Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

Bu video, civciv embriyosunda nöral indüksiyon testi için izlenen farklı aşamaları göstermektedir. İlk olarak, konak embriyo yeni kültüre eklenir; donör embriyo ise salin içine eklenir ve Hensen düğümü floresan boya ile işaretlenir. Hensen düğümü donör embriyodan çıkarılır ve konak embriyoya nakledilir.

Konak embriyo 24 saat boyunca kültüre edilir, fikse edilir ve fey floresansı altında foto oksidasyon için işleme alınır. dab ile. Embriyo, nöral bir belirteç ile in-situ hibridizasyon için işleme alınır.

Merhaba, ben Houston'daki Texas A&M Üniversitesi Çevresel ve Genomik Tıp Merkezi'ndeki Fennell Laboratuvarı'ndan Delphine. Bugün sizlere tavuk embriyosunda nöral indüksiyon deneylerinin gerçekleştirilmesi için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarda, antiepileptik ilaçların Hensen düğümünün nöral indükleyici özellikleri üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Nöral indüksiyon deneyi için yumurtaların hazırlanması gerekir. Bu yumurtalar, hamburger ve Hamilton evre üç artı veya HH 3+ seviyesine gelene kadar, nemli bir inkübatörde yan yatırılmış halde 13 saat boyunca inkübe edilmelidir.

Ardından, daha önce gösterilmiş olan yeni kültür yöntemini kullanarak konak embriyoyu hazırlayın. JoVE'de, konak embriyonun yüzeyini 200 µL salin ile kaplayın. Bu işlem, donör greftin daha sonraki transferini ve konumlandırılmasını kolaylaştıracaktır.

Son olarak, düzeneği ters çevrilmiş bir Falcon 35 milimetrelik kültür kabı ile kapatın. Donör embriyoyu çıkarmak için, pensle kabuğa hafifçe vurarak yumurtayı açın. Kabuğun üst kısmını çıkarıp atın.

Kalın albümini pensle alın ve embriyonun yukarı bakması için vitellüs kesesini kaba pensle eğin. Albümini çıkardıktan sonra, embriyonun etrafındaki vitellüs kesesinden ince makasla kare bir parça kesin. Embriyoyu bir kaşık yardımıyla vitellüsten ayırın ve PBS içeren bir kaba yerleştirin.

Ardından, donör embriyoyu vitellüs ve area lucita'dan ayırmak için pens kullanın. Ayırma işlemi tamamlandığında, grefti etiketlemek ve transplantasyonunu yapmak için donör embriyoyu PBS içeren SIL guard kaplı bir kaba aktarın. Mikroskop altında 50 µL'lik cam mikrokapiler pipetler çekmek için bir mikro elektrot çekici kullanın.

Mikropipet ucunu ince uçlu pens kullanarak kesin. Mikropipeti, modelleme kili şeridi ile kaplanmış bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, transplantasyon öncesinde grefti işaretlemek için kullanılacak boya çözeltisini hazırlayın.

İlk olarak, 1 mL absolut etanol içerisinde %0,5 konsantrasyonunda bir dye eye stok çözeltisi hazırlayın. Bu stok, karanlıkta -20 °C'de saklanabilir. Ardından, 45 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı blokta, önceden ısıtılmış 10 µL dai stoğunu 90 µL 0,3 M sükroz ile karıştırın. Bu sıcaklık, dai'nin çökelmesini ve çözünmez kristallerin oluşumunu önlemek için gereklidir.

Çözeltiyi mini SPECT fuge'de beş ila 10 saniye boyunca kısa süreliğine santrifüjleyin. DAI çözeltisi artık kullanıma hazırdır; donör embriyoyu sırt kısmı yukarı gelecek şekilde, sill guard kaplı kabın tabanına böcek iğneleriyle sabitleyin. Embriyo sabitlendikten sonra, hafif bir basınç uygulayarak mikropipeti D eye ile doldurun.

Bir aspiratör tüp düzeneği kullanarak, henson düğümüne küçük bir dai bolusu uygulayın. Henson düğümünün tamamının etiketlendiğinden emin olarak işlemi tekrarlayın.

Bir mikro kapiler pipet veya mikro disseksiyon bıçağı kullanarak henson düğümünü kesin; düğümün dorsal tarafı bir oluk oluşturduğu için ventral taraftan ayırt edilebilir, ventral taraf ise düzdür. Gerektiğinde, greftin dorsal tarafını karmin tozu ile işaretleyin. Bu, greftin doğru dorsal-ventral oryantasyonla yerleştirilmesini sağlayacaktır.

10 µL'lik bir gilson pipet kullanarak, grefti bir mikro kapiler pipet yardımıyla konak embriyoya transfer edin. Grefti, konak embriyonun henson düğümü seviyesindeki opak sınır bölgesi olan area lucida bölgesine yaklaştırın. Ardından, bu bölgede 80 ila 100 µm boyutunda küçük bir insizyon yapmak için bir mikro kapiler pipet veya bir mikro diseksiyon bıçağı kullanın.

