Name: Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Öğrenin civciv embriyolarında sinir indüksiyonu testi için Hensen nodunun transplantasyonu ve floresan boyama yöntemlerini. Bu teknik gelişimsel nörobiyoloji araştırmalarında sinir kaderi belirlenmesini incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DP Uyuşturucu İstismarı Ulusal Enstitüsü Ruth Kirschstein Ödülü 1F32 DA021977-01A1 alıcı. Bu çalışma, Margaret M. RHF Alkek Vakfı tarafından desteklenmiştir.

<html> I. Şematik Bakış: <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_2/Figure1.png" alt="Şekil 1" width="460" height="384" /> Bu video civciv embriyo sinir indüksiyonu için tahlil farklı adımları gösteriyor. İlk olarak, ana embriyo Yeni kültür eksplante [NI1]. Sonra, donnor embriyo tuzlu ve Hensen düğüm (civciv &quot;organizatör&quot;) eksplante, floresan boya DII ile etiketlenmiş [NI2]. Hensen düğümünden donnor embriyo eksize [NI3] ve [NI4 konak embriyo nakledilen NI5]. Ana embriyo sonra donnor doku ana alanda bir ektopik ekseni indüklenen hangi süre sonra, 22 saat, kültüre opaca [NI6]. Kültür ardından, ev sahibi embriyo sabit ve DAB varlığında oksidasyona karşı savunma için işlenmiş: DAB kahverengi aşağıdaki reaksiyon haline önce oksidasyona karşı savunma mekanizmalarını [NI7] FITC floresanı altında kırmızı görünen bu kimyasal reaksiyon, donnor elde edilen hücreler, [NI8]. Embriyo daha sonra bir sinir marker [NI8] in situ hibridizasyon için işlenmiş; ev sahipliği elde edilen doku donnor greft varlığı, sinir doku oluşturmuştur. Bu doku mavi görünür. 1: Yeni kültür için ana embriyo hazırlanması <ol><li> Bu sinir indüksiyon tahlil protokolü, Hamburger ve Hamilton evre 3 inkübe edilmiştir yumurta ile başlar (veya HH3 +) . Bu yumurtalar, 13 saat boyunca nemli bir inkübatör kendi tarafında belirtilen inkübe edilmiştir. </li><li> Yeni kültür (adımları 3.1 5.5 9) ev sahipliği embriyo hazırlayın . </li><li> 200 ul salin ile ev sahibi embriyo yüzeyini kaplayan. Bu, daha sonra transfer ve donnor greft konumlandırma kolaylaştıracaktır. </li><li> Son olarak, ters bir Falcon 35 mm kültür çanak montaj kapsar. </li></ol> 2: donnor embriyo tuzlu Explanting <ol><li> Forseps ile kabuk dokunarak ve etrafında kabuk kabuk parçalarını kaldırarak yumurta açın. Kabuğun üst çıkarın ve atın. </li><li> Forseps ile kalın albümin çıkarın ve embriyo yukarı bakacak şekilde kaba forseps ile yumurta sarısı kesesi eğin. </li><li> Ince makas kullanarak, yolk kesesi embriyo etrafında bir kare kesti. Bir kaşık ile yumurta sarısı embriyonun çıkarın ve PBS içeren bir yemek yer. </li><li> Forseps kullanarak, alan pellusida donnor embriyo ayırmak. </li><li> PBS içeren bir Sylgard kapalı çanak donnor embriyo transfer. </li></ol> 3: Etiketleme, eksize ve donnor greft nakli <ol><li> Mikroelektrot çektirmenin kullanarak, 50 ul cam microcapillary pipetler çekin. Mikroskop altında, ince forseps kullanarak mikropipet ucu kesilir. Petri Yeri mikropipet plasteline bir kurdele ile kaplı. </li><li> Greft nakli için önce etiketlemek için kullanılacak boya çözüm hazırlayın: carbocyanine boya DII (1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perklorat): Birinci, 1ml DII bir stok hazırlamak % 0.5 &#39;lik mutlak etanol. Bu stok-20C karanlıkta saklanabilir. Bir su banyosunda 42 ° C, mix 360μl 0.3M sakkaroz 40 ul DII stok prewarmed. Su banyosu sıcaklığı, yağış DII ve çözünmeyen kristalleri oluşumu önlemek için gerekli. Kısaca bir mini spectrafuge solüsyonu (5-10 saniye) dönerler. DII çözüm artık kullanıma hazırdır. </li><li> Böcek pimleri kullanarak, Sylgard kaplı çanak alt donnor embriyo güvenli. </li><li> Geri dolgu DII ile mikropipet. Bir aspiratör boru montaj kullanarak nazik bir basınç uygulayarak, Hensen düğümünden DII bir küçük bolus uygulanır. Tüm Hensen düğümü etiketli olduğundan emin olun. </li><li> Microcapillary bir pipet veya microdissecting bıçak kullanarak, Hensen düğüm (&quot;organizatör&quot;, donnor greft) kesti. </li><li> Karmin ile greft ventral yan ve arka uç işaretleyin. Bu adım 4.3 &#39;te uygun dorso-ventral yönlendirme ile greft yerleştirilmiş olmasını sağlayacaktır. </li><li> 200μl Gilson pipet kullanarak, greft ev sahibi embriyo transferi. </li></ol> 4: greft ve kültür ev sahibi embriyo koruma <ol><li> Greft, ana sitesi ile yakın konumlandırılmış kalır emin olmak için, ev sahibi embriyo tuzlu çıkarın. </li><li> Microcapillary bir pipet veya microdissecting bıçak kullanarak, ev sahibi embriyo, Hensen düğüm düzeyinde alanında pellusida / alan opaca sınır bölgesi, küçük bir kesi (80-100μm). </li><li> Microcapillary pipet veya microdissecting