5.5: İmmünohistokimya ve İmmünositokimya: Işık Mikroskobu ile Doku Görüntüleme

1. İmmünositokimya için Hücrelerin Hazırlanması

1. 24 oyuklu bir kültür plakasının kuyucuklarına 0,5 mL hücre süspansiyonu ekleyerek odacıklı slaytlar veya odacıklı lameller üzerine ilgilenilen tohum hücreleri.
   Not: Bazı hücreler, polilizin ile muamele edilmiş lameller gibi işlenmiş lameller üzerinde büyüme gerektirebilir. Optimal tedavi koşulları, kullanılan hücre tipine bağlı olarak kullanıcı tarafından belirlenmelidir.
2. Plakayı nemlendirilmiş bir CO₂ inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin 37°C'de %50-70 birleşene kadar büyümesine izin verin.
3. Hücreler optimal birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını her bir oyuktan çıkarın ve ardından hücreleri 0.5 mL% 4 PFA'da (1X PBS'de seyreltilmiş) inkübe ederek sabitleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
4. Sabitleyiciyi çıkarın ve kuyucukları 1 mL 1X PBS ile üç kez yıkayın.
5. Daha sonra, her bir oyuğa 1X PBS'de 0.5 mL% 0.1 Triton-X-100 ekleyerek hücrelere nüfuz edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
6. Geçirgenlik tamponunu aspire edin ve kuyucukları 1 mL 1X PBS ile üç kez yıkayın.
7. Lameller üzerindeki hücreler artık sabitlenmiş ve geçirgenleştirilmiştir. Aşağıdaki immünohistokimya örneği için gösterilen boyama prosedürüne devam edin - inkübasyonların doğrudan bir doku kesiti lamı yerine 24 oyuklu plakanın kuyucukları içinde yapılması gerekmesi dışında.

2. Boyama için formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü bölümlerin hazırlanması

1. Hazırlanmış formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitleri elde edin.

Deparafinizasyon

2. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez% 100 ksilene daldırın.

Rehidrasyon

3. Slaytları her biri 3 dakika boyunca 2 kez% 100 etanole batırın.
4. Slaytları 3 dakika boyunca %95 etanole daldırın.
5. Slaytları 3 dakika boyunca %70 etanole batırın.
6. Slaytları 3 dakika boyunca %50 etanole daldırın.

Endojen Peroksidaz Aktivitesinin Bloke Edilmesi

7. Slaytları 100 mL %0,3 H₂O₂ içinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
8. Slaytları 1X PBS ile her biri 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.

Antijen Alımı

9. Slaytları IHC sitrat tamponuna (pH 6) daldırın ve 20 dakika kaynatın.
10. Doku slaytları artık lekelenmeye hazırdır.

3. Boyama için taze dondurulmuş, OTC gömülü bölümlerin hazırlanması

1. 5 mm taze izole edilmiş dokuyu bir kalıba yerleştirin ve bölüm tamamen kaplanana kadar OCT ekleyin.
2. Doku bloğunu tamamen donana kadar yavaşça sıvı nitrojene batırın. Numune artık -80°C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
3. Seksiyon için hazır olduğunda, donmuş doku bloğunu bir kriyostata aktarın ve tüm kurulumun -20°C'ye gelmesine izin verin.
4. Bir kriyostat kullanarak 5-10 μm kalınlığındaki doku kesitlerini kesin ve kesitleri doğrudan IHC uyumlu cam slaytlara yerleştirmek için fırça kullanın.
5. Slaytların gece boyunca oda sıcaklığında kurumasına izin verin. Slaytlar -80°C'de de saklanabilir.
6. Boyamadan önce slaytları sabitlemek için slaytları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 250 mL %4 PFA'ya daldırın. En uygun fiksasyon yöntemi kullanıcı tarafından belirlenmelidir.
7. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez 250 mL 1X PBS'ye daldırın.
8. Herhangi bir endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için slaytları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 250 mL %0.3 H₂O₂ içine daldırın.
9. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez 250 mL 1X PBS'ye daldırın.
10. Slaytlar artık boyamaya hazırdır.

4. Boyama

1. Bir bariyer kalemi kullanarak dokuyu hidrofobik bir bariyer ile daire içine alın.

Engelleme

2. Bir pipet kullanarak, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bölümün üzerine 100 μL bloke edici tampon (1X PBS'de seyreltilmiş at serumu) yerleştirin.
3. Bir pipet kullanarak engelleme tamponunu çıkarın.

Primer Antikor İnkübasyonu

4. Çevrelenmiş dokuyu 100 μL seyreltilmiş birincil antikor çözeltisi (fare anti-insan siklin D1, bloke edici tamponda 1:100 oranında seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
5. Her slayttan birincil antikoru boşaltın ve slaytları 1X PBS ile her biri 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.

