5.10: Katı Faz Sentezi

1. Reçinenin Yüklenmesi

1. 100 mL'lik bir peptit sentez kabına 2-klorotritil klorür (CTC) reçinesi (1.1 mmol / g, 0.360 g, 0.400 mmol) ekleyin. 20 mL DMF ekleyin ve N_{2 altında 30 dakika şişmelerine izin verin.}
2. Boncukları vakum altında boşaltın ve 10 mL DMF ekleyin.
3. 500 mg Fmoc-Ala-OH (1.60 mmol) ve 2.5 mL i-Pr₂EtN ekleyin ve N₂ altında 15 dakika.
karıştırın.
4. Çözücüyü vakum altında boşaltın ve yüklemeyi Fmoc-Ala-OH ile 15 dakika boyunca tekrarlayın.
5. Çözücüyü vakum altında boşaltın ve boncukları N₂ altında 10 mL DMF ile yıkayın ve 3x vakum altında boşaltın.

2. Fmoc Grubunun Korumasının Kaldırılması

1. DMF'ye 10 mL %20 4-metilpiperidin ekleyin ve boncukları N₂ altında 15 dakika
karıştırın
2. Çözücüyü vakum altında boşaltın ve korumayı tekrarlayın.
3. Boncukları N₂ altında 10 mL DMF ile yıkayın ve 3x
vakum altında boşaltın.

3. Kaiser Testinin Gerçekleştirilmesi

1. 1-2 damla çözelti A (0.5 mL 0.01 M KCN, 24.5 mL piridin), çözelti B (1 g ninhidrin, 20 mL n-bütanol) ve çözelti C (20 g fenol, 10 mL n-butanol) her biri iki test tüpüne. Bir test tüpü kontrol olurken, diğeri reaksiyonu izleyecektir.
2. Reaksiyon kabından reaksiyon test tüpüne birkaç damla reçine ekleyin ve iki test tüpünü 110 °C'ye ısıtın.
3. Korumanın kaldırılması tamamlanırsa, test tüpünün içeriği koyu mavi/mor bir renge dönecektir. Korumanın kaldırılması tamamlanmamışsa veya başarısız olursa, çözelti sarı kalacaktır. Reaksiyon test tüpünü kontrol test tüpü ile karşılaştırın.

4. Sonraki Yapı Taşlarını Birleştirme

1. Çözücüyü vakum altında boşaltın.
2. Boncukları 10 mL N-metil-2-pirolidon ile N₂ altında yıkayın ve çözücüyü vakum altında boşaltın.
3. Bir sonraki bağlantıya başlamak için 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1.6 mmol), 610 mg HBTU (1.6 mmol) ve 2.5 mLi-Pr₂EtN ekleyin ve reçinenin 30 dakika boyunca N₂ altında köpürmesine izin verin.
4. Çözücüyü vakum altında boşaltın.
5. Boncukları N₂ altında 10 mL DMF ile yıkayın ve 3x
vakum altında boşaltın.
6. Kaplinin tamamlanıp tamamlanmadığını görmek için Kaiser testini gerçekleştirin (bkz. adım 3.1-3.3). Test tüpündeki boncuklar ve çözelti sarı olmalıdır.

5. Peptidin reçineden ayrılması

1. 2.1-2.3 adımlarını kullanarak kalan Fmoc grubunu ayırın.
2. Çözücü vakum altında boşaltıldıktan sonra, reçineye 40 mL bölünme solüsyonu (%95 TFA, %2,5 H₂O, %2,5 TIPS) ekleyin ve 3 saat boyunca N₂ altında köpürtün.
3. Peptit sentezleyiciye yeni bir alıcı şişe yerleştirin ve istenen peptiti içeren TFA çözeltisini vakum altında yeni şişeye boşaltın.

6. Peptitin çökelmesi ve I izolasyonu

1. TFA çözeltisini 4 konik şişeye ayırın ve peptidi çökeltmek için her şişeye 25 mL soğuk eter (-20 ° C) ekleyin.
2. Şişeleri (3.000 rpm, 0-4 °C) 20 dakika santrifüjleyin. Kalan TFA ve eter çözeltisini konik şişelerden boşaltın ve istenen dipeptiti beyaz bir katı olarak elde etmek için peptit çökeltisini konsantre edin.

Katı faz sentezi, ürünün çözünmeyen bir malzemeye bağlıyken sentezlendiği bir yöntemdir.