bıçak, pozisyon greft kullanarak bu ventral yan ve arka sonuna doğru bakacak şekilde ev sahibi embriyo eşdeğer bölgeye paralel. </li><li> Kalan tuzlu su çıkarın ve 81-22 saat (adım 6.1 6.6 9) Yeni kültür için ana embriyo süreci. </li><li> Ana embriyo sonra 4 ° C (adım 7,1-7,7 9) geceleme sabittir. </li></ol>e &quot;&gt; 5: floresan altında greft Photooxidise <ol><li> Davlumbaz altında, Tris tampon bir DAB çalışma çözeltisi hazırlayın: 500μg/ml Tris tampon (100 mM Tris-HCl, pH 7.4) (3,3 &#39;-diaminobenzidin tetrahydrochloride) DAB substrat çözülür; buz üzerinde, koyu çözüm tutmak. </li><li> Tris buffer her 5 dakikada bir kez 5 milyon için PBS içinde embriyo iki kez yıkayın. </li><li> 1 ml Tris tamponu içeren bir cam boşluğuna slayt embriyo transferi. </li><li> Tris tampon çözeltisi 1.5 ml DAB solüsyonu ile değiştirin. DAB dekontamine için% 10 çamaşır suyu çözeltisi içeren kova Eppendorf ucu atın. Lamel kavite slayt üstüne yerleştirin. </li><li> FITC (fluorescein isothiocyanate) floresan mikroskop altında, greft (donnor hücreler floresan kırmızı görünecektir) objektif odak ve tüm floresan kırmızı kan hücrelerinin kahverengi (DII bir sonucu olarak gerçekleşir hale gelmiştir kadar FITC floresan maruz photoconverted olmak florokrom çözünmez kahverengi kristaller, DAB varlığında FITC eksitasyon dalga boyu (488nm) maruz Bu süreç, 20 milyon ve 2 saat arasında sürer. </li><li> Oksidasyona karşı savunma reaksiyon tamamlanmasının ardından, ince forseps kullanarak lamel çıkarın. Cam PBTw (veya% 0.1 Tween 20 içeren PBS) içeren 20 ml sintilasyon flakon embriyo transferi. </li><li> % 10 çamaşır suyu çözeltisi kuluçka lamel ve cam boşluğuna slayt DAB devre dışı bırakın. </li></ol> 6: in situ hibridizasyon, fotoğraf embriyo Süreci ve kesit <ol><li> Sadece etiketli prob DIG embriyo kuluçka, in situ hibridizasyon (adım 3.7 ve 6.5 9) ile devam edin . </li><li> Fotoğrafını (8.2 9 basamak) ve kesit (adımları 8.3 ve 8.4 9) ile devam edin. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Nöral indüksiyon testinin Aşağıdaki örnekte, donnor greft konak elde edilen doku sinir işaretleyici Kuyruksuz ifade neden gösterilir. Donnor greft &quot;organizatörü&quot; bölge cerrahi donnor embriyo aşamasında kaldırılmış olan bir embriyo kaynaklanır: bu özel örnekte, normalde &quot;organizatör&quot; yeteneklerine sahip değiliz embriyonik bölgelerin sinir indükleyici yeteneği kazanılması değerlendirdi 3 +. Ablasyon sonrasında, delik iyileştikten ve Hensen düğümünden benzeri bir yapı oluşana kadar donnor embriyo, Yeni kültür geliştirmek için izin verilir. Bu yapı, daha sonra DII ile etiketli donnor embriyo eksize ve bir dizi embriyo alan pellusida / alan opaca sınır için aşılı. Yeni kültür ardından, minyatür bir eksen ev sahibi embriyo bitişik oluşur: Bu minyatür ekseni kırmızı hücrelerin (donnor türetilmiş) bir çubuk ve bir kafa gibi bir yapı (host edilen) oluşur: (A), donnor elde edilen DII etiketli hücreleri önce fiksasyon FITC floresan mikroskobu altında gösterilmiştir. Bu donnor kökenli hücrelerin kırmızı hücrelerin çubuk gibi görünen bir minyatür notokord oluşturmak için çoğaldı. (B) DII ardından Fotoçevrim, bu donnor kökenli hücrelerin kahverengi görünür. Donnor greft konak sinir doku oluşumuna neden vardır: Bu doku, beyin öncüleri oluşur, in situ hibridizasyon marker Kuyruksuz aşağıdaki kendi ifadesi ile ortaya [6 yeniden basıldı. <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_3/Figure 2.png" alt="Şekil 2" width="230" height="154" /> Not: Bu yöntemde, &quot;sinir&quot; doku (mavi) elde edilen konak sinir indükleyici donnor doku (kırmızı / kahverengi) ayırt etmek için DII etiketli hücreleri kullandık. Edilen bir civciv, DII etiketli donnor greft kullanarak yerine, bazı yazarlar da donnor yerine civciv bıldırcın embriyolar elde edilen doku [örneğin 6]. Bu alternatif bir yöntem de, konakçı doku donnor ayırt sağlar. Bu durumda, greft (donnor doku) bıldırcın yumurtası tavuk yumurtasına yerine kaynaklanır. Adım 4.5 ardından, ev sahibi doku (QCP1) ve adımları 3.1 5,7 - 3.4 ve 5.1 bıldırcınlar için özel bir antikor ile tüm montaj immünohistokimya işlenir protokol atlanmıştır. Bu alternatif prosedür bir örnek aşağıda gösterilmiştir: (QCPN antikor [kahverengi] ifadesi ile gösterildiği gibi) Bu durumda, A, B olarak aynı deneysel prosedür kullanılır, ama biz bıldırcın-türevli donnor doku rejenere bıldırcın embriyo elde edilen düğüm host pan-nöral işaretleyici Sox2 ifade indüklenen [6 yeniden basıldı]: <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_4/Figure 3.png" alt="Şekil 3" width="154" height="230" />

