardını bir gaz kromatografından geçirin. Kafein için tepe alanlarının adenin standardına karşı oranını hesaplayın.

İlk olarak, 2 g kahveyi 100 mL'lik bir behere tartın ve ağırlığı kaydedin.

Ardından, kahveden kafeini çıkarmak için 20 mL metanol ekleyin. Çözeltinin 20 dakika karışmasına izin verin.

Bir B?chner hunisi kullanarak kahve telvesini süzün. Beheri az miktarda metanol ile durulayın ve bu durulamayı huniye dökün. Durulamayı iki kez tekrarlayın.

Filtratın son hacmini ölçün; yaklaşık 35 mL olmalıdır.

Numuneyi analize hazırlamak için, bir numune şişesine 1 mL kahve özü ekleyin. Ardından, 0.2 mL adenin dahili standardını ekleyin ve şişeyi cihazın otomatik örnekleyici rafına yerleştirin.

Numunenin bir gaz kromatografisi analizini yapın ve koşulların kafein ve adenin ayrı olacak şekilde olduğundan emin olun.

Analizi tamamladıktan sonra, hem dahili standart hem de analit için tepe alanını hesaplayın.

Tüm numuneler analiz edildikten sonra, kafein/adenin çözeltileri için standart kalibrasyon eğrisi, konsantrasyonların oranlarına karşı tepe alanlarının oranları çizilerek belirlenebilir. Tepki faktörünü temsil eden bu çizginin eğimi 1.8 idi.

Daha sonra, ekstrakte edilen kahve örneğinden elde edilen GC verileri analiz edilir. Zirve alanların oranı ise 1,78 olarak hesaplanmıştır. Yanıt faktörü ve iç standart olan adenin bilinen konsantrasyonu kullanılarak, bilinmeyen numunedeki kafein konsantrasyonu 0.33 mg / mL olarak hesaplandı.

Çeşitli bilimsel müritler arasında birçok farklı reaksiyon türü, hataların ve numune kaybının etkilerini en aza indirmek için dahili standartları kullanır.

Numune hazırlama sırasında karşılaşılan numune kaybının etkileri, konsantrasyon oranları neredeyse sabit tutularak dahili standartlar kullanılarak en aza indirilebilir.

Bu örnekte, biyoaktif lipitler, bir sıvı-sıvı ekstraksiyon işlemi kullanılarak parçalanmış hücrelerden ekstrakte edildi. Numune hazırlama sırasındaki hataları hesaba katmak için ekstraksiyonun başlangıcında kararlı izotop iç standartları eklenmiştir.

İç standartlar sadece biyoaktif lipitlerin hazırlanması için değil, aynı zamanda analiz için de kritikti. Lipitler, yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak ayrıldı ve kütle spektrometresi ile analiz edildi.

Spektroskopide, dahili standartlar, ışık kaynağı yoğunluğundaki değişikliklerden kaynaklanan rastgele hataların düzeltilmesine yardımcı olabilir. Bir lamba veya başka bir ışık kaynağı değişken güce sahipse, bir numunenin emilimini ve sonuç olarak emisyonunu etkileyecektir. Bununla birlikte, dahili bir standardın analite oranı, ışık kaynağı sabit olmasa bile sabit kalacaktır.

Kromatografide en büyük hata kaynaklarından biri enjeksiyondur. Otomatik örnekleyiciler bunu en aza indirmeye yardımcı olur, ancak hata yine de %1?2 bağıl standart sapma olabilir.

Bu örnekte, dahili bir standart içeren buhar standartları, bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için gaz kromatografisi kullanılarak analiz edilmiştir. Bu tamamlandıktan sonra, bilinmeyen numune daha sonra ölçülebilir ve numunenin uçuculuğundan kaynaklanan kayıplar hesaba katılabilir.

JoVE'nin şirket içi standartlara giriş sürecini az önce izlediniz. Artık numune kaybını, dahili standartları ve yanıt faktörlerini en aza indirmek için en iyi uygulamaları anlamanız gerekir.

İzlediğiniz için teşekkürler!