5.7: İmmünofloresan Mikroskobu: Parafine Gömülü Doku Bölümlerinin İmmünofloresan Boyaması

1. Kurulum

1. Tipik boyama protokolü aşağıdaki adımları içerir:
   1. Bir dizi dereceli etanol kullanarak slaytlar üzerindeki doku bölümlerinin yeniden hidratlanması.
   2. Doku bölümlerinin, antikorun dokuya spesifik olmayan bağlanmasını engellemeye ve arka plan floresansını azaltmaya yardımcı olacak bir bloke edici tampon ile inkübe edilmesi.
   3. Bloke edici tamponun çıkarılması ve bölümün birincil antikorda inkübe edilmesi, bu sırada antikor peptit hedefine bağlanacaktır.
   4. Birincil antikorun çıkarılması ve bölümlerin yıkama tamponunda yoğun bir şekilde yıkanması.
   5. Primer antikor doğrudan bir florofor ile etiketlenmemişse ve ikincil bir antikor gerekiyorsa, primer antikora bağlanmaya izin vermek için bölümlerin ikincil antikor ile inkübe edilmesi.
   6. İkincil antikorun slaytlardan yıkanması.
   7. Slaytları montaj ortamına monte etmek ve floresan mikroskopta görselleştirmeden önce kurumaya izin vermek.
2. Aşağıdaki öğeler gereklidir: sürgülü tutucular (cam veya plastik), kavanozlar, pipetler, pap kalem, nemli hazne, lameller ve DAPI'li montaj ortamı.
3. Ksilen, slaytların rehidrasyonu için kullanılır. Ksilen tehlikelidir ve eldiven ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere uygun KKD ile birlikte çeker ocakta kullanılmalıdır.
4. Tamponlar, çözeltiler ve reaktifler için tarifler
   1. Dereceli etanoller
      Etanol - 160 mL 200 geçirmez EtOH ve 40 mL ddH₂O
      Etanol - 140 mL 200 geçirmez EtOH ve 60 mL ddH₂O
   2. Antijen geri alma solüsyonu
      10 mM sodyum sitrat, pH 6.0
   3. Engelleme arabelleği
      İkincil antikorun yapıldığı konakçı hayvandan 100 μL serum
      900 μL 1X PBS
      Not: Bu, 10 bölümlük cilttir; Gerektiği gibi, bölüm başına yaklaşık 100 μL tampon için hacmi ayarlayın.
   4. Yıkama tamponu (1X PBS)

2. Protokol

1. Ksilenler ve etanoller ile rehidrasyon
   1. Slaytları bir slayt tutucuya yerleştirin ve ardından slaytları %100 Ksilen izomerleri çözeltisine batırın ve slaytların tamamen çözelti ile kaplandığından emin olun.
   2. Slaytları %100 Ksilen izomerlerinde 3 dakika inkübe edin. Toplam 3 ayrı inkübasyon için iki kez tekrarlayın. Kirlenmeyi en aza indirmek için yeni bir çözeltiye aktarmadan önce sürgülü rafı bir kağıt havluyla sildiğinizden emin olun.
      Not: Bu inkübasyonların üç ayrı kapta yapılması tavsiye edilir.
   3. Slaytları 2 dakika% 100 EtOH'de inkübe edin. Toplam 3 ayrı inkübasyon için iki kez tekrarlayın.
      Not: Bu inkübasyonların üç ayrı kapta yapılması tavsiye edilir.
   4. Slaytları %95 EtOH'de 2 dakika inkübe edin.
   5. Slaytları %80 EtOH'de 2 dakika inkübe edin.
   6. Slaytları %70 EtOH'de 2 dakika inkübe edin.
   7. Slaytları 1X PBS'de 5 dakika inkübe edin.
2. (İsteğe bağlı) Primer antikor tarafından tanınan epitopları maskelemek için antijen alımı
   Not 1: Bu prosedür büyük ölçüde kullanılan antikora bağlıdır ve antijen alımı gereksinimini belirlemek için ilk optimizasyon prosedürlerinin gerçekleştirilmesi önerilir.
   Not 2: Bu işlem aşağıda gösterilen F4/80 boyama ile gerçekleştirilmemiştir. Antijen alımı gereksinimi her yeni antikorla optimize edilmelidir.
   1. Slaytları ısıya dayanıklı plastik veya cam sürgülü tutucuya yerleştirin ve eşit ısı dağılımı sağlamak için rafın slaytlarla doldurulduğundan emin olun. Raftaki yuvalardan daha az numune varsa boş slaytlar kullanılabilir.
   2. Rafı 2 litrelik beherde 1000 mL antijen maskeleme solüsyonuna yerleştirin - 10 mL antijen maskeleme stoğuna 990 mL suya.
   3. Mikrodalgada toplam 20 dakika yüksekte, slaytların suyla kaplı kaldığından emin olun.
   4. Slaytları beherde 20 dakika soğutun.
   5. ddH₂O içeren sürgülü tutucularda her biri 5 dakika boyunca sürgülü rafı yıkayın. Her seferinde taze ddH₂O kullanarak toplam 3 ayrı inkübasyon için iki kez tekrarlayın. Slaytlar her yıkama sırasında aynı sürgü tutucuda yıkanabilir.
   6. Slaytları 1X PBS'de 5 dakika inkübe edin.
3. Bölümleri pap kalemle daire içine alın. Bu, doku bölümlerini kaplamak için gereken minimum hacimde tamponların kullanılmasına izin verecektir. Doku bölümlerinin kurumasına izin vermeyin.
4. Her bölüme engelleme arabelleği ekleyin. Kesiti kaplamak için gereken tampon miktarı, kesitin boyutuna bağlı olarak değişecektir, ancak 25-500 μL arasında değişebilir. Kenarlar da dahil olmak üzere tüm kesit yüzeyini kaplayan bir boncuk oluşturmak için yeterli tampon kullanılmalıdır.
   Not: Bloke edici tampon seçimi, kullanılan antikora bağlı olarak değişebilir. Örneğin, ikincil antikorun yükseltildiği konakçı hayvandan% 10 serum, ikincil antikorun spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için kullanılabilir (örneğin, ikincil antikor keçide yükseltildiyse normal keçi serumu kullanılabilir). Her primer antikor için bloke edici tamponun optimizasyonu yapılmalıdır. Meme tümörü kesitlerini F4/80 ile boyamak için PBS'de 0.1 ml %10 normal keçi serumu kullanıldı.
5. Bölümleri nemlendirilmiş bir odada nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1 saat veya 4 ° C'de 24 saate kadar inkübe edin. Nemlendirilmiş oda, bölümlerin kurumamasını sağlar.
6. Sürgüden boşaltarak engelleme arabelleğini çıkarın. Alternatif olarak, engelleme tamponu bir pipet kullanılarak çıkarılabilir, ancak pipet ucuyla bölüme dokunmamaya dikkat edin.
7. Birincil antikoru bloke edici tamponda seyreltin.
   Not: Her antikor ve numune tipi için doğru seyreltmenin belirlenmesi gerekecektir. Optimizasyon, optimal boyamayı belirlemek için bir dizi seyreltme gerçekleştirmeyi içerecektir. Meme tümörü kesitlerini F4/80 ile boyamak için, doku kesitleri PBS'de% 1 normal keçi serumunda 1:100 oranında seyreltilmiş 0.1 mL sıçan anti-F4 / 80 antikoru içinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edildi.
8. Birincil antikoru her bölüme ekleyin ve nemlendirilmiş bir odada 4 ° C'de 16 saate kadar (gece boyunca) inkübe edin. İkincil antikor tarafından spesifik olmayan bağlanmayı tanımlamaya yardımcı olacak bir kontrol görevi görmesi için birincil antikor olmadan bloke edici tamponda en az bir bölüm bırakın.
9. Birincil antikoru veya bloke edici tamponu bölümden boşaltın ve slaytları sürgülü rafa yerleştirerek ve 1x PBS'li bir sürgülü tutucuya yerleştirerek bölümleri PBS ile yıkayın. Her seferinde 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
10. İkincil antikoru bloke edici tamponda 1:200 oranında seyreltin. Seyreltme, ikincil antikora bağlı olarak optimize edilebilir.
11. İkincil antikoru kontrol de dahil olmak üzere tüm bölümlere ekleyin ve ışıktan korunan nemlendirilmiş bir odada 1 saat inkübe edin.
12. İkincil antikoru bölümlerden boşaltın ve her seferinde 10 dakika boyunca PBS'de 3 kez yıkayın.
13. Slaytlara 2-3 damla DAPI içeren montaj ortamı ekleyin ve numunelerin üzerine bir lamel yerleştirin. Montaj ortamı hızlı kuruyan bir ortam türü değilse, sızıntıyı önlemek ve numuneleri uzun süreli tutmak için sürgünün kenarlarını erimiş parafin mumu veya tırnak cilası ile kapatmak gerekebilir.
14. Slaytların gece boyunca karanlıkta kurumasını bekleyin ve bölümleri bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin.

3. Veri Analizi ve Sonuçlar

1. Lekeli bölümler bir floresan mikroskobu kullanılarak analiz edilir. Görüntü yakalama ve analizinin belirli ayrıntıları, mikroskobun özelliklerine ve analizi gerçekleştirmek için kullanılan yazılıma bağlı olacaktır. Tipik olarak, görüntüler tek renkli görüntüler olarak alınabilir ve çok renkli görüntüler oluşturmak için üst üste bindirilebilir. Pozitif hücrelerin yüzdesi, pozitif lekeli hücrelerin sayısını sayarak ve bir bölümdeki DAPI ile boyanmış hücrelerin toplam sayısına bölünerek ölçülebilir. Meme tümörü bölümlerinin F4/80 boyanması için, Leica Application Suite, sürüm 3.8 yazılımı kullanılarak, Al sekmesi altında ve Image Overlay edinme modunda, DAPI ve RFP'nin her ikisi de etkinleştirildi. Maruz Kalma, Kazanç ve Gama ayarlandı (DAPI için sırasıyla 20.0 ms, 1.0x ve 1.53 ve RFP için sırasıyla 944.2 ms, 1.0x ve 1.08), ancak bu deneyler arasında değişir. Yer Paylaşımı Al düğmesi, DAPI ve RFP pozlamalarının bindirme görüntülerini oluşturmak için kullanıldı.
2. Aşağıdaki resim (Şekil 1), makrofajlar ve diğer miyeloid hücreler üzerinde bir antijen tespit eden F4/80 ile boyanmış bir tümör bölümünün örnek bir immünofloresan görüntüsünü göstermektedir. Bölüm, DAPI içeren montaj ortamı kullanılarak monte edildi ve çekirdekler mavi renkle gösterildi.

Bir proteinin bir hücredeki işlevi, büyük ölçüde hücre içindeki uygun lokalizasyonuna bağlıdır. İmmünofloresan mikroskobu, floresan boyalar kullanılarak hücrelerin içinde bir proteinin görüntülenebildiği bir yöntemdir. Floresan boya, uyarma adı verilen bir işlemle belirli bir dalga boyundaki ışık enerjisini emen ve ardından enerjiyi emisyon olarak bilinen farklı bir dalga boyunda hemen serbest bırakan bir molekül olan bir florofordur.

Floresan boyalar, hedefe özgü bir antikora konjuge edilir ve immün boyama yoluyla kültürlenmiş hücrelere veya dokuya verilir. Bu birincil antikor, ilgilenilen proteine bağlandığında, protein floresan boya ile etiketlenir. Alternatif olarak, floresan boya, birincil antikor yerine ikincil bir antikora konjuge edilebilir ve ikincil antikor, hedefi etiketlemek için protein birincil antikor kompleksine bağlanır. Bundan sonra, numune, floresan etiketlemesini korumak için bir antifade montaj ortamında kapatılır ve daha sonra bir floresan mikroskobunda görüntülemeye hazır hale gelir.