<ol><li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+development+of+chick+and+duck+embryos%2C+cultivated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B%22%5BJournal%5D)">Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro.</a> Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).</li>
<li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+by+the+primitive+streak+and+its+derivatives+in+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick.</a> J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+et+transplantation+des+diff%26eacute%3Brentes+r%26eacute%3Bgions+de+la+ligne+primitive+chez+le+poulet%5BTitle%5D)+AND+%22C.+R.+Ass.+Anat%22%5BJournal%5D)">Excision et transplantation des diff&eacute;rentes r&eacute;gions de la ligne primitive chez le poulet.</a> C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+induction+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Morph.+9%22%5BJournal%5D)">Primary induction in birds.</a> Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+neural+crest+cell+migration+in+the+mouse+embryo+as+revealed+by+vital+dye+labeling.+Development+108%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108.</a> , 605-612 (1990).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo.+Development+122%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122.</a> , 3263-3273 (1996).</li>
<li>Joubin, K., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+continuously+define+the+organizer+during+the+cell+movements+of+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation.</a> Cell. 98, 559-571 (1999).</li>
<li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. , 406-474 (2000).</li>
<li>Psychoyos, D., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Culture+of+Early+Chick+Embryos+ex+vivo+%28New+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture.</a> JoVE. 20, 10-3791 (2008).</li>
</ol>

