İmmünohistokimya ve İmmünositokimya: Işık Mikroskobu ile Doku Görüntüleme

1. İmmünositokimya için Hücrelerin Hazırlanması

1. 24 oyuklu bir kültür plakasının kuyucuklarına 0,5 mL hücre süspansiyonu ekleyerek odacıklı slaytlar veya odacıklı lameller üzerine ilgilenilen tohum hücreleri.
   Not: Bazı hücreler, polilizin ile muamele edilmiş lameller gibi işlenmiş lameller üzerinde büyüme gerektirebilir. Optimal tedavi koşulları, kullanılan hücre tipine bağlı olarak kullanıcı tarafından belirlenmelidir.
2. Plakayı nemlendirilmiş bir CO₂ inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin 37°C'de %50-70 birleşene kadar büyümesine izin verin.
3. Hücreler optimal birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını her bir oyuktan çıkarın ve ardından hücreleri 0.5 mL% 4 PFA'da (1X PBS'de seyreltilmiş) inkübe ederek sabitleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
4. Sabitleyiciyi çıkarın ve kuyucukları 1 mL 1X PBS ile üç kez yıkayın.
5. Daha sonra, her bir oyuğa 1X PBS'de 0.5 mL% 0.1 Triton-X-100 ekleyerek hücrelere nüfuz edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
6. Geçirgenlik tamponunu aspire edin ve kuyucukları 1 mL 1X PBS ile üç kez yıkayın.
7. Lameller üzerindeki hücreler artık sabitlenmiş ve geçirgenleştirilmiştir. Aşağıdaki immünohistokimya örneği için gösterilen boyama prosedürüne devam edin - inkübasyonların doğrudan bir doku kesiti lamı yerine 24 oyuklu plakanın kuyucukları içinde yapılması gerekmesi dışında.

2. Boyama için formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü bölümlerin hazırlanması

1. Hazırlanmış formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitleri elde edin.

Deparafinizasyon

2. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez% 100 ksilene daldırın.

Rehidrasyon

3. Slaytları her biri 3 dakika boyunca 2 kez% 100 etanole batırın.
4. Slaytları 3 dakika boyunca %95 etanole daldırın.
5. Slaytları 3 dakika boyunca %70 etanole batırın.
6. Slaytları 3 dakika boyunca %50 etanole daldırın.

Endojen Peroksidaz Aktivitesinin Bloke Edilmesi

7. Slaytları 100 mL %0,3 H₂O₂ içinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
8. Slaytları 1X PBS ile her biri 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.

Antijen Alımı

9. Slaytları IHC sitrat tamponuna (pH 6) daldırın ve 20 dakika kaynatın.
10. Doku slaytları artık lekelenmeye hazırdır.

3. Boyama için taze dondurulmuş, OTC gömülü bölümlerin hazırlanması

1. 5 mm taze izole edilmiş dokuyu bir kalıba yerleştirin ve bölüm tamamen kaplanana kadar OCT ekleyin.
2. Doku bloğunu tamamen donana kadar yavaşça sıvı nitrojene batırın. Numune artık -80°C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
3. Seksiyon için hazır olduğunda, donmuş doku bloğunu bir kriyostata aktarın ve tüm kurulumun -20°C'ye gelmesine izin verin.
4. Bir kriyostat kullanarak 5-10 μm kalınlığındaki doku kesitlerini kesin ve kesitleri doğrudan IHC uyumlu cam slaytlara yerleştirmek için fırça kullanın.
5. Slaytların gece boyunca oda sıcaklığında kurumasına izin verin. Slaytlar -80°C'de de saklanabilir.
6. Boyamadan önce slaytları sabitlemek için slaytları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 250 mL %4 PFA'ya daldırın. En uygun fiksasyon yöntemi kullanıcı tarafından belirlenmelidir.
7. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez 250 mL 1X PBS'ye daldırın.
8. Herhangi bir endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için slaytları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 250 mL %0.3 H₂O₂ içine daldırın.
9. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez 250 mL 1X PBS'ye daldırın.
10. Slaytlar artık boyamaya hazırdır.

4. Boyama

1. Bir bariyer kalemi kullanarak dokuyu hidrofobik bir bariyer ile daire içine alın.

Engelleme

2. Bir pipet kullanarak, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bölümün üzerine 100 μL bloke edici tampon (1X PBS'de seyreltilmiş at serumu) yerleştirin.
3. Bir pipet kullanarak engelleme tamponunu çıkarın.

Primer Antikor İnkübasyonu

4. Çevrelenmiş dokuyu 100 μL seyreltilmiş birincil antikor çözeltisi (fare anti-insan siklin D1, bloke edici tamponda 1:100 oranında seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
5. Her slayttan birincil antikoru boşaltın ve slaytları 1X PBS ile her biri 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.

İkincil Antikor İnkübasyonu

6. Numuneyi 100 μL seyreltilmiş biyotinile edilmiş ikincil antikor (biyotinile at anti-fare IgG 1:200 seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
7. Bölümleri boşaltarak ikincil antikoru çıkarın ve her biri 5 dakika boyunca 2 kez 1X PBS ile yıkayın.

Renk Geliştirme

8. HRP kullanarak görselleştirme: 100 μL avidin-biotin kompleksi (ABC) reaktifi ekleyin ve bölümleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin
   Not: Floresan etiketli antikorlar da kullanılabilir ve uygun bir mikroskop kullanılarak görüntülenebilir.
9. Slaytları 1X PBS ile her biri 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
10. Bölümleri 100 μL DAB'de 5 dakikaya kadar inkübe ederek slaytları geliştirin.
11. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca damıtılmış su (dH₂O) ekleyerek geliştirmeyi durdurun.

Karşı boyama (istenirse)

12. Slaytları 10 dakika boyunca Harris Hematoksilen Çözeltisine (veya 0.1M sodyum asetat (pH 4.2)) içinde %0.5 metil yeşili) kısa bir süreliğine daldırın.
13. Slaytları dH₂O'da her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayarak karşı lekeyi durulayın.

Dehidrasyon

14. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez% 95 etanole batırın.
15. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez% 100 etanole batırın.
16. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez% 100 ksilene daldırın.
17. Slaytları bir kağıt havluyla kurulayın.

Montaj ve lamel uygulaması

18. Slaytlara Organo-Limonene Mount gibi bir damla montaj ortamı ekleyin ve bölümlerin üzerine bir lamel yerleştirin.

Mikroskobik analiz

19. Lekeli bölümleri analiz için uygun bir mikroskop altında gözlemleyin. Burada gözlem için standart bir ışık mikroskobu kullanıldı ve görüntüleme için monte edilmiş bir dijital kamera kullanıldı.