Biyolojik Örneklerin SEM Görüntülemesi

Taramalı elektron mikroskobu veya SEM, biyolojik malzemeleri nano ölçekte görüntülemek için sıklıkla kullanılır. Bir numuneyi görüntülemek için ışık kullanan optik mikroskoplar, biyolojik numuneleri tahribatsız bir şekilde görüntülemek için yoğun bir şekilde kullanılır, ancak çözünürlükleri ve alan derinliği sınırlıdır, bu nedenle bir nanometreye kadar daha yüksek çözünürlük elde etmek için SEM kullanılır.

SEM'de, bir elektron demeti, daha sonra numuneye çarpan bir dizi kondansatör mercek aracılığıyla odaklanır. Işın numuneye çarptığında, yüzeydeki elektronlar saçılır ve dedektör tarafından ölçülür.

Bu videoda SEM'in nasıl çalıştığını tartışacağız, biyolojik bir numunenin laboratuvarda nasıl görüntüleneceğini göstereceğiz ve son olarak hassas numuneleri görüntülemek için kullanılan bazı teknikleri tanıtacağız.

Bir taramalı elektron mikroskobu, bir filament katot ile donatılmış bir elektron tabancası tarafından üretilen yüksek enerjili bir elektron ışını kullanır. Üretilen elektronlar anoda doğru itilir ve daha sonra objektif merceğe girmeden önce kondansatör mercekler kullanılarak odaklanır. Objektif mercek, ışını yüzey boyunca raster olarak tarandığı numuneye odaklamak için kalibre edilir. Elektronların numunedeki atomlarla etkileşimleri, numunenin topografyasını, element bileşimini ve kristalliğini incelemek için kullanılır. Gelen elektron ışını yüzeye çarptığında ikincil ve geri saçılan elektronlar yayar. İkincil elektronlar, yüzeye yakın numuneden yayılan ve topografik bilgi sağlayan düşük enerjili elektronlardır.

Geri saçılan elektronlar ise gelen ışının zıt yönünde yansıtılır. Etkileşim yoğunluğu, artan atom ağırlığı ile artar ve kullanıcının bileşim farklılıklarını ayırt etmesini sağlar. Biyolojik numunelerin SEM ile görüntülenmesine özel dikkat gösterilmesi gerekir, çünkü SEM yüksek bir vakum kullanır, bu nedenle tipik olarak yüksek su içeriğine sahip biyolojik numunelerin önce kurutulması gerekir. Bu, hassas numunelerin, özellikle hücrelerin yapısının çökmesine neden olabilir. Böylece, hücreler bir fiksatif ile muamele edilir, durulanır ve daha sonra artan miktarlarda etanol ile yıkanarak yavaşça kurutulur.

Bu gösteride kullanılan kollajen-hidroksiapatit doku iskelesi gibi sert biyolojik materyaller için numune, yüksek vakum altında birkaç günlük bir süre boyunca kurutulur.

Son olarak, tipik SEM görüntüleme iletken bir yüzey gerektirdiğinden, biyolojik numuneler genellikle görüntülemeden önce ince bir metal tabakası ile püskürtülür. Artık SEM'in nasıl çalıştığını ve görüntüleme için biyolojik bir numunenin nasıl hazırlanacağını tartıştığımıza göre, bir kollajen-hidroksiapatit doku iskelesinin nasıl hazırlanacağına ve görüntüleneceğine bir göz atalım.

İlk olarak, biyomateryal numunesini iletken karbon bant kullanarak bir SEM saplamasına monte edin ve numunenin kuru olduğundan ve yüzeyinde kontaminasyon olmadığından emin olun.

Ardından, monte edilmiş numuneyi bir püskürtme kaplayıcının haznesine yerleştirin, hazneyi aşağı pompalayın ve ince, dört ila altı nanometre kalınlığında bir metal kaplama, bu durumda altın elde etmek için numuneyi yaklaşık 40 saniye boyunca püskürterek kaplayın yeterli kapsama alanı. Kaplandıktan sonra, numuneyi çıkarın ve saplamayı, şimdi iletken metal ile kaplanmış olan numunenin üstüne bağlamak için iletken bant kullanın.

Son olarak, saplamayı SEM aşamasına monte edin ve yandaki vidayı sıkın. Artık örnek SEM ile görüntülenmeye hazırdır. İlk olarak, sahneyi SEM odasına yükleyin ve kapıyı kapatın, ardından yükleme odasından vakuma geçişi açmak için aktarma düğmesine basın. İç kapı açıldıktan sonra, metal çubuğu sahneye vidalayın ve numuneyi vakum odasına itin, ardından metal çubuğu sökün ve tamamen yük odasına geri çekin, ardından vakum odasını kapatmak için mağazaya basın.