Bu video nöral indüksiyonu için bir test farklı adımları gösteriyor; Bu testte aslında piliç varsayılan sinir indükleyici moleküllerin karakterizasyonu için kullanılır ve böylece embriyolojik micromanipulations 1-4 arasında değişen çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilir; 6 çözülüyor yeni sinyalizasyon kaskadlar 7,8, beyin oluşumu ve sinir sisteminin geri kalan ilk adım anlayışı hedefliyor.

<table><tbody><tr><td>Yumurtalar</td><td>Hayvan</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Premium Fertile</td><td>Döllenmiş, HH3+ (14 sa)</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5 veya benzeri</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon İnkübatörü</td><td>Ekipman</td><td>Robbins Scientific, SciGene</td><td>M1000</td><td>Ters çevrilmiş Pyrex kap ve 500 ml ddH₂O ile kullanın&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Beherna</td></tr><tr><td>Marsh Otomatik İnkübatör</td><td>Ekipman</td><td>Lyon</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex kap </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saatçi&amp;rsquo;50 mm cam lam</td><td>Araç</td><td>VWR international</td><td>66112-060</td><td></td></tr><tr><td>Cam halkalar</td><td>Araç</td><td>Fiziksel Tesis birimi</td><td></td><td>cam tüpten (27 mm dış çap, 25 mm iç çap) 4 mm kalınlığında kesitler kesin. Hassas parlatma yapmayın.</td></tr><tr><td>Kavisli Pens (1)</td><td>Araç</td><td>Elektron Mikroskopisi Bilimleri</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>Penset (2)</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td>bileme taşı ve 100 $\mu$l mineral yağ kullanılarak küt uçlu hale getirildi</td></tr><tr><td>Hassas makaslar</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kaplar</td><td>Araç</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Kauçuk Pompa</td><td>Araç</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>Aspiratör tüp düzeneği</td><td>Araç</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Mikro&amp;#8211;elektrot çekici</td><td>Ekipman</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Sutter Instruments P-97 Alevli/Kahverengi Mikropipet</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Kılcal Pipeti</td><td>Araç</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>70950-12</td><td>alev altında kenarları yuvarlatma</td></tr><tr><td>Kültür haznesi</td><td>Araç</td><td>Pioneer Plastics</td><td>030C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokılcal boru</td><td>Araç</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1049-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodiseksiyon bıçağı</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>In situ hibridizasyon öncesinde boşlukları delmek için kullanın</td></tr><tr><td>0,2 mm çaplı minuten pinleri</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>1 ölçek Kürleme Ajanı ile 9 ölçek Bazı karıştırın; 37°C'de gece boyunca bekletin.</td></tr><tr><td>Dietilpirokarbonat (depc)</td><td>Reaktif</td><td>Elektron Mikroskopisi Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kürleme Ajanı ve Bazı</td><td></td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>1 birim Kürleyici Ajan ile 9 birim Baz'ı karıştırın; 37°C'de gece boyunca (O/N) bekletin.</td></tr><tr><td>Dietilpirokarbonat (depc)</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>10025025</td><td>1 l PBS'ye 1 ml DEPC ekleyin; çalkalayın; otoklavlayın</td></tr><tr><td>%16 PFA</td><td></td><td>Elektron Mikroskobi Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr></tbody></table>