Katı faz sentezi genellikle biyolojik oligomerler ve peptitler, nükleik asitler ve oligosakkaritler gibi polimerler üretmek için kullanılır. Bu moleküller, monomer adı verilen daha küçük moleküler alt birimlerin zincirlerinden oluşur. Bir oligomer veya polimerin sentezlenmesi, monomerlerin doğru sırayla eklenmesi gerektiğinden birçok adım gerektirir.

Çok adımlı sentezlerle ilgili bir sorun, ara ürünler olarak adlandırılan her adımın kararlı ürünlerinin saflaştırılması ve izolasyonunun toplam verimi azaltmasıdır. Katı faz sentezinde, ara ürün sentez boyunca katı desteğe bağlı kalır. Bu, çözelti fazı reaktiflerinin, çözücülerin ve yan ürünlerin yıkanarak uzaklaştırılmasına izin vererek, her bir ara ürünü adımlar arasında saflaştırma ve izole etme ihtiyacını ortadan kaldırır.

Bu video, katı faz peptit sentezi prosedürünü gösterecek ve kimyada katı faz sentezinin birkaç uygulamasını tanıtacaktır.

Katı faz sentezinde, bir molekül, bir reaksiyon dizisinde katı bir destek üzerinde sentezlenir. Örneğin, bir oligomer veya polimer, nihai ürünü oluşturmak için her seferinde bir monomer sentezlenecektir. Büyüyen oligomer veya polimer, reaktiflerle destekten ayrılana veya parçalanana kadar katı desteğe güçlü bir şekilde bağlı kalır.

Her monomer, polimer zincirinin bir parçası olmak için en az iki bağlanma bölgesine sahip olmalıdır, ancak monomerin doğru atoma bağlanmasını sağlamak için aynı anda yalnızca bir bağlanma bölgesi mevcut olabilir. Bu, sentezin bir veya daha fazla adımı sırasında reaktif olmayan işlevsel gruplar olan koruma grupları ile elde edilir. Bağlanma bölgesi, koruyucu grubu reaktif bir fonksiyonel gruba dönüştürmek için molekülün spesifik reaktiflerle işlenmesiyle eski haline getirilir veya korumasız hale getirilir.

Katı faz sentezine başlamak için, başlangıç malzemesi, mevcut tek bağlanma bölgesinde özel olarak tasarlanmış bir reçineye veya çözünmeyen polimere bağlanır. Daha sonra, zincirdeki ikinci monomerin bağlanmasına izin vermek için bağlı başlangıç malzemesinin koruması kaldırılır. Daha sonra, monomerler arasındaki bağlanmayı kolaylaştırmak için bir birleştirme maddesi ile birlikte zincirdeki ikinci monomerin bir çözeltisi eklenir.

İkinci monomer başlangıç malzemesine bağlandığında, elde edilen dimerik ara ürün korumasız hale getirilir. Bu işlem, hedef oligomer veya polimer oluşana kadar tekrarlanır. Ürün, katı destekten saflaştırılabileceği, izole edilebileceği ve analiz edilebileceği çözeltiye bölünür.

Katı faz sentezi genellikle amino asit zincirleri olan peptitlerin sentezi için kullanılır. Amino asitler bir amin grubuna, bir karboksil grubuna ve bir ikame ediciye veya 'yan zincire' sahiptir. Amin başlangıçta korunur. Koruması kaldırıldıktan sonra, amin bir sonraki amino asidin karboksil grubu ile bir peptit bağı oluşturur.

Artık katı faz sentezinin ilkelerini anladığınıza göre, ilk iki amino asidin eklenmesini göstereceğimiz katı faz peptit sentezi için bir prosedürden geçelim.

Prosedüre başlamak için, atık için bir alıcı şişeyi 100 mL'lik bir manuel peptit sentez kabına bağlayın. Daha sonra kabın içine 0.360 g 2-klorotritil klorür reçinesi yerleştirin. Tankın yan koluna bir nitrojen gazı hattı ve tırtıklı hortum adaptörüne bir vakum hattı bağlayın.

Reçineye 20 mL dimetilformamid ekleyin ve reçine boncuklarının bir nitrojen gazı akışı altında 30 dakika şişmesine izin verin. Ardından, çözücüyü boşaltmak için vakum uygulayın.

Kaba 10 mL DMF, 1.6 mmol Fmoc korumalı bir amino asit ve 2.5 mL N, N-diizopropetilamin ekleyin. Korunan amino asidi reçine üzerine yüklemek için çözeltiyi karıştıran nitrojen gazının altında 15 dakika köpürtün.

Çözücüyü vakum altında çıkarın ve ikinci bir yükleme yapın. Çözücüyü çıkardıktan sonra, yüklenen reçine boncuklarını DMF'nin 10 mL'lik kısımlarında üç kez çalkalayın ve her yıkamayı alıcı şişeye boşaltın.

Daha sonra, DMF'de yüklenen boncuklara 10 mL% 20'lik bir 4-metilpiperidin çözeltisi ekleyin. Fmoc grubunu çıkarmak için karışımı 15 dakika köpürtün.

Çözücüyü boşaltın ve koruma giderme prosedürünü tekrarlayın. Yüklenen reçineyi daha önce olduğu gibi üç kez yıkayın ve boşaltın. Boncukları bir sonraki adıma hazır olana kadar çözücü altında saklayın.

Yüklenen bileşiğin tamamen korumasız olduğunu doğrulamak için, önce her bir Kaiser test solüsyonundan 1 ila 2 damla iki test tüpüne yerleştirin.

Bir test tüpüne birkaç yüklü boncuk yerleştirin ve her iki tüpü de bir yağ banyosunda 110 dereceye ısıtın. Reçine karışımı koyu maviden mora dönerse korumanın kaldırılması tamamlanmıştır, bu da karışımdaki amin gruplarının varlığını gösterir.

Birleştirme adımına başlamak için önce boncukları bir N2 gazı akışı altında 10 mL NMP ile yıkayın.

Daha sonra, yüklenen reçineye 10 mL NMP, 1.6 mmol sonraki Fmoc korumalı amino asit, 1.6 mmol birleştirme maddesi HBTU ve 2.5 mL DIPEA ekleyin.

N2 gazını reçine karışımından 30 dakika boyunca kabarcıklayın ve ardından çözücüyü boşaltın. Boncukları daha önce olduğu gibi üç kez 10 mL DMF ile yıkayın ve boşaltın.

Kaiser testini tekrarlayın. Boncuklar ve çözelti sararırsa, hiçbir amin grubunun mevcut olmadığını gösteren birleştirme başarılı bir şekilde gerçekleşmiştir.

Daha sonra, yeni Fmoc grubunu DMF'de% 20 4-metilpiperidin ile ayırın ve boncukları 10 mL DMF kısımları ile yıkayın. Hedef peptitte kalan her amino asit için birleştirme ve korumayı tekrarlayın.

Son amino asidin koruması kaldırıldıktan ve reçine boncukları yıkandıktan sonra, peptit ürününü reçineden ayırmak için 40 mL peptit bölünme solüsyonu ekleyin.

Azot gazını reçine karışımından 3 saat boyunca kabarcıklayın ve ardından alıcı şişeyi değiştirin. Çözeltiyi reçine karışımından vakum altında yeni alıcı şişeye aktarın.

Nihai ürünü oluşturmak için, çözücüyü döner bir buharlaştırıcı ile çıkarın.

Katı faz sentezi biyoloji ve kimyada yaygın olarak kullanılmaktadır. Birkaç örneğe bakalım.

Katı faz sentezi, enerji depolama gibi önemli biyolojik rollere sahip basit şeker monomerlerinin kısa zincirleri olan oligosakkaritlere birçok yeni sentetik yol açtı. Peptit bağlarından farklı olarak, şekerler arasındaki her bağ bir stereomerkez içerir. Bir oligosakkariti sentezlemek için, sadece monomerlerin doğru sırada olması değil, aynı zamanda bağların da doğru stereokimyaya sahip olması gerekir. Katı faz sentez teknikleri, her bir monomeri, günümüzde otomatikleştirilmek üzere yeterince rafine edilmiş olan oldukça stereoselektif bir işlemle birleştirmek için geliştirilmiştir.

Katı faz sentezi, bir bileşiğin birçok varyantını tek bir sentetik işlemde sentezleme uygulaması olan kombinatoryal kimyaya yaygın bir yaklaşımdır. Yüklenen reçine, farklı monomerler veya moleküllerle reaksiyona girmek için kolayca porsiyonlara ayrılabilir. Her reaksiyondan sonra, porsiyonlar yıkanır ve yeniden birleştirilir. Bu, istenen sayıda ürün oluşturulana kadar tekrarlanır. Bu teknik, yeni bileşikler üretmek veya çok çeşitli moleküllere sahip bir bileşiğin reaktivitesini değerlendirmek için kullanılabildiğinden, farmasötik araştırmalarda özellikle yararlıdır.

Az önce JoVE'nin katı faz sentezine girişini izlediniz. Artık katı faz sentezinin altında yatan ilkeleri, katı faz peptit sentezi prosedürünü ve katı faz sentezinin organik kimyada nasıl kullanıldığına dair birkaç örneği anlamalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler!