Name: Canlı Fare IL-17 salgılayan T Hücreler Algılama ve İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Öğrenin fare IL-17 salgılayan TH17 lökositlerini sitokin salgılayan hücre izolasyonu yöntemiyle tespit ve izolasyonunu. Akış sitometrisi ile canlı hücre analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reaktifler hazırlanması <ol><li> BSA (% 0.5) ve 2 mM EDTA içeren PBS ile bir tampon yapın. MACS ayırma kolonları hava kabarcıklarını engellemek için, 2-8 ° C Kullanmadan önce tampon gazlar ve saklanacak. </li><li> Biz RPMI 1640 orta% 5 fare içeren serum kullanın. Kültür ortamı, bu bileşiklerin hücre stimülasyon özgüllüğü değiştirmek gibi, BSA veya FCS içermemelidir. </li><li> Fare IL-17 sekresyonu Testi - Miltenyi-Biotec Hücre Zenginleştirme ve Tespit Kiti. IL-17 Yakalama Reaktif, IL-17 Algılama Antikor (biotin), Anti-Biotin-PE ve Anti-PE mikro kiti aşağıdaki bileşenleri içerir. </li></ol> Splenositlerin Uyarıcı <ol><li> Bu protokol unstimulated dalak ve T hücreleri için bir karşı negatif ve pozitif kontrol, huzurunda yapılır. Bu protokol, steril tekniği kullanılarak yürütülmektedir. </li><li> GentleMACS ™ Dissociator kullanılarak izole edildi fare dalak tek bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Hücre konsantrasyonu hücre sayımı ile önceden belirlenmiş olmalıdır. Pelet oda sıcaklığında 10 dakika için 200 × g hücreleri. </li><li> Santrifüj sonrasında, bir pipet kullanarak pelet kapalı supernatant aspirat. Pelet kaybını önlemek için tüp süzün. </li><li> Şimdi, kültür ortamı hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve sonra iyi bir eklemek. ML başına on milyon hücreleri ve santimetrekare başına beş milyon hücre bir konsantrasyon için yeterli orta ekleyin. </li><li> Yeniden süspanse hücreleri bağışıklık yanıtının teşvik etmek, örnek ionomycin (1 mcg / ml) ve PMA (10 ng / ml) ekleyin ve karışımı hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme çözüm. Daha sonra kuyu buna göre etiketlenir. </li><li> Şimdi, bizim hücreleri 3 saat için 37 ° inkübe olacak ° C uyarılması dönemi başlatmak için herhangi bir karışım. Stimülasyon başlangıcından IL-17 analizi sonucunda 3 saat devam edin, buna göre planlayın. </li><li> Salgılanması durdurmak için, hücre buz üzerine yerleştirilir ve soğuk tampon yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme tarafından uyarılmış hücreleri toplamak. Hücreler daha sonra iyi bir tüpe aktarılır ve ikinci kez yıkanır. </li><li> Tüm hücreleri toplanır emin olmak için, bir mikroskop altında çanak kontrol etmek için iyi bir fikirdir. Eğer hücreler hala bağlı kalır, soğuk tamponu ile bulaşık durulama kalan hücreleri toplamak. Herhangi bir hücre kümeleri hücre süspansiyonu öncesi ayırma filtreleri kullanarak silinebilir. </li></ol> Yakalama Reaktif Hücreler Etiketleme <ol><li> IL-17 salgılayan hücrelerin% 2&#39;den az bulunması halinde bu testte en iyi şekilde çalışıp çalışmadığını, dikkat etmek çok önemlidir. </li><li> , IL-17 salgılayan hücreleri konsantrasyonu, buna göre hacimleri ayarla% 2 daha fazla olması bekleniyor. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="Şekil 8" width="500" height="162" /></li><li> Bu prosedürün potansiyel Bir hatadır Catch Reaktif çapraz kontaminasyon, iki spesifik antikor böylece yanlış pozitif olmayan bir salgılayan T hücre ve tuzakları bir komşu lenfosit salgılanan IL-17 üreten, bağlanır etiketleme sırasında oluşabilir. </li><li> Bu sorunu aşmak için, IL-17 difüzyon yavaş ve bu çapraz bulaşmayı önlemek için önce soğuk tamponu ile etiketleme ve iş aşağı soğuk hücreler için kritik öneme sahiptir. Hücreleri soğuk tutmak için ek olarak, belirli bir konsantrasyon tutulmalıdır. </li><li> Etiketleme prosedürü başlatmak için, 15 ml kapaklı tüp içinde on milyon hücreleri kullanır. Kullanılmak üzere yüksek hücre sayıları varsa, sadece buna bağlı tüm birimler büyütmek. Optimal hücre konsantrasyonu elde edildikten sonra, 10 ml soğuk tampon ekleyerek hücreleri yıkayın. </li><li> Soğutmalı santrifüj (2-8 ° C) 10 dakika için 300 hücreleri × g dönerler. </li><li> Santrifüj sonra, tamamen bir pipet kullanarak süpernatant aspirat. Bu hücre kaybı ve kesin olmayan birimler yol açacak gibi süpernatant süzün. Soğuk tampon, santrifüj ve aspirasyon 10ml ekleyerek oluşan yıkama adımı yineleyin. </li><li> Şimdi biz bir pelet istenilen saflık olduğunu, soğuk kültür ortamı 80 mcL hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Etiketlemek için, şimdi 20 mcL Fare IL-17 Catch Reaktif katacak. </li><li> 5 dakika buz üzerinde hücrelerin inkübe edin. </li><li> 5 dakika buz üzerinde kuluçka döneminden sonra, tüp kaldırmak ve 37 ° C sıcak bir ortamda 10 ml hücrelerin sulandırmak. Sonra MACSmix Tüp Rotator tüp güvenli ve tüp inkübe 37 ° C altında 45 dakika süreyle sürekli hareket. Sıcaklığının artmasıyla 37 ° C sitokin salgılanması yeniden başlayacaktır. </li></ol> IL-17 Algılama Antikor (Biotin) ve Anti-Biotin-PE Hücreler Etiketleme <ol><li> 37 ° C&#39;de 45 dakika salgılanması süre sonra, buz üzerinde hemen tüp yerleştirin. Bu sitokin salgılanması durur. Burada üzerinde buz üzerinde hücre tutmak için kritik öneme sahiptir.Soğuk tampon Çalışma Catch Reaktif çapraz kontaminasyonu engellemek. </li><li> 2-8 300xg soğuk tampon ve santrifüj ° C de 10 dakika ile tüp doldurun. Süpernatantı tamamen aspire. Yıkama, bir kez daha adımı yineleyin. </li><li> Hücre pelletini soğuk tampon 80 mcL yeniden süspanse ve buz üzerinde tüp yerleştirilir. </li><li> Antikor belirsiz bağlanma önlemek için, 5 dakika buz 10μl FCR Engelleme Reaktif ve inkübe eklenmesi önerilir. Sonra, 10 dakika boyunca buz üzerinde biotin ve inkübe konjuge Fare IL-17 Algılama Antikor (Biotin) 20 mcL ekleyin. </li><li> Bir kez daha, 2-8 300xg soğuk tampon ve santrifüj 10 ml ekleyerek ° C 10 dakika önce yaptığı gibi hücrelerin yıkayın. </li><li> Şimdi süpernatant aspirat ve soğuk tampon 80 ul hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Ikincil antikor, Anti-Biotin-PE 20 mcL ekleyin. </li><li> Hücreler ve sekonder antikor çözüm karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde tüp tekrar kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Bu ikinci inkübasyon tamamlandıktan sonra, 10 ml soğuk tampon ve santrifüj ile hücreleri yıkayın. </li><li> Pelet şimdi soğuk tampon 500 mcL yeniden süspanse edilebilir. </li><li> Hücreler daha fazla alt analizi için ayrılacak varsa, bunlar manyetik Anti-PE-mikro etiketli ve MACS Sütunlar ve MACS Ayırıcılar kullanarak elle ya da otomatik ayrılmış olabilir. </li><li> Şimdi splenositlerin etiketleme ve analiz için hazır hale gelmiş. </li></ol> FACS Analizi <ol><li> Bizim analizi için, flow sitometri ile uyarılır ve unstimulated splenositlerin karşılaştırabilirsiniz. </li><li> Akım sitometri analizi önce, hücrelerin ölü hücreleri çıkış kapısı propidium iyodür ile 0.5 mg / ml lekeli. MACSQuant ™ Analyzer, her bir örnek için 200.000 hücre yüklü ve şimdi örnekleri göreli antikor reaktivite dağılım araziler bakmaya devam etmektedir. Nadir hücrelerinin analizi için iki önemli hususlar - IL-17 pozitif hücrelerin gibi flow sitometri ile: <ul><li> forward scatter karşı yan scatter plot lenfosit bir kapı ayarı </li><li> ve ölü hücreleri (propidium iyodür ile boyanmış) ve B-hücrelerinin (belirsiz arka plan boyama yol açabilir) dışarı yolluk algılama hassasiyeti daha da geliştirmek için </li></ul></li><li> , CD4-APC T hücreleri ve B hücreleri algılamak için CD45R/B220-PerCP antikor tespit antikor kullanılır. Biz örneklerin ileri ve yan dağılım özelliklerini görmek ve lenfosit nüfus üzerinde bir kapı uygulamak. </li><li> Lekeli ölü hücreleri ve lekeli B hücreleri (Y ekseni) görmek için ikinci bir kapı yapıldı. Bu hücreler, T hücre analizi hariç tutulur. </li><li> Bu örnekte, aslında bizim negatif kontrol, biz unstimulated örnekleri çok az sayıda IL-17 salgılayan CD4 pozitif T hücreleri olduğunu görebilirsiniz - yaklaşık% 0.003 (Şekil 4). Uyarılmış T hücre popülasyonu baktığımızda, önemli sayıda CD4 pozitif T hücreleri görebilirsiniz salgılar IL-17 - ayırma önce 0,367% (Şekil 5A) ve MACS Teknoloji (Şekil 5B) ile manyetik ayırma sonra% 60.76. </li></ol>