İkincil Antikor İnkübasyonu

6. Numuneyi 100 μL seyreltilmiş biyotinile edilmiş ikincil antikor (biyotinile at anti-fare IgG 1:200 seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
7. Bölümleri boşaltarak ikincil antikoru çıkarın ve her biri 5 dakika boyunca 2 kez 1X PBS ile yıkayın.

Renk Geliştirme

8. HRP kullanarak görselleştirme: 100 μL avidin-biotin kompleksi (ABC) reaktifi ekleyin ve bölümleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin
   Not: Floresan etiketli antikorlar da kullanılabilir ve uygun bir mikroskop kullanılarak görüntülenebilir.
9. Slaytları 1X PBS ile her biri 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
10. Bölümleri 100 μL DAB'de 5 dakikaya kadar inkübe ederek slaytları geliştirin.
11. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca damıtılmış su (dH₂O) ekleyerek geliştirmeyi durdurun.

Karşı boyama (istenirse)

12. Slaytları 10 dakika boyunca Harris Hematoksilen Çözeltisine (veya 0.1M sodyum asetat (pH 4.2)) içinde %0.5 metil yeşili) kısa bir süreliğine daldırın.
13. Slaytları dH₂O'da her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayarak karşı lekeyi durulayın.

Dehidrasyon

14. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez% 95 etanole batırın.
15. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez% 100 etanole batırın.
16. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez% 100 ksilene daldırın.
17. Slaytları bir kağıt havluyla kurulayın.

Montaj ve lamel uygulaması

18. Slaytlara Organo-Limonene Mount gibi bir damla montaj ortamı ekleyin ve bölümlerin üzerine bir lamel yerleştirin.

Mikroskobik analiz

19. Lekeli bölümleri analiz için uygun bir mikroskop altında gözlemleyin. Burada gözlem için standart bir ışık mikroskobu kullanıldı ve görüntüleme için monte edilmiş bir dijital kamera kullanıldı.

İmmünositokimya ve immünohistokimya, sırasıyla kültürlenmiş hücrelerde ve dokularda ilgilenilen bir protein için boyama yöntemleridir. Her iki ilgili tekniğin temel prensibi, proteini tanımlamak ve görselleştirmek ve hücreler ve dokular içindeki konumunu ve ayrıca göreceli seviyeleri belirlemek için bir tespit sistemi ile etiketlenmiş spesifik antikorların kullanılmasını içerir. Her iki deneydeki süreç de numune hazırlama ile başlar.

Hücrelerdeki protein veya antijen konumlarını spesifik olarak görselleştiren immünosikokimya için bu, üç adımı içerir. İlk adım, hücrelerin büyüme ortamında, tipik olarak bir kültür plakasının kuyucuklarında bir örtü kayması veya lam üzerinde kültürlenmesini gerektiren kaplamadır. Bunu, proteinlerin yapısal bütünlüğünü korumak ve enzim aktivitesinin onları bozmasını önlemek için hücrelere paraformaldehit gibi bir çökeltici veya çapraz bağlama maddesinin eklendiği fiksasyon takip eder. Son adım, hücre zarlarını boyama için geçirgen hale getirmek için bir deterjan eklemeyi içeren geçirgenleştirmedir.

Muadil yöntemde immünohistokimya, proteinler veya antijenler dokularda görüntülenir ve örnek hazırlama beş adımdan oluşur. İlk olarak, tüm doku genellikle paraformaldehit ile fiksasyona tabi tutulur. Bunu, dokunun bir parafin bloğuna gömülmesi ve daha sonra bu bloğun, dokuyu slaytlar üzerine yerleştirilebilecek ince dilimler halinde kesmek için mikrotom adı verilen bir makine kullanılarak kesitlenmesi takip eder. Daha sonra, slaytlar deparafinizasyona veya parafinin doku diliminin etrafından çıkarılmasına tabi tutulur. Daha sonra, isteğe bağlı bir antijen alma adımı gerçekleştirilebilir. Bu, fiksasyon sırasında çapraz bağlanmış epitopları maskelemek için ısı veya enzimler kullanılarak yapılabilir ve bu da onları antikor bağlanması için kullanılabilir hale getirir. Uygun numune hazırlığından sonra, hücre veya doku numunesine hedefe özgü bir primer antikor eklenir. Bu birincil antikor, ilgilenilen proteine bağlanmalıdır. Daha sonra, birincil antikoru algılayan ve ona bağlanan ikincil bir antikor eklenir. Bu ikincil antikor, HRP adı verilen bir enzime konjuge edilir veya bağlanabilir. Spesifik substratı olan DAB eklendiğinde, HRP bunu çözünmeyen, kahverengi bir çökeltiye dönüştürür. Bu kahverengi leke, hedef proteinin yerini işaretler. Slaytlar ayrıca çekirdekleri mavi olarak etiketleyen ve hücre altı lokalizasyonunu belirlemek için uzamsal bir referans noktası sağlayan hematoksilen ile boyanır. Bundan sonra, lama montaj ortamı eklenir ve ardından lekeli numuneyi mühürlemek ve korumak için bir kapak fişi eklenir. Son olarak, slaytlar bir ışık mikroskobu üzerinde görüntülenebilir.

Bu videoda, kaplanmış hücreler ve doku kesitleri için numune hazırlama tekniğini ve ardından doku kesitlerinin immün boyamayı gözlemleyeceksiniz.

İlk olarak, ilgilenilen hücrelerin lamellerin üzerine oturtulması gerekir. Bunu yapmak için, bir doku kültürü davlumbazında çalışarak, 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına tek tek lamelleri yerleştirin. Ardından, kanadı kapatın ve lamelleri en az 15 dakika sterilize etmek için UV ışığını açın. Ardından, UV ışığını kapatın. İlgilenilen hücreleri 10 santimetrelik birleşik bir tabaktan kaldırmak için, ortamı aspire edin, PBS ile kısa bir süre yıkayın ve hücrelere 2 dakika boyunca tripsin ekleyin. Ardından, hücrelerin ayrıldığından emin olmak için plakanın yan tarafına hafifçe vurun ve tripsini ortamla nötralize edin. Ardından, 0 ekleyin. Her bir oyuğa 5 mL hücre süspansiyonu koyun, lamelleri kapattığınızdan emin olun. Plakayı nemlendirilmiş bir CO2 inkübatörüne yerleştirin ve hücrelerin %50-70 birleşene kadar 37 santigrat derecede büyümesine izin verin.

Hücreler optimal birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını her bir oyuktan aspire edin ve ardından hücreleri içinde inkübe ederek sabitleyin. 5 mL %4 paraformaldehit, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1X PBS içinde seyreltilir. Fiksatifi çıkardıktan sonra, hücreleri her lamel üzerine 1 mL 1X PBS ekleyerek durulayın. PBS'yi hemen aspire edin, ardından toplam 3 yıkama için durulamayı 2 kez daha tekrarlayın.

Şimdi, her bir oyuğa 1X PBS'de 0.5 mL% 0.1 Triton X-100 ekleyerek hücreleri geçirgen hale getirin. Plakayı oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. Geçirgenlik tamponunu aspire edin ve ardından her bir oyuğa 1 mL 1X PBS ekleyerek hücreleri durulayın. PBS'yi hemen aspire edin ve toplam 3 yıkama için durulamayı 2 kez daha tekrarlayın. Artık lameller üzerindeki hücreler sabitlendiğine ve geçirgenleştiğine göre, inkübasyonların doğrudan bir doku kesiti lamı yerine 24 oyuklu plakanın kuyucukları içinde yapılması gerektiği dışında, aşağıdaki immünohistokimya örneği için gösterilen boyama prosedürüne geçin.

Başlamak için hazırlanmış, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitleri alın. Slaytları bir sürgülü rafa yerleştirerek ve ardından tamamen 250 mL %100 ksilene daldırarak deparafinize edin. Slaytların ksilen içinde 5 dakika inkübe etmesine izin verin. Ardından, slaytları kaptan çıkarın, bir kağıt havluyla silin ve 5 dakika daha taze bir kapta yeni bir ksilen banyosuna koyun.

Daha sonra, bölümleri 3 dakika boyunca% 100 etanol ile başlayan bir dizi dereceli etanol çözeltisinde yeniden sulandırın. Sürgülü rafı bir kağıt havluyla silin ve slaytları 3 dakika daha %100 etanol içeren yeni bir kaba aktarın. Bu yıkama, bir kağıt havluyla kurutma ve belirtilen süre boyunca belirtilen etanol konsantrasyonlarını takiben slaytları yeni bir banyoya aktarma döngüsüne devam edin. Son etanol yıkamasından sonra, rafı bir kağıt havluyla silin ve herhangi bir endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için slaytları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 100 mL% .3 hidrojen peroksit içinde inkübe edin. Slaytları 250 mL 1X PBS'de 5 dakika yıkayın. Bu yıkamayı taze 1X PBS dolu bir kapta 5 dakika daha tekrarlayın.

Daha sonra, slaytları pH 6.0'da 250 mL IHC sitrat tamponuna batırarak ve 20 dakika kaynatarak antijen alımını gerçekleştirin. Ardından boyama protokolüne geçin.

