5.6: Antikor Üretimi: Hibridomlar Kullanılarak Monoklonal Antikorların Üretilmesi

Not: Hibridoma hücreleri ve besiyeri steril bir şekilde (örneğin bir biyogüvenlik kabininde) ele alırken, antikor saflaştırma adımlarına kadar steril hücre kültürü tekniği korunmalıdır.

1. Donmuş hibridoma hücrelerinin çözülmesi

1. Donmuş hibridoma hücrelerini içeren şişeyi 37 ° C'lik bir su banyosunda sadece çözülene kadar (yaklaşık 2 dakika) inkübe edin.
2. Çözülmüş hücreleri 10 mL tam RPMI içeren 15 mL'lik bir konik tüpe ekleyin (% 10 fetal sığır serumu, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 1mM sodyum piruvat, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 50 μM 2-Merkaptoetanol, 10 mM HEPES).
3. Kirletici donmuş ortamları yıkamak için 1200 RPM'de 5 dakika santrifüjleyin.
4. Santrifüjlemeden sonra, sıvı süpernatanı atın ve hücre peletini 5 mL taze tam RPM'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 15 mL tam RPMI içeren bir T75 doku kültürü şişesine ekleyin (RPMI'nin son hacmi 20 mL'dir).
5. Hücreleri standart bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO₂ ile büyütün. Hücreler kültürdeyken yapışık değildir.

2. Hibridoma genişlemesi

Antikorlar araştırma ve teşhis için güçlü bir araçtır, bu da onları büyük miktarlarda üretmenin genellikle gerekli olduğu anlamına gelir.

Antikor üretmenin ilk adımı, ilgilenilen antijeni bir konakçı hayvana enjekte etmektir. Antijen, konakçının B hücrelerini aktive eder ve daha sonra bu antijene özgü antikorlar üretir ve serbest bırakır. Daha sonra, ELISA veya başka bir tespit yöntemi kullanılarak, konakçı hayvanın antiserumlarının hedef antikorun varlığı açısından düzenli olarak taranması gerçekleştirilir. Tespit edildikten sonra, ev sahibi hayvanın B hücrelerini içeren dalağı çıkarılır. Dalaktaki tüm B hücreleri şimdi izole edilmişse, bu, ilgilenilen antijene karşı antikor salgılayan bir popülasyonu içermelidir. Bu popülasyonu poliklonal olarak adlandırıyoruz, çünkü her hücre muhtemelen antijenin farklı bir epitopuna bağlandı ve bu nedenle kendi bireysel ve benzersiz antikorunu üretti.

Monoklonal antikorlar üretmek için, belirli bir epitopu tanımak üzere yükseltilen antikorlar, istenen antikoru üreten bireysel B hücresi önce izole edilmeli ve kültürlenmelidir. Ne yazık ki, B hücreleri kültürde iyi hayatta kalamazlar. Bu engelin üstesinden gelmek için, bilim adamları B hücrelerini ölümsüz miyelom hücreleriyle birleştirerek hibridomlarla sonuçlanır. Bu hücreler daha sonra yalnızca hibridomların büyümesine ve antikorları serbest bırakmasına izin veren seçici bir ortamda büyütülür. Yine besiyeri, istenen antikor için ELISA gibi bir yöntem kullanılarak taranır. Tespit edildikten sonra, hibridomlar, ana kültürün seri bir seyreltilmesi olan sınırlayıcı seyreltme adı verilen bir işlemle klonlanır ve bu, tek hücrelerin bir tarama plakasının kuyucuklarına tohumlanmasına neden olmalıdır. Bu, tek bir ana hücreden hibridomların büyümesine izin verir ve yalnızca istenen antikoru serbest bırakan bir monoklonal hücre hattı verir. Bu monoklonal hatlar, büyük miktarlarda monoklonal antikor üretmek için doku kültürü şişelerinde genişletilebilir. Bundan sonra, hücreler ölmeye başladığında, antikorlar ortamdan amonyum sülfat ile çökeltilebilir. Normalde, çözeltide, antikorlar hidrofilik etkileşimler yoluyla su ile etkileşime girer. Bununla birlikte, amonyum ve sülfat, su moleküllerini antikorlardan ayıran, antikorların çözünürlüğünü azaltan ve çökelmelerine neden olan yüksek yüklü iyonlardır.

Başlamak için önce malzeme listesini kontrol edin ve protokol için tüm medyayı, malzemeleri ve çalışma yüzeylerini hazırlayın.

Ardından bir su banyosunu açın ve 37 santigrat dereceye ayarlayın. Daha sonra, 15 mililitrelik bir konik tüpe 10 mililitre tam RPMI ve bir T75 hücre kültürü şişesine 15 mililitre tam RPMI ekleyin ve bir kenara koyun. Dikkatli kullanarak ve uygun kişisel koruyucu ekipmanı giyerek, hibridoma hücreleri içeren donmuş şişeyi sıvı nitrojen deposundan çıkarın. Şişenin içindeki basıncı boşaltmak için kapağı hafifçe gevşetin. Şimdi, şişeyi su banyosunda dikkatlice inkübe edin ve kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için kapağın su yüzeyinin üzerinde kaldığından emin olun. Hücreler neredeyse çözüldüğünde, ki bu tipik olarak yaklaşık iki dakika sürer, şişeyi doku kültürü başlığına taşıyın.

Ardından, kapağı çıkarmadan önce şişenin dışını %70 etanol ile silin. Steril bir pipet kullanarak, hücreleri 10 mililitre tam RPMI ortamı içeren konik tüpe aktarın. Ardından, tüpü 1200 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, tüpü doku başlığına geri getirin ve tüpün dışını etanol ile silin. Peleti bozmadan, süpernatanı atın ve ardından beş mililitre taze tam RPMI ortamı ekleyin ve yeniden süspanse etmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, hücreleri T75 hücre kültürü şişesine aktarın ve şişeyi 37 santigrat derecede %5'lik bir karbondioksit inkübatörünün içine yerleştirin. Hücrelerin yaklaşık% 80 birleşmeye ulaşmasına izin verin, bu genellikle yaklaşık üç gün sürer. Hibridoma hücrelerinin yapışık olmadığına ve ortamda asılı olarak büyüyeceğine dikkat edin. Yeterli birleşmeye ulaşma süresi, canlı hücrelerin başlangıç sayısına ve kullanılan hibridoma hücresinin tipine bağlı olarak değişebilir.

Hücreler yeterince birleştiğinde, bunları kültür şişesinden konik bir santrifüj tüpüne aktarmak için steril 25 mililitrelik bir pipet kullanın. Hücreleri beş dakika boyunca 1200 RPM'de santrifüjleme ile peletleyin. Hücreler santrifüjdeyken, üç yeni T75 hücre kültürü şişesinin her birine 18 mililitre tam RPMI ekleyin ve bunları bir kenara koyun. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini altı mililitre tam RPMI'de yavaşça yeniden süspanse edin. Daha sonra, üç yeni hücre kültürü şişesinin her birine iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Son olarak, şişeleri %5 karbondioksit ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirin ve şişeler yaklaşık %80 birleşene kadar, yaklaşık üç gün kuluçkaya yatırın.

Bu noktada hücreler, HB101 takviyesi içeren ticari olarak temin edilebilen HB Bazal Sıvı ortam gibi hibridoma hücre hatları için tasarlanmış serumsuz ortamda büyümelerine devam etmeye hazırdır. Hücreleri her bir hücre kültürü şişesinden konik santrifüj tüplerine aktarın ve daha sonra hücreleri beş dakika boyunca 1200 RPM'de santrifüjleme ile peletleyin. Şimdi, altı adet 225 santimetre karelik hücre kültürü şişesinin her birine 230 mililitre takviye HB101 serumsuz ortam ekleyin ve bir kenara koyun. Santrifüjleme tamamlandığında, süpernatanı çıkarın ve her peleti 10 mililitre takviye edilmiş HB101 ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, her bir hücre kültürü şişesine, beş mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Şişeleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin ve hücreleri yaklaşık üç hafta boyunca büyütmeye devam edin. Bu süre zarfında, hücreler ilgilenilen monoklonal antikoru üretecek ve kültür ortamına bırakacak ve hücreler ölmeye başladığında antikor saflaştırma için hazır olacaktır.

Antikor içeren kültür ortamından hücresel kalıntıları çıkarmak için, kültür şişelerinin içeriğini sabit açılı bir rotor için tüplere dökün. Tüpleri rotora yerleştirin ve santrifüjlemeden önce uygun şekilde dengelendiğinden emin olun. Tüpleri sekiz dakika boyunca 10.000 RPM'de döndürün. Numuneler santrifüjlenirken, karıştırma çubuklu iki litrelik plastik bir kabı bir buz kovasına yerleştirin ve ardından buz kovasını bir karıştırma plakasına koyun.

Ardından, bir litrelik bir şişeye 500 mililitrelik bir filtre üst kısmı takın. Bu şişe üstü filtre ünitesini uygun boruyu kullanarak bir ev elektrikli süpürgesine takın. Ardından, antikoru içeren süpernatanı filtrenin üst kısmına dökün. Hücre kalıntılarını antikor içeren süpernatanttan ayırmak için kalan ortamı santrifüjleyin. Filtrenin üst kısmı süpernatan ile dolduğunda, vakumu başlatın. Ardından, bir litrelik toplama şişesi dolmaya yakın olduğunda, filtrenin üst kısmını çıkarın ve filtrelenmiş süpernatanı buz üzerindeki iki litrelik behere dökün. Süpernatantın tamamı işlenene kadar filtrasyon adımlarını tekrarlayın.