Tüm protokolleri ve veri sayfaları www.miltenyibiotec.com mevcuttur. Uyarılar Reaktifler sodyum azit içerir. Asidik şartlar altında, son derece toksik olan hidrazoik asit, sodyum azid verir. Atma atılmadan önce akan su ile seyreltilmiş olmalıdır. Bu önlemler patlayıcı koşullarının daha da geliştirilmesi sıhhi tesisat birikmeleri önlemek için tavsiye edilir.

Th17 hücreleri adaptif bağışıklık ve inflamatuvar yanıt tamamlayıcı bir rol oynamaktadır ve otoimmun inflamasyonu sürüş önemli bir bileşenidir. Bu video Miltenyi Kullanıcı Fare nasıl kullanılacağını belgeler IL-17 sekresyonu Testi - Hücre Zenginleştirme ve Tespit Kiti (PE). Bu işlemi yaparken, IL-17 salgılayan hücrelerin başlangıç ​​hücre hazırlama frekans bir tahmin olması önemlidir. Etiketleme ve sitokin sekresyon dönemi sırasında uygun hücre konsantrasyonu süspansiyon diğer hücreler tarafından çapraz bulaşmayı önler ve güvenilir sonuçlar sağlar.

<table><tbody><tr><td>Fare IL-17 Salgı Analizi Hücre Zenginleştirme ve Tespit Kiti (PE) </td><td>Reaktif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Besiyeri</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reaktif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reaktif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Propidyum İyodür Çözeltisi</td><td>Reaktif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FcR Bloklama reaktifi, fare </td><td>Reaktif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ölü Hücre Uzaklaştırma Kiti </td><td>Reaktif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tüp Rotatorı</td><td>Cihaz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Dissosiyatör</td><td>Cihaz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Başlangıç Kiti</td><td>Cihaz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Kolonları</td><td>Ekipman</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Ayırıcı</td><td>Ekipman</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

canlı fare il-17 salgılayan t hücreler algılama ve İzolasyonu

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

MACS Sitokin Salgı Testi teknolojisi, tek hücre düzeyinde ve yaşayabilir sitokin salgılayan hücreleri hassas izolasyon salgılanan sitokinlerin algılanmasını sağlar. IL-17 salgılayan hücreleri, fare dalak tek bir hücre süspansiyonu ° C PMA / ionomycin sitokin salgılanması neden 37 hazırlanan ve uyarılır etiketlemek için. Sekresyonunu hücreleri durdurmak için bir iki spesifik antikor salgılanır ve hücre yüzeyine yakın yakalandı olarak IL-17 ve lökositlerin hücre yüzeyinde CD45 bağlanır, sonra buz üzerine yerleştirilir ve IL-17 Yakalama Reaktif maruz kalmaktadır. Salgı sonra sıcaklık 37 artırarak yeniden başladı ° C ve IL-17 Catch Reaktif tarafından tutulur. Salgı sonra buz üzerinde hücreleri yerleştirerek, tekrar durdurulur. Kapana kısılmış bir IL-17 algılamak için, hücreler, biotin için konjuge ikinci bir IL-17-spesifik antikor ve Anti-Biotin-PE antikor ile inkübe edilir. Hücreler artık doğrudan akış sitometri ile analiz veya Anti-PE konjuge mikro sonraki etiketleme izolasyon ve zenginleşmesi için hazırlanmış olabilir.

Bu prosedür, tespiti ve izolasyonu stimülasyon üzerine IL-17 aktif salgılar fare Th17 lökositlerin açıklamaktadır.

Canlı Fare IL-17 salgılayan T Hücreler Algılama ve İzolasyonu

MACS Sitokin Salınım Analizi teknolojisi, salgılanan sitokinlerin tek hücre düzeyinde tespit edilmesine ve canlı hücrelerin hassas bir şekilde izole edilmesine olanak tanır...