IHC için boyama işlemine başlamak için, tamponun kaplaması gereken minimum alanı belirlemek için bölümleri hidrofobik bir kalemle daire içine alın. Ardından, bu deneyde 1X PBS'de seyreltilmiş at serumu olan 100 mikrolitre engelleme tamponunu bölümün üzerine yerleştirmek için bir pipet kullanın. Slaytları oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Bunu takiben, bir pipet kullanarak engelleme tamponunu çıkarın.

Daha sonra, 1X PBS'de seyreltilmiş 990 mikrolitre at serumunu 1'e ekleyerek birincil antikoru ve bloke edici tamponu 1:100 seyreltmede seyreltin. 5 mL Eppendorf tüpü, ardından 10 mikrolitre primer antikor. Her bölüme 100 mikrolitre seyreltilmiş primer antikor ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Zamanlayıcı çaldığında, her slayttan birincil antikoru boşaltın ve ardından 5 dakika boyunca 250 mL 1X PBS'de yıkayın. Taze 1X PBS kullanarak bu yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.

Slaytlar 1X PBS'de yıkanırken, 1.5 mL'lik bir tüpe 995 mikrolitre bloke edici tampon ekleyerek ikincil antikoru 1:200 seyreltmeye seyreltin ve ardından 5 mikrolitre ikincil antikor ekleyin, bu durumda biyotinile edilmiş at anti-fare IGG'dir. Her bölüme 100 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve ardından slaytları oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, ikincil antikoru bölümlerden boşaltarak çıkarın, ardından slaytları 250 mL 1X PBS'de 5 dakika boyunca yıkayın. Bu yıkamayı taze 1X PBS kullanarak tekrarlayın.

Şimdi, 100 mikrolitre avidin-biotin kompleks reaktifi ekleyin ve bölümleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, slaytları 5 dakika boyunca 250 mL 1X PBS'ye batırarak yıkayın. Önceki yıkama adımlarına benzer şekilde, taze 1X PBS kullanarak bu yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Ardından, bölümleri 100 mikrolitre DAB'de 5 dakikaya kadar inkübe ederek slaytları geliştirin. Bölümleri 5 dakika boyunca 250 mL damıtılmış suya batırarak gelişmeyi durdurun.

Şimdi, istenirse slaytlar karşı boyanabilir. Bunu yapmak için, slaytları kısaca 250 mL Harris Hematoksilen Çözeltisine batırın. Slaytları 250 mL damıtılmış suda 5 dakika yıkayarak karşı lekeyi durulayın. Taze damıtılmış su kullanarak bu yıkamayı 1 kez daha tekrarlayın. Ardından, bölümleri kurutun. Bunu yapmak için, önce slaytları 5 dakika boyunca% 95 etanol içinde inkübe edin. Slaytları bir kağıt havlu üzerine kurulayın ve 5 dakika daha taze %95 etanol içeren yeni bir kaba aktarın. Her biri 5 dakika boyunca belirtilen solüsyonları izleyerek yıkama, bir kağıt havluyla kurutma ve slaytları yeni bir banyoya aktarma döngüsüne devam edin.

Son inkübasyondan sonra, slaytları bir kağıt havluyla kurulayın, ardından slaytlara Organo-Limonene Dağı gibi bir damla montaj ortamı ekleyin. Şimdi, hava kabarcıklarını hapsetmemeye dikkat ederek bölümlerin üzerine bir lamel yerleştirin. Slaytlar artık analiz için mikroskop altında gözlemlenmeye hazırdır.

Lekeli bölümleri gözlemlemek için, lekeyi görselleştirmek için standart bir ışık mikroskobu ve görüntüyü yakalamak için bir dijital kamera kullanın. IHC'nin bu özel örneğinde, vahşi tip ve spontan, çift transgenik veya DTG farelerinden alınan dalak dokuları, lenfomada Dyclin D1 ekspresyonunu incelemek için karşılaştırılmıştır. Dokular parafine gömüldü, kesitlere ayrıldı ve antisiklin D1 antikoru ile boyandı ve 20X büyütmede görüntülendi. Siklin D1 eksprese eden hücreler, mavi doku arka planına karşı kırmızımsı kahverengi renkle gösterilir. Çeşitli farelerden alınan görüntüler arasındaki boyama yoğunlukları karşılaştırıldığında, büyütülmemiş dalaklar, fare genotipinden bağımsız olarak nispeten düşük miktarlarda Siklin D1 ekspresyonuna sahiptir. Buna karşılık, DTG faresinden genişlemiş dalak, bu fare modelinde kanser gelişimi ile Siklin D1 ekspresyonu arasında bir korelasyon olduğunu gösteren artan kırmızımsı-kahverengi lekelenme gösterir.