civciv embriyo sinir İndüksiyon için testi

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Civciv embriyo erken embriyonik gelişim çalışmaya değerli bir araçtır. Şeffaflık, erişilebilirlik ve manipülasyon kolaylığı, sinir sisteminin oluşumu ve ilk desenlendirme çalışmak için ideal bir araçtır. Bu video bir konak içine greft düzenleyen doku Hensen s düğümü (civciv embriyo düzenleyen) bir yöntem olan bir ana yetkili ektoderm aşılı nasıl gösteriyor. Organizatörü greft dokusu, sinir indükleyici sinyalleri aracılığıyla bir sinir kaderi kabul ettik na örten bildirir. Bu mekanizma nöral indüksiyon olarak adlandırılır ve amniotları beyin ve omurilik oluşumunda ilk adım teşkil etmektedir. Bu yöntem aslında piliç varsayılan sinir indükleyici moleküllerin karakterizasyonu için kullanılır. Bu video tayininde sinir indüksiyonu için farklı adımları gösteriyor; İlk olarak, donnor embriyo eksplante ve bir çanak üzerine tutturulmuş. Sonra, ev sahibi embriyo Yeni kültür için hazırlanmıştır. Greft eksize ve ev sahibi pellusida marjı nakledilen. Ev sahibi 18-22 saat kültüre. Montaj sabit ve başka uygulamalar (örneğin in situ hibridizasyon) işlenir. Bu yöntem başlangıçta Waddington icat edildi<sup&gt; 1,2</sup&gt; Ve Gallera<sup&gt; 3,4</sup&gt;.

Sinir indüksiyon beyin oluşumunda ilk adımdır. Hensen düğüm (düzenleyen), sinir kaderi kabul komşu doku talimatını hangi bir mekanizma, yani sinir sistemi yol açmaları. Bu video civciv embriyo sinir indüksiyonu için bir test göstermektedir.

Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

Tavuk embriyosu, erken embriyonik gelişim çalışmalarında değerli bir araçtır. Şeffaflığı, erişilebilirliği ve manipülasyon kolaylığı, onu ...