Konak embriyosunun henson düğümü seviyesindeki opak sınırı belirleyin. Mikro kapiler pipet veya mikro diseksiyon bıçağı kullanın. Grefti, ventral tarafı size bakacak ve posterior ucu konak embriyosundaki eş bölgeye paralel olacak şekilde konumlandırın. Konumlandırma tamamlandıktan sonra, greftin konak bölgeye yakın konumda kaldığından emin olarak konak embriyosundaki salini uzaklaştırın ve konak embriyoyu, önceki gönderimizde açıklandığı şekilde 18 ila 22 saat boyunca yeni kültür işlemi için hazırlayın.

24 saatlik kültürlemeden sonra embriyo inkübatörden çıkarılır ve bir sigara kabına (cigar dish) iğnelenir. İçerikteki PBS uzaklaştırılır ve yerine %4 paraformaldehit eklenir. Embriyo ardından 24 saat boyunca fikse edilir.

Fiksatifi uygun bir tehlikeli atık kabına boşaltın ve fiksasyon kabına PBS ekleyin. Pinler çıktıktan sonra böcek iğnelerini pens yardımıyla çıkarın. Embriyoyu PBS içeren bir sintilasyon şişesine aktarmak için küt uçlu bir pastör pipeti kullanın.

Embriyoyu PBS ile beşer dakikadan iki kez ve twist tamponu ile bir kez beş dakika boyunca yıkayın; yıkama işleminden sonra embriyoyu 0,1 mililitre Tris tamponu içeren bir cam kaviteli lam üzerine aktarın. Tris tamponu çözeltisini 0,1 mililitre DAB çözeltisi ile değiştirin. Pipet ucunu çamaşır suyu çözeltisi içeren kovaya atın.

DAB'yi dekontamine etmek için, FEI floresein izotiyosiyanat floresans odağı altındaki çukur lamın üzerine bir kapatma lamı yerleştirin. Mikroskobun greft donör hücreler üzerindeki objektifi, tüm floresan kırmızı hücreler kahverengiye dönene kadar FEI floresansına maruz kaldığında floresan kırmızı görünecektir. Bu durum, döğ fluorokromun FEI uyarım dalga boyuna maruz kalarak çözünmeyen kahverengi kristallere fotokonverte olması sonucunda gerçekleşir.

DAB varlığında 488 nanometrede. Bu işlem 20 dakika ile iki saat arasında sürer. Foto-oksidasyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra, ince pensler kullanarak lamel kaldırın.

Embriyoyu, PBTW veya %0.1 tween 20 içeren PBS bulunan 20 mililitrelik bir sintilasyon şişesine aktarın. Son olarak, lamel, kapatıcı ve cam boşluktaki DAB'ı etkisiz hale getirin. Embriyoyu görselleştirme için işlemek amacıyla bir çamaşır suyu çözeltisinde inkübe ederek kaydırın.

Sadece DIG etiketli prob ile embriyoyu inkübe ederek in-situ hibridizasyona geçiniz. Ardından, Jo Video iki'de açıklandığı gibi fotoğraflama ve kesit alma işlemlerine başlayınız. İşte bir nöral indüksiyon analizi örneği.

Başlangıçta greft, konakçı embriyonun area lucita ve area alpaca bölgeleri arasındaki sınıra yerleştirilir. Hem donör hem de konakçı embriyolar üçüncü artı aşamadadır. Kültürde dokuz saat geçtikten sonra greft farklılaşmaya başlar ve minyatür bir sekizinci eksi baş görünümü oluşturan yapıya yol açar.

Kültürde 24 saat geçtikten sonra, fiksasyonun ardından nöral indüksiyon tamamlanır. Embriyo, foto oksidasyon için işlenir. Başlangıçta, donör kaynaklı boya ile işaretlenmiş hücrelerin, burada kırmızı renkte görüldüğü üzere minyatür bir Noor oluşturacak şekilde çoğaldıkları görülmektedir.

Foto oksidasyondan sonra bu hücreler kahverengi görünür. Ardından embriyo, nöral belirteç Otx2 için bütün mount in situ hibridizasyonu ile işleme tabi tutulur. Otx2, Dr. Bonelli'nin laboratuvarında geliştirilmiştir.

Donör greftin, konakçı kaynaklı dokuda OTX two ekspresyonunu indüklediği gösterilmiştir. Nöral indüksiyon analizinin civciv embriyosunda nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik. Bu prosedürü uygularken, transplantasyon sonrası greft çevresindeki tüm sıvının bir pipet yardımıyla uzaklaştırılması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Bu işlem, greftin güvenli bir şekilde konumlandırılmasını ve kültür süreci boyunca konak embriyodan uzaklaşmamasını sağlayacaktır. Hepsi bu kadar. Teşekkürler. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.