Numunenin tamamı işlendiğinde, bir litre filtrelenmiş süpernatan başına 295 gram amonyum sülfat tartın. Karıştırma plakasını başlatın ve önümüzdeki birkaç saat içinde amonyum sülfatı yavaşça süpernatana ekleyin. Bu, istenmeyen proteinlerin çökelmesine neden olabilecek lokalize yüksek konsantrasyonda amonyum sülfat tuzunu önler. Amonyum sülfatın tamamı eklendikten sonra, kabı folyo ile örtün ve karıştırma plakası ile birlikte dört santigrat derecede soğuk bir odaya taşıyın ve antikor çözeltisini gece boyunca karıştırmak için ayarlayın.

Ertesi sabah, amonyum sülfat içeren antikor çözeltisini iki litrelik beherden sabit açılı rotor için temiz tüplere dökün. Tüplerin dibindeki antikoru peletlemek için tüpleri 6500 RPM'de 20 dakika ara vermeden santrifüjleyin. Ardından, yumuşak peleti emmemeye dikkat ederek süpernatanı vakumla aspire edin. Amonyum sülfat içeren süpernatantın geri kalanından peletlenmiş antikoru toplamak için aynı tüp setini kullanmaya devam edin. Son aspirasyondan sonra, her bir antikor peletini yaklaşık bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın.

Amonyum sülfatı antikor çözeltisinden çıkarmak için, önce her mililitre antikor çözeltisi için yaklaşık bir inç diyaliz tüpü kesin. Ardından, boruyu damıtılmış suyla silin ve borunun bir ucuna bir düğüm atın. Düğümden sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için boruyu damıtılmış suyla doldurun. Birkaç dakika sonra sızıntı olmazsa, hortumdaki suyu boşaltın.

Ardından, antikor çözeltisini tüpe pipetleyin. Mümkün olduğu kadar çok antikoru geri kazanmak için, tüpleri ek 0.25 mililitre PBS ile durulayın ve bunu da tüpe aktarın. Tüpün üst kısmını bir diyaliz klipsi ile çözeltiye mümkün olduğunca yakın sabitleyin. Ardından, borunun üst kısmını, borunun doldurulmuş kısmı behere asılı olacak şekilde dört litrelik bir beherin dış üst kısmına bantlayın. Şimdi, kabı dört santigrat derece soğuk odaya götürün ve bir karıştırma plakasına yerleştirin. Beheri PBS ile üstüne kadar doldurun ve bir karıştırma çubuğu ekleyin. Tüpün ve çözeltinin gece boyunca yaklaşık sekiz saat karışmasına izin verin. Ertesi sabah, beherdeki PBS'yi taze PBS ile değiştirin ve ardından kabı yaklaşık sekiz saat tekrar karıştırmaya bırakın. O akşamın ilerleyen saatlerinde işlemi son bir kez tekrarlayın. Sabahları diyaliz tüpünü açın ve ardından antikor solüsyonunu tüpten 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Diyaliz sırasında oluşmuş olabilecek herhangi bir çökeltiyi çıkarmak için, tüpleri 1200 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Son olarak, süpernatanı taze tüplere aktarın.

Antikor konsantrasyonunu ölçmek için, önce bir antikor alikotundan 95 mikrolitre PBS'ye beş mikrolitre ekleyerek 20 kat seyreltme yapın. Ardından, seyreltilmiş antikoru bir küvete pipetleyin ve konsantrasyonu 280 nanometrede kaydetmek için bir spektrofotometre kullanın. Ardından, gösterilen formülü kullanarak antikor konsantrasyonunu hesaplayın. Son olarak, vidalı kapaklı şişeleri antikor adı, konsantrasyon, hazırlama tarihi ve varsa parti numarası ve deneyci adı ile etiketleyin ve ardından antikoru etiketli vidalı kapaklı şişelere ayırın. Bunlar ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir.

120G8 anti-fare CD317 veya PDCA-1 hibridoma hattı kullanılarak verilen örnek verimler, 44 ila 99.6 miligram arasında değişmektedir ve bu da tipik olarak ortalama 67.3 miligram miktar verir. Aynı hibridoma hücre hattı ile yapılan her bir üretim çalışmasının, sonunda mevcut olan monoklonal antikor miktarında biraz farklı olabileceğine dikkat etmek önemlidir.