Bu video, civciv embriyosunda nöral indüksiyon testi için izlenen farklı aşamaları göstermektedir. İlk olarak, konak embriyo yeni kültüre eklenir; donör embriyo ise salin içine eklenir ve Hensen düğümü floresan boya ile işaretlenir. Hensen düğümü donör embriyodan çıkarılır ve konak embriyoya nakledilir.Konak embriyo 24 saat boyunca kültüre edilir, fikse edilir ve fey floresansı altında foto oksidasyon için işleme alınır. dab ile. Embriyo, nöral bir belirteç ile in-situ hibridizasyon için işleme alınır.Merhaba, ben Houston'daki Texas A&amp;M Üniversitesi Çevresel ve Genomik Tıp Merkezi'ndeki Fennell Laboratuvarı'ndan Delphine. Bugün sizlere tavuk embriyosunda nöral indüksiyon deneylerinin gerçekleştirilmesi için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarda, antiepileptik ilaçların Hensen düğümünün nöral indükleyici özellikleri üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Nöral indüksiyon deneyi için yumurtaların hazırlanması gerekir. Bu yumurtalar, hamburger ve Hamilton evre üç artı veya HH 3+ seviyesine gelene kadar, nemli bir inkübatörde yan yatırılmış halde 13 saat boyunca inkübe edilmelidir.Ardından, daha önce gösterilmiş olan yeni kültür yöntemini kullanarak konak embriyoyu hazırlayın. JoVE'de, konak embriyonun yüzeyini 200 µL salin ile kaplayın. Bu işlem, donör greftin daha sonraki transferini ve konumlandırılmasını kolaylaştıracaktır.Son olarak, düzeneği ters çevrilmiş bir Falcon 35 milimetrelik kültür kabı ile kapatın. Donör embriyoyu çıkarmak için, pensle kabuğa hafifçe vurarak yumurtayı açın. Kabuğun üst kısmını çıkarıp atın.Kalın albümini pensle alın ve embriyonun yukarı bakması için vitellüs kesesini kaba pensle eğin. Albümini çıkardıktan sonra, embriyonun etrafındaki vitellüs kesesinden ince makasla kare bir parça kesin. Embriyoyu bir kaşık yardımıyla vitellüsten ayırın ve PBS içeren bir kaba yerleştirin.Ardından, donör embriyoyu vitellüs ve area lucita'dan ayırmak için pens kullanın. Ayırma işlemi tamamlandığında, grefti etiketlemek ve transplantasyonunu yapmak için donör embriyoyu PBS içeren SIL guard kaplı bir kaba aktarın. Mikroskop altında 50 µL'lik cam mikrokapiler pipetler çekmek için bir mikro elektrot çekici kullanın.Mikropipet ucunu ince uçlu pens kullanarak kesin. Mikropipeti, modelleme kili şeridi ile kaplanmış bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, transplantasyon öncesinde grefti işaretlemek için kullanılacak boya çözeltisini hazırlayın.İlk olarak, 1 mL absolut etanol içerisinde %0,5 konsantrasyonunda bir dye eye stok çözeltisi hazırlayın. Bu stok, karanlıkta -20 °C'de saklanabilir. Ardından, 45 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı blokta, önceden ısıtılmış 10 µL dai stoğunu 90 µL 0,3 M sükroz ile karıştırın. Bu sıcaklık, dai'nin çökelmesini ve çözünmez kristallerin oluşumunu önlemek için gereklidir.Çözeltiyi mini SPECT fuge'de beş ila 10 saniye boyunca kısa süreliğine santrifüjleyin. DAI çözeltisi artık kullanıma hazırdır; donör embriyoyu sırt kısmı yukarı gelecek şekilde, sill guard kaplı kabın tabanına böcek iğneleriyle sabitleyin. Embriyo sabitlendikten sonra, hafif bir basınç uygulayarak mikropipeti D eye ile doldurun.Bir aspiratör tüp düzeneği kullanarak, henson düğümüne küçük bir dai bolusu uygulayın. Henson düğümünün tamamının etiketlendiğinden emin olarak işlemi tekrarlayın.Bir mikro kapiler pipet veya mikro disseksiyon bıçağı kullanarak henson düğümünü kesin; düğümün dorsal tarafı bir oluk oluşturduğu için ventral taraftan ayırt edilebilir, ventral taraf ise düzdür. Gerektiğinde, greftin dorsal tarafını karmin tozu ile işaretleyin. Bu, greftin doğru dorsal-ventral oryantasyonla yerleştirilmesini sağlayacaktır.10 µL'lik bir gilson pipet kullanarak, grefti bir mikro kapiler pipet yardımıyla konak embriyoya transfer edin. Grefti, konak embriyonun henson düğümü seviyesindeki opak sınır bölgesi olan area lucida bölgesine yaklaştırın. Ardından, bu bölgede 80 ila 