Nano İlaç Taşıyıcılarının Biyodağılımı: SEM Uygulamaları

1. Nanopartikül Enjeksiyonu ve Organ Toplama

1. Pasif hedeflemeye izin vermek için anestezi uygulanmış bir fareye intravenöz olarak nanopartiküller enjekte edin.
2. İstenilen zaman noktalarında, yani enjeksiyondan 1, 4 ve 8 hafta sonra, fareleri Amerikan Veteriner Hekimler Birliği (AVMA) Yönergelerine göre insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
3. Vücut boşluğunu açın ve ilgilenilen organları cerrahi olarak çıkarın. Organları, numune hazırlanana kadar polipropilen bir kapta% 10 fosfat tamponlu formalin içine yerleştirin.

2. Doku Örneği Hazırlama

1. Fare dokusunu fiksatiften fosfat tamponlu saline (PBS) aktarmak için forseps kullanın. PBS'yi her 10 dakikada bir değiştirerek örneği 30 dakika boyunca sallayın.
2. Dokuyu çıkarın ve bir kimwipe ile kurulayın. Ardından, optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) içeren plastik bir kalıba yerleştirin. Gece boyunca -80 °C'de saklayın.
3. Ertesi gün, numuneyi kriyostata aktarın ve sıcaklığı -23 °C'ye ayarlayın.
4. Slaytları organ tipi ve nanopartikül boyutu ile etiketleyin ve kriyostattaki bir rafa yerleştirin.
5. Kriyostat aynasını OCT ile kapatın ve numuneyi üstüne yerleştirin. Ekstraktör pistonunu numunenin üzerine indirin ve 3-5 dakika dengelenmesine izin verin.
6. Mandreni numune tutucuya monte edin ve bıçağın donmuş numuneyi düz bir şekilde kesebilmesi için yönlendirin. Kaba kaplama için numuneyi bıçağa yaklaştırın. Kalınlığı 30 μm'ye ayarlayın ve eşit şekilde kesilmiş bir dilim elde edilene kadar birkaç bölümü dilimleyin.
7. Kesit kalınlığını 7-8 μm'ye düşürerek ince kaplamaya geçin. Dilim üzerindeki etiketli bir cam slayta basarak dilimlenmiş bir bölümü toplayın. Her slaytın üzerine iki slayt yerleştirin ve bir slayt rafında saklayın. Oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
8. Kuruduktan sonra, OCT'yi çıkarmak için sürgülü rafı 3 dakika boyunca %50 etanole batırarak numuneleri kurutun. Ardından, rafı -20 °C'de 10 dakika boyunca 1:1 oranında soğuk metanol / aseton içine yerleştirmeden önce rafı 3 dakika boyunca %80 etanole aktarın.
9. Sürgülü rafı çıkarın ve fazla çözücüyü bir kağıt havlu üzerine boşaltın. 20-30 dakika sonra, slaytları bir slayt kutusuna koyun ve görüntüleme yapılana kadar -20 °C'de bir dondurucuda saklayın.

3. SEM ve EDS kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme

1. Numuneyi "Biyolojik Numunelerin SEM Görüntülemesi" bölümünde açıklandığı gibi hazırlayın. Ardından numuneyi SEM'e yükleyin.
2. SEM'i açın ve çalışma mesafesini yaklaşık 5 mm'ye ve hızlanma voltajını ve ışın akımını normalde biyolojik bir numune için çok yüksek olan 25 keV'ye ayarlayın. Bununla birlikte, numune iletkenlik ve koruma için kaplanmıştır.
3. Nanopartikülleri içerecek yapıları görmek için görüntülemeye başlayın ve yaklaşık 1.000-2.000X büyütme oranına yakınlaştırın. Geri saçılma algılaması (BSD) olmadan, bunları belirli bir derinliğin altında ayırt edilemeyeceğini unutmayın.
4. BSD'yi aynı parametreler altına yerleştirin ve sahneyi z yönünde daha önce olduğu gibi aynı çalışma mesafesine getirin.
5. Görüntülemeye yaklaşık aynı büyütme oranında başlayın ve nanopartiküllerin varlığında yüksek kontrastı görebildiğinizi kontrol edin. Görüntüleri kaydedin.
6. Nanopartiküller için en yüksek kontrastı göstereni seçmek için farklı BSD konfigürasyonları (dedektör üzerindeki yüklerin hizalandığı yer) kullanın.
7. Bir nanoparçacığı veya nanoparçacık kümesini gösteren yüksek kontrastlı bir alanı yakınlaştırın.
8. Haznenin 2^nd kamerasını açın ve SEM eklentisi üzerindeki aşağı düğmesine basarak EDS'yi sisteme takarken izleyin. EDS kapandığında ancak BSD'ye veya tabancaya dokunmadığında, düğmeyi bırakın.
9. Aztec programını EDS bilgisayarında (hala iş istasyonunda) açın ve SEM'den bir görüntü alın. Kontrast ve nanopartiküller açısından çok yoğun bir alana tıklamak için "göster ve çek" yöntemini kullanın.
10. EDS, bu noktadan itibaren karakteristik X-ışınlarının spektrumunu gösterecektir. Grafikte tanımlanacak hem baryum hem de titanyum tepe noktalarını arayın. Bu, baktığınız şeyin gerçekten nanopartiküller olduğunu ve herhangi bir kontaminasyon olmadığını doğrular.
11. Örneğe geri dönün ve slayttaki organın sınırlarını haritalamak için Atlas yazılımını kullanın. Alanın mozaik görüntüsünü oluşturmak için "Organ" protokolünü seçin ve çalışmasına izin verin (bu en fazla birkaç saat sürebilir).
12. Bileşik görüntü yazılım tarafından oluşturulduktan ve birleştirildikten sonra, onu bir Tif dosyası olarak dışa aktarın.
13. Tif dosyasını açık kaynaklı bir yazılım olan ImageJ'de açın ve çok yüksek kontrastlı alanları (yani nanopartiküller) vurgulamak için kontrast eşiği değerlerini ayarlayın. Organ protokolünde tanımlanan piksel boyutunu kullanarak nanopartiküllerin hacmini ölçmek için yerleşik işlevleri kullanın (yaklaşık 100 nm olmalıdır).
14. Bu prosedür sadece fare akciğerinin 1 haftalık örneğine atıfta bulunurken, bu prosedür dağılımı gösteren bir grafik derlemek için diğer haftalardan ve diğer organlardan alınan örneklerle tekrarlanır.
15. Her hafta için her organ için biyo-dağılımı hesapladıktan sonra, biyodağılım grafikleri, 8 hafta boyunca biyodağılım ve nanopartiküllerin konsantrasyonundaki değişiklikleri gösterecektir. Bunlar en yüksek konsantrasyonu gösterir ve ayrıca nanopartiküllerin organdan temizlenmesinin ne kadar sürdüğü hakkında bilgi sağlar.