Max sitokin salınım analizi teknolojisi, tek hücre düzeyinde salgılanan sitokinlerin saptanmasına ve IL 17 salgılayan hücreleri işaretlemek amacıyla canlı sitokin salgılayan hücrelerin hassas bir şekilde izole edilmesine olanak tanır. Fare lökositlerinden oluşan tek hücreli bir süspansiyon hazırlanır ve sitokin salınımını başlatmak için 37 °C'de PMA ionomycin ile stimüle edilir, ardından salınım durdurulur. Hücreler daha sonra buz üzerine alınarak IL 17 yakalama reaktifi ile temas ettirilir.Sıcaklık 37 °C'ye yükseltilerek sekresyon yeniden başlatıldığında, IL 17 yakalama reaktifi tarafından tutulur. Lökositlerin hücre yüzeyindeki CD 45'e ve sekrete edildiği anda hücre yüzeyi yakınında yakalanan IL 17'ye bağlanan bispesifik bir antikor kullanılır; ardından yakalanan IL 17'yi tespit etmek için hücreler buz üzerine konularak sekresyon tekrar durdurulur. Hücreler, biyotine konjuge edilmiş ikinci bir IL 17 spesifik antikoru ve bir anti-biotin PE antikoru ile inkübe edilir. Hücreler artık doğrudan akış sitometrisi ile analiz edilebilir veya anti-PE konjuge mikrobobcuklarla yapılacak sonraki etiketlemelerle izolasyon ve zenginleştirme için hazırlanabilir. Merhaba, ben Miltenyi Biotec bilim insanlarından Ellie Rankin.Bugün size, stimülasyon üzerine IL 17 salgılayan TH 17 lökositlerinin nasıl izole edileceği ve tespit edileceğine dair bir prosedür göstereceğim. IL 17, adaptif immünitede ve inflamatuar yanıtta önemli bir rol oynar; ayrıca otoimmün inflamasyonun tetiklenmesinde de önemlidir. Şimdi size analizinin nasıl yapıldığını göstereyim. Bugünkü Protokol için, öncelikle BSA ve 2 mM EDTA içeren PBS ile bir tampon hazırlamamız gerekiyor; hava kabarcıkları maksimizasyon ayırma kolonlarını tıkayabileceği için, tamponun gazı alınmalı ve kullanımdan önce 2 ila 8 °C'de saklanmalıdır.İkinci olarak, %5 fare serumu içeren RPMI 1640 besiyeri kullanıyoruz. Besiyeri BSA veya FCS içermemelidir; çünkü bu bileşikler hücre stimülasyonunun özgünlüğünü değiştirecektir. Son olarak, MIL 10 E Biotech'ten fare IL 17 sekresyon analizi hücre zenginleştirme ve tespit kitine ihtiyacınız olacaktır.Kit, şu bileşenleri içermektedir: IL 17 yakalama reaktifi, IL 17 tespit antikoru, biyotin, anti-biyotin PE ve anti-PE mikrobilyeler. Mantıksal olarak, bu protokolü muhtemelen uyarılmamış PLE sitleri gibi negatif ve pozitif bir kontrolle ve T hücreleri için bir karşı boyama ile gerçekleştireceksiniz. Demonstrasyonumuzda, yalnızca uyarılmış hücrelere odaklanacağız.Bu protokol steril teknik kullanılarak gerçekleştirilecektir. Protokolümüz, gentle max associator kullanılarak izole edilmiş fare SP sitlerinin tek hücreli süspansiyonu ile başlar. Hücre konsantrasyonu, hücre sayımı yoluyla önceden belirlenmiş olmalıdır.Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 Gs ile pelletleyin. Santrifüj işleminin ardından, bir pipet kullanarak pelletin üzerindeki süpernatantı aspire ediyoruz. Pellet kaybını önlemek için tüpü boşaltmayın (dekantasyon yapmayın). Şimdi hücreler kültür ortamımızda resüspande edilmeli ve ardından kuyucuğa eklenmelidir; mililitrede 10 milyon hücre ve santimetrekare başına 5 milyon hücre konsantrasyonu sağlayacak kadar yeterli ortam ekleyin.Yeniden süspanse ettiğimiz hücrelerde bir bağışıklık yanıtını uyarmak için, örneğe ion mycin ve PMA ekleyip solüsyonu pipetle nazikçe aşağı yukarı hareket ettirerek karıştırıyoruz. Ardından kuyucuklar uygun şekilde etiketlenir. Şimdi, stimülasyon dönemini başlatmak