100 µm boyutunda küçük bir insizyon yapmak için bir mikro kapiler pipet veya bir mikro diseksiyon bıçağı kullanın.Konak embriyosunun henson düğümü seviyesindeki opak sınırı belirleyin. Mikro kapiler pipet veya mikro diseksiyon bıçağı kullanın. Grefti, ventral tarafı size bakacak ve posterior ucu konak embriyosundaki eş bölgeye paralel olacak şekilde konumlandırın. Konumlandırma tamamlandıktan sonra, greftin konak bölgeye yakın konumda kaldığından emin olarak konak embriyosundaki salini uzaklaştırın ve konak embriyoyu, önceki gönderimizde açıklandığı şekilde 18 ila 22 saat boyunca yeni kültür işlemi için hazırlayın.24 saatlik kültürlemeden sonra embriyo inkübatörden çıkarılır ve bir sigara kabına (cigar dish) iğnelenir. İçerikteki PBS uzaklaştırılır ve yerine %4 paraformaldehit eklenir. Embriyo ardından 24 saat boyunca fikse edilir.Fiksatifi uygun bir tehlikeli atık kabına boşaltın ve fiksasyon kabına PBS ekleyin. Pinler çıktıktan sonra böcek iğnelerini pens yardımıyla çıkarın. Embriyoyu PBS içeren bir sintilasyon şişesine aktarmak için küt uçlu bir pastör pipeti kullanın.Embriyoyu PBS ile beşer dakikadan iki kez ve twist tamponu ile bir kez beş dakika boyunca yıkayın; yıkama işleminden sonra embriyoyu 0,1 mililitre Tris tamponu içeren bir cam kaviteli lam üzerine aktarın. Tris tamponu çözeltisini 0,1 mililitre DAB çözeltisi ile değiştirin. Pipet ucunu çamaşır suyu çözeltisi içeren kovaya atın.DAB'yi dekontamine etmek için, FEI floresein izotiyosiyanat floresans odağı altındaki çukur lamın üzerine bir kapatma lamı yerleştirin. Mikroskobun greft donör hücreler üzerindeki objektifi, tüm floresan kırmızı hücreler kahverengiye dönene kadar FEI floresansına maruz kaldığında floresan kırmızı görünecektir. Bu durum, döğ fluorokromun FEI uyarım dalga boyuna maruz kalarak çözünmeyen kahverengi kristallere fotokonverte olması sonucunda gerçekleşir.DAB varlığında 488 nanometrede. Bu işlem 20 dakika ile iki saat arasında sürer. Foto-oksidasyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra, ince pensler kullanarak lamel kaldırın.Embriyoyu, PBTW veya %0.1 tween 20 içeren PBS bulunan 20 mililitrelik bir sintilasyon şişesine aktarın. Son olarak, lamel, kapatıcı ve cam boşluktaki DAB'ı etkisiz hale getirin. Embriyoyu görselleştirme için işlemek amacıyla bir çamaşır suyu çözeltisinde inkübe ederek kaydırın.Sadece DIG etiketli prob ile embriyoyu inkübe ederek in-situ hibridizasyona geçiniz. Ardından, Jo Video iki'de açıklandığı gibi fotoğraflama ve kesit alma işlemlerine başlayınız. İşte bir nöral indüksiyon analizi örneği.Başlangıçta greft, konakçı embriyonun area lucita ve area alpaca bölgeleri arasındaki sınıra yerleştirilir. Hem donör hem de konakçı embriyolar üçüncü artı aşamadadır. Kültürde dokuz saat geçtikten sonra greft farklılaşmaya başlar ve minyatür bir sekizinci eksi baş görünümü oluşturan yapıya yol açar.Kültürde 24 saat geçtikten sonra, fiksasyonun ardından nöral indüksiyon tamamlanır. Embriyo, foto oksidasyon için işlenir. Başlangıçta, donör kaynaklı boya ile işaretlenmiş hücrelerin, burada kırmızı renkte görüldüğü üzere minyatür bir Noor oluşturacak şekilde çoğaldıkları görülmektedir.Foto oksidasyondan sonra bu hücreler kahverengi görünür. Ardından embriyo, nöral belirteç Otx2 için bütün mount in situ hibridizasyonu ile işleme tabi tutulur. Otx2, Dr. Bonelli'nin laboratuvarında geliştirilmiştir.Donör greftin, konakçı kaynaklı dokuda OTX two ekspresyonunu indüklediği gösterilmiştir. Nöral indüksiyon analizinin civciv embriyosunda nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik. Bu prosedürü uygularken, transplantasyon sonrası greft çevresindeki tüm sıvının bir pipet yardımıyla uzaklaştırılması gerektiğini unutmamak önemlidir.Bu işlem, greftin güvenli bir şekilde konumlandırılmasını ve kültür süreci boyunca konak embriyodan uzaklaşmamasını sağlayacaktır. Hepsi bu kadar. Teşekkürler. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