Bir floresan mikroskobu güçlü bir ışık kaynağı ile donatılmıştır. Işık huzmesi önce bir uyarma filtresinden geçer, bu da yalnızca uyarma dalga boyundaki ışığın geçmesine izin verir. Uyarma ışığı daha sonra, uyarma dalga boyunu objektif bir merceğe seçici olarak yansıtmak için tasarlanmış, dikroik ayna veya ışın ayırıcı adı verilen özel bir aynaya ulaşır. Lens daha sonra ışığı numunedeki küçük bir bölgeye odaklar. Numuneye ulaştıktan sonra ışık, floroforları uyarır ve daha sonra ışık enerjisini farklı bir dalga boyunda yayar. Bu ışık, objektif mercek aracılığıyla dikroik aynaya geri iletilir. Emisyon dalga boyu, uyarma dalga boyundan farklı olduğundan, dikroik ayna emisyon ışığının geçmesine izin verir. Daha sonra, mevcut olabilecek diğer dalga boylarından gelen ışığı ortadan kaldıran emisyon filtresi adı verilen ikinci bir filtreden geçer. Bundan sonra, ışık ışınları artık göz merceğine veya kameraya ulaşır ve burada belirli floroforlardan yayılan ışıktan oluşturulan büyütülmüş bir görüntü sunarlar. Bu görüntü, ilgilenilen proteinin hücre içindeki yerini temsil eder.

DNA bağlayıcı floresan boyalar, çekirdekleri hücreler içinde bir referans noktası olarak etiketlemek için genellikle immünoboyama ile birlikte kullanılır. Proteinlerin lokalizasyonunu karşılaştırmak için aynı numune içindeki farklı proteinler için farklı uyarma emisyon dalga boylarına sahip çok sayıda farklı florofor kullanılabilir.

Bu video, bir doku örneğinde ilgilenilen bir proteinin immünofloresan boyama prosedürünü ve ardından örneğin bir floresan mikroskobunda görüntülenmesini göstermektedir.

Boyama işlemine başlamadan önce, gömme işlemi sırasında susuz kalan bölümlerin yeniden sulandırılması gerekir. Bunu yapmak için önce slaytları bir slayt tutucuya yerleştirin ve ardından slaytları tamamen %100 Xlene izomerlerine batırın. Slaytların üç dakika inkübe etmesine izin verin. Ardından, slaytları kaptan çıkarın, fazla Ksilen'i bir kağıt havluyla silin ve üç dakika daha taze bir kapta yeni bir Ksilen banyosuna koyun. Bu inkübasyonu her seferinde taze Ksilen içeren yeni bir kapta tekrarlayın ve yeni kaba aktarmadan önce slaytları kağıt havluyla silerek toplam üç inkübasyon için tekrarlayın. Daha sonra, bölümleri iki dakika boyunca% 100 etanol ile başlayarak bir dizi kademeli etanol çözeltisinde inkübe edin. Sürgü rafını bir kağıt havluyla silin ve slaytları iki dakika daha %100 etanol içeren yeni bir kaba aktarın. Belirtilen süre boyunca belirtilen etanol konsantrasyonlarını takip ederek yıkama döngüsüne devam edin, fazla etanolü bir kağıt havluyla silin ve slaytları yeni bir banyoya aktarın. Son etanol yıkamasından sonra, fazla çözeltiyi silkeleyin ve slaytları 1X PBS'de beş dakika inkübe edin.

Boyama işlemine başlamak için, önce tamponların kaplaması gereken minimum alanı belirlemek için bölümleri bir PAP kalemiyle daire içine alın. Bölümler slayt üzerinde net bir şekilde işaretlendikten sonra, tüm bölüm yüzeyini kapladığınızdan emin olarak her slayta 100 mikrolitre engelleme tamponu ekleyin. Dokular bloke edici tamponla kaplandıktan sonra, slaytları nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. Slaytları oda sıcaklığında bir saat inkübe etmeye bırakın.

İstenen inkübasyon süresinin ardından, blokaj tamponunu slayttan boşaltarak çıkarın. Daha sonra, birincil antikoru bloke edici tamponda seyreltin. 1:100 seyreltme için, 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 990 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin, ardından aynı tüpe 10 mikrolitre birincil antikor ekleyin. Bir slaydı kontrol olarak etiketleyin ve ardından 100 mikrolitre engelleme arabelleği ekleyin. Bu kontrol, ikincil antikorun herhangi bir spesifik olmayan bağlanmasını tanımlamaya yardımcı olacaktır. Şimdi, kalan slaytlara 100 mikrolitre primer antikor tamponu ekleyin. Bölümleri gece boyunca karanlıkta dört santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.

Gece boyunca inkübasyonun ardından, bölümleri odadan çıkarın ve her slayttan birincil antikoru ve bloke edici tamponu kontrolden boşaltın. Slaytları bir sürgülü rafa yerleştirin ve ardından her biri on dakika boyunca 1X PBS'de üç kez