için karıştırma yapmadan 37 °C'de üç saat boyunca inkübasyona bırakacağız.Uyarımın başlamasından üç saat sonra IL 17 analizine geçin. Planlamanızı buna göre yapın. Burada uyarılmış fare dalak hücrelerini görmekteyiz.Lütfen stimüle edilmiş hücrelerin belirgin morfolojisine ve hücre kümelenmesine dikkat edin. Netlik sağlamak adına, yalnızca stimüle edilmiş hücreleri takip edeceğiz. Salgılanmayı durdurmak için, bu aşamadan itibaren stimüle edilmiş hücreleri nazikçe pipetleyerek yukarı-aşağı hareketlerle toplayacağız.Hücreler daha sonra soğuk tampon ile kuyucuktan bir tüpe aktarılır ve ikinci kez yıkanır. Tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için kabı mikroskop altında kontrol etmek faydalıdır. Eğer hala yapışık hücreler varsa, kabı durulayarak kalan hücreleri toplayabilirsiniz.Soğuk tampon kullanılarak, hücre süspansiyonunuzdaki tüm hücre kümeleri ön-katılım filtreleri kullanılarak giderilebilir. Bu prosedürün potansiyel bir hatası, etiketleme sırasında meydana gelebilen yakalama reaktifinin çapraz kontaminasyonudur. Bispesifik antikor, salgılamayan bir T-hücresine bağlandığında ve komşu bir lenfosit tarafından salgılanan IL 17'yi hapsettiğinde yanlış pozitif sonuçlar oluşabilir; bu sorunun önüne geçmek için, salgılanmayı sınırlamak, IL 17'nin difüzyonunu yavaşlatmak ve bu çapraz kontaminasyonu önlemek amacıyla etiketleme öncesinde hücreleri soğutmak ve soğuk tamponla çalışmak kritik önem taşır.IL 17 salgılayan hücrelerin %2'den fazlasının mevcut olması durumunda da çapraz kontaminasyonun meydana gelebileceğinin unutulmaması oldukça önemlidir. IL 17 salgılayan hücre konsantrasyonunun %2'den yüksek olması bekleniyorsa, hacimleri buna göre ayarlayın. Bu nedenle, hücreler soğuk tutulmasının yanı sıra belirli bir konsantrasyonda tutulmalıdır.Etiketleme prosedürüne başlamak için 15 mililitrelik kapatılabilir bir tüp içerisinde 10 milyon hücre kullanıyoruz. Daha yüksek hücre sayılarının kullanılması gerekiyorsa, tüm hacimleri buna göre ölçeklendirin. Optimal hücre konsantrasyonu elde edildikten sonra, 10 mililitre soğuk tampon ekleyerek hücreleri yıkayın.Şimdi hücreleri soğutmalı bir santrifüj cihazında 300 Gs'de 10 dakika boyunca çöktürün; santrifüj işleminin ardından süpernatanı bir pipet kullanarak tamamen aspire edin. Hücre kaybına ve hacim belirsizliklerine yol açacağı için süpernatanı dekante etmeyin. 10 mililitre soğuk tampon ekleme, santrifüjleme ve aspirasyon aşamalarından oluşan yıkama adımını tekrarlayın.İstenen saflıkta bir pelet elde ettiğimize göre, hücreleri etiketlemek için soğuk kültür ortamının herhangi bir mikrolitre miktarında yeniden süspanse edin. Şimdi 20 mikrolitre fare IL 17 yakalama reaktifi ekleyeceğiz. Hücreleri buz üzerinde beş dakika inkübe edin.Buz üzerinde beş dakikalık inkübasyon süresinin ardından, tüpü çıkarın ve hücreleri 10 mililitre 37 °C'ye ısıtılmış besiyerinde seyreltin. Ardından tüpü max mix tüp rotatörüne sabitleyin ve tüpü 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin.Sürekli hareket altında, sıcaklığın 37 °C'ye çıkarılması sitokin salınımını yeniden başlatacaktır. 37 °C'de 45 dakikalık salınım süresinin ardından, tüpü hemen buza yerleştirin. Bu işlem sitokin salınımını durduracaktır.Bundan sonra hücreleri buz üzerinde tutmak kritik önem taşır. Soğuk tamponla çalışmak, yakalama reaktifinin çapraz kontaminasyonunu önleyecektir. Tüpü soğuk tamponla doldurun ve 2-8 °C'de 10 dakika boyunca 300 Gs'de santrifüj edin.Süpernatantı tamamen aspire edin. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın. Hücre peleti 80 µL soğuk tampon içerisinde süspanse edilir ve tüp buza yerleştirilir.Antikorun spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için, 10 µL FCR bloklama reaktifi eklenmesini ve buz üzerinde beş dakika inkübe edilmesini öneriyoruz. Ardından, biyotine konjuge edilmiş 20 µL fare IL 17 deteksiyon antikoru ekliyoruz ve buz üzerinde 10 dakika inkübe ediyoruz. Hücreleri, daha önce yaptığımız gibi 10 mL soğuk tampon ekleyerek tekrar yıkayıp, 2-8 °C'de 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj ediyoruz.Şimdi hücre peletini aspire edin ve 80 µL soğuk tampon çözeltisi içinde yeniden süspanse edin, ardından 20 µL sekonder antikor (Anti biotin pe) ekleyin. Hücreleri ve sekonder antikor çözeltisini karıştırın ve tüpü buz üzerinde tekrar 10 dakika inkube edin.İkinci inkübasyon tamamlandığında, hücreleri 10 milliliters soğuk tamponla yıkayın ve santrifüjleyin. Pelet şimdi 500 microliters soğuk tampon içinde yeniden süspanse edilebilir. Hücrelerin daha sonraki analizler için ayrılması gerekiyorsa, anti PE mikroboncuklar ile manyetik olarak işaretlenebilir ve max kolonlar ile max separatörler kullanılarak manuel veya otomatik olarak ayrılabilirler.SPLU sitlerinin etiketleme işlemini tamamladık ve analiz için hazırız. Çalıştırmadan önce, stimüle edilmiş ve stimüle edilmemiş SP sitlerini akış sitometrisi ile karşılaştıracağız. Ölü hücreleri dışlamak için hücreler 0,5 µg/mL propidyum iyodür ile boyanır.Akış sitometresine her örnek için 200.000 hücre yüklendi ve şimdi örneklerdeki göreceli antikor reaktivitesinin saçılım grafiklerine bakacağız. Akış sitometrisi ile IL 17 pozitif hücreler gibi nadir hücrelerin analizi için iki önemli husus, ileri saçılım (forward scatter) ile yan saçılım (side scatter) grafiğinde lenfositler üzerinde bir kapı (gate) belirlemek ve propidyum iyodür ile boyanmış ölü hücreler ile spesifik olmayan arka plan boyanmasına neden olabilecek B hücrelerini dışlamak için kapılama yapmaktır. Tespit hassasiyetini daha da artırmak için.Burada, T hücrelerini saptamak için CD4 APC antikoru ve B hücrelerini saptamak için CD45RB CD20 PerCP antikoru kullanıyoruz. Örneklerin ileri ve yan saçılım özelliklerini inceleyerek lenfosit popülasyonu ilişkisi üzerine bir kapı (gate) uyguluyoruz. Y ekseninde boyanmış ölü hücreleri ve boyanmış B hücrelerini görmek için ikinci bir kapı uygulandı.Bu hücreler T hücresi analizinin dışında tutulmuştur. Esasında negatif kontrolümüz olan bu örnekte, uyarılmamış örneklerde IL 17 salgılayan CD four pozitif T hücrelerinin yaklaşık 0.003% oranında, yani çok az sayıda olduğunu görebiliyoruz. Uyarılmış T hücresi popülasyonuna baktığımızda, ayrıştırma öncesinde yaklaşık 0.367% ve max teknolojisi ile manyetik ayrıştırma sonrasında 60 point 76% oranında IL 17 salgılayan önemli sayıda CD four pozitif T hücresi olduğunu görebiliyoruz. Mul 10 biotech'in pe kullanan hücre zenginleştirme ve tespit kiti için mouse IL 17 sekresyon assay kullanımını video dokümantasyonu aracılığıyla size göstermiş olduk.Bu prosedürün en önemli kısmı, başlangıç popülasyonunuzdaki IL 17 salgılayan hücrelerin frekansı hakkında bir fikir sahibi olmaktır. Doğru hücre konsantrasyonu, işaretleme ve sitokin salgı süresi boyunca çapraz kontaminasyonun azalmasını sağlayarak güvenilir sonuçlar elde edilmesini garanti eder. İşte bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