assay-for-neural-induction-in-the-chick-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Çeşitli büyüme faktörleri ve proteinler, hücre gelişimi sırasında farklı hücre kaderi almaya ikna etmek için etkileşim. Burada E2.5 civciv embriyolarının boncuk koyarak gelişimin farklı proteinler arasındaki etkileşimleri adresine ovo hazırlanmasında kullanımı göstermektedir.

Erken Evre Tavuk Embriyolar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk yerleştirme

Bu video nöronların genetik olarak tanımlanan gruplar aksonal yollar kullanarak embriyonik civciv omurilik görselleştirmek için nasıl...

Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon

Eksplante hücreleri (gövde nöral krest hücreleri) göçü analiz etmek bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, pahalı yumuşak, ve bu gibi ana gövde tepe nöral hücre kültürü içinde hücre-hücre etkileşimleri türetilmiş olanlar gibi, göç polarite hem chemokinesis ve diğer etkilerden kemotaksisi ayrım yapabilmektedir.

Bir Modifiye Zigmond Odası Testi kullanılarak Trunk Sinir Crest Hücre Göç Analizi

Bıldırcın-chick kimerik embriyo kuş nöral krest hücrelerinin göç ve nihai kaderi analiz etmek için bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, aksi ayarlanmamış bir civciv embriyo içinde ayırt etmek zor göç ve farklılaşma sırasında nöral krest hücrelerinden izlemek için basit ve kolay bir tekniktir.

Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem...

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Bu video, erken evre bir civciv embriyosunun ön beyninden nöronları izole etmek ve bir nöronal ağ oluşturmak için bunları bir mikroelektrot dizisi üzerinde kültürlemek için bir yöntemi göstermektedir.

Civciv Embriyonik Nöronlarının Çok Elektrotlu Bir Dizi Üzerinde İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Gelişimsel nörobiyoloji temel bir soru nasıl nöron ağları embriyonik beyinde kurulan olmasıdır. Burada bu Cre / Lox-plazmid ve dorsal internöronlar etiket ve çeşitli gelişim aşamalarında kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri izlemek için kuş Beyin içinde piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi olarak yeni genetik araçları ile bir elektroporasyon tekniği kombine.

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Burada damar içi DiI enjeksiyonu ile birlikte civcivGFP nöral tüp intraspsi greftleme kullanılarak nöral kret hücrelerinin ve kan damarlarının çift etiketlendiğini bildiriyoruz. Bu deneysel teknik, organogenez sırasında NCC türevi (enterik) sinir sisteminin ve vasküler sistemin gelişimini aynı anda görselleştirmemizi ve incelememizi sağlar.

ChickGFP Nöral Tüp Greftleme ve Karbosiyanine Boya DiI Enjeksiyonu Kullanılarak Tavuk Embriyoları İçinde Nöral Kret Hücrelerinin ve Kan Damarlarının Çift Etiketlenimi

Bu çok yönlü protokol, civciv embriyolarından kraniyal nöral kıvrımların eksizyonu yoluyla göç öncesi nöral krest hücrelerinin (NCC'ler) izolasyonunu tanımlar. Kaplama ve inkübasyon üzerine, göçmen NCC'ler nöral kıvrım eksplantlarından ortaya çıkar ve basitleştirilmiş bir 2D ortamda hücre morfolojisinin ve göçünün değerlendirilmesine izin verir.

Civciv Kraniyal Nöral Kret Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi

Bu protokol, civciv embriyo nörülasyonu sırasında nöral plak dokusunun mekanik özelliklerini uzunlamasına izlemek için geliştirilmiştir. Bir Brillouin mikroskobu ve bir sahne inkübasyon sisteminin entegrasyonuna dayanır ve ex ovo kültürlenmiş civciv embriyolarında nöral plaka dokusunun canlı mekanik görüntülemesini sağlar.

Civciv Embriyosunun Nöral Tüp Kapanması Sırasında Dokunun Mekanik Gelişiminin İzlenmesi

Öğrenin civciv embriyolarında sinir indüksiyonu testi için Hensen nodunun transplantasyonu ve floresan boyama yöntemlerini. Bu teknik gelişimsel nörobiyoloji araştırmalarında sinir kaderi belirlenmesini incelemeye yardımcı olur.

Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

Daha fazla video keşfet