Şimdi SEM kullanarak örneği görüntüleyelim.

İlk olarak, denetleyiciyi kullanarak sahneyi hareket ettirin ve örneği görüş alanına yönlendirin, ardından çalışma mesafesi beş ila 10 milimetre olana kadar örneği dikey olarak hareket ettirin. Elektron demetini açın ve ikincil elektronlar için dedektörü seçin, ışını başlangıçta beş kiloelektron volta ayarlayın, ardından gerektiği gibi 20 ila 30 kiloelektron volta kadar artırın. Görüntü net değilse, net bir görüntü görünene kadar odak, parlaklık ve kontrast düğmelerini çevirin.

Örnek üzerinde yeni bir nokta bulmak için sahne alanı navigasyonunu ve X ve Y yönlerini kullanın, ardından istenen özellikler görünür olana kadar büyütmeyi artırın. Görüntü kalitesini artırmak için odağı, kontrastı ve parlaklığı gerektiği gibi ayarlayın. Daha iyi bir görüntü elde etmek için tarama hızını azaltmanız ve satır ortalamasını açmanız, ardından görüntüyü kaydetmeniz gerekebilir.

SEM görüntüleri, 25 mikrondan daha küçük lifli özelliklere sahip, oldukça üç boyutlu ve gözenekli bir yapı ortaya koymaktadır. Optik mikroskopi çok daha düşük bir alan derinliğine sahip olduğundan, bu özelliklerin optik mikroskopi kullanılarak görselleştirilmesi zor olacaktır.

Biyolojik yapıların SEM ile görüntülenmesiyle ilgili, yapı çökmesi veya yüksek enerjili elektron demetinden kaynaklanan hasar dahil olmak üzere birçok zorluk vardır. Şimdi genel SEM tekniğinin bu tür hassas numunelere nasıl uygulandığına bir göz atalım. Bu genç bitki dokuları veya yüksek su içeriğine sahip olanlar gibi hassas biyolojik yapılar, görüntülemeden önce bir fiksasyon işlemi ile tedavi edilmelidir.

Bu çiçek meristemleri hemen taze hazırlanmış bir formalin / asetik asit fiksatif çözeltisi ile muamele edildi. Sabit doku etanol içinde disseke edildi, bir ağ kabına yerleştirildi ve %70, %80, %90 ve %100 etanolden oluşan bir etanol serisi ile dehidre edildi. Son olarak, bitki dokuları kritik bir nokta kurutucu kullanılarak kurutuldu, monte edildi ve ince bir metal kaplama ile kaplandı.

SEM görüntülemeden sonra, işlenmemiş yapıların kurutma işleminden ağır hasar gördüğü ve yapıda önemli bir çökme gösterdiği, sabitlenenlerin ise doğal yapılarını koruduğu açıktır. Alternatif olarak, hücreler ve diğer yüksek su içerikli numuneler çevresel SEM veya ESEM kullanılarak görüntülenebilir. ESEM, geleneksel SEM'de olduğu gibi numune üzerinde raster taranan yüksek enerjili bir elektron ışını kullanır, ancak oda içinde gazlı bir ortam sağlayarak ıslak veya kaplanmamış numunelerin görüntülenmesini sağlar.

Bu, elektron tabancasını içeren yüksek vakum odasının iki açıklık kullanılarak numune odasından ayrılmasıyla yapılır. Elektron ışını, gaz molekülleri tarafından saçılma nedeniyle önemli kayıplara uğrar, ancak tipik olarak görüntüleme için yeterince yüksek bir enerjidir. Burada, hücreler bir silikon çip üzerinde büyütüldü, kuantum noktalarıyla işlevselleştirildi ve bir glutaraldehit fiksasyon protokolü kullanılarak sabitlendi. Hücreler suda görüntülendi ve hücre yüzeyinde görülebilen bireysel kuantum noktaları ile hücrenin çökmemiş yapısını gösterdi.

JoVE'nin SEM kullanarak biyomalzemeleri görselleştirmeye giriş tanıtımını izlediniz. Artık SEM'in nasıl çalıştığını, biyolojik numunelerin nasıl hazırlandığını ve görüntülendiğini ve ayrıca hassas yapılar için tekniğin bazı uygulamalarını anlamalısınız.

İzlediğiniz için teşekkürler!