detection-and-isolation-of-viable-mouse-il-17-secreting-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, iNKT hücreleri olarak da bilinen değişmez doğal öldürücü T hücrelerinin izole edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Prosedür, dalaktaki iNKT hücrelerinin aktivasyonunu ve çoğalmasını uyarmak için bir fareye sentetik bir glikolipid enjekte edilmesiyle başlar. Daha sonra, dalaktan tek hücreli süspansiyonlar hazırlanır ve floroforlarla etiketlenmiş iNKT hücre tanıyan komplekslerle inkübe edilir, ardından iNKT hücrelerini izole etmek için manyetik boncuk bazlı ayırma yapılır.

Bir Fare Modelinden Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin İzole Edilmesi

Diğer T hücresi alt kümelerinin farklı efektör işlevleri ile, Th17 hücreleri merkezi inflamatuar otoimmün implike edilmiştir. Bu in vitro Th17 farklılaşma protokolü naif CD4 + T lenfositleri Th17 hücrelerine ayırt edebilir, ve daha fazla otoimmün ve konak cevabı rollerini incelemek belirlemek için bir araç sağlar.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Farelerde sınıf anahtarı rekombinasyonunun in vitro analizi, B hücrelerinin yüzeyindeki Fc reseptörlerine bağlı sitofilik IgE molekülleri nedeniyle zordur.  Sitoplazmik floresan boyama için fiksasyon ve geçirgenlikten önce yüzeye bağlı IgE'nin tripsin aracılı bölünmesini kullanarak IgE tespiti için bir yöntem tarif ediyoruz.

Doğru Algılama Fare B Lineage Hücreleri IgE-ifade

Naif CD4+ T hücreleri, aktivasyon sırasındaki ortama bağlı olarak çeşitli alt kümelere polarize olur.  Naif CD4 + T hücrelerinin çeşitli efektör alt kümelerine farklılaşması, T hücresi reseptör uyaranlarının ve spesifik sitokin sinyallerinin eklenmesiyle in vitro olarak elde edilebilir.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Burada, naif ve kronik lenfositik koryomenenjit virüsü ile enfekte farelerden izole edilen düzenleyici T (Treg) hücrelerinin fenotipini analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Ek olarak, Treg hücrelerinin baskılayıcı aktivitesini değerlendirmek için bir süreç sunuyoruz.

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Burada, farklı fare dokuları içindeki IL-22 üreten hücreleri görselleştirmek için bir transgenik raportör fare modelini açıklıyoruz. Bu yöntem, faredeki diğer sitokinlerin veya salgı proteinlerinin yerini izlemek için kullanılabilir.

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Tip 2 inflamasyonda rol oynayan Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2'ler), esas olarak helmint enfeksiyonuna, alerjik hastalıklara, metabolik homeostaza ve doku onarımına yanıt olarak katılır. Bu çalışmada, ILC2'leri murin burun mukozasından izole etmek ve CD226 ekspresyonunu saptamak için bir prosedür gösterilmiştir.

CD226 Ekspresyonunu Saptamak için Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin Fare Burun Mukozasından İzolasyonu

Bu protokol, naif CD4+ T hücrelerinin in vitro olarak patojenik Th17 hücrelerine farklılaşmasını tanımlar. Spesifik olarak, çok parametreli akış sitometrisi tabanlı bir yaklaşımla birleştirildiğinde, bu farklılaşma yöntemi kullanılarak saf CD4+ T hücrelerinden %90 saflıkta patojenik Th4 hücreleri elde edilebilir.

Farede Naif CD4+ T Hücrelerinin Patojenik Th17 Hücrelerine İn Vitro Farklılaşması

Mevcut çalışma, virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader bağlılığını değerlendirmek ve bu hücrelerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için protokoller göstermektedir.

Akut LCMV ile Enfekte Farelerde Virüse Özgü Foliküler Yardımcı CD4+ T Hücresinin Erken Farklılaşmasına Erişim

Manyetik boncuk bazlı T hücresi zenginleştirmesi ve peptit: majör histouyumluluk kompleksi (MHC) tetramerleri aracılığıyla fare akciğerlerindeki nadir antijene özgü T hücresi popülasyonlarını izole etmek ve tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Fare Akciğerlerinden Nadir Antijene Özgü T Hücrelerinin Peptit ile Tanımlanması: Majör Histouyumluluk Kompleksi Tetramerleri

Öğrenin fare IL-17 salgılayan TH17 lökositlerini sitokin salgılayan hücre izolasyonu yöntemiyle tespit ve izolasyonunu. Akış sitometrisi ile canlı hücre analizi sağlar.

Canlı Fare IL-17 salgılayan T Hücreler Algılama ve İzolasyonu

Daha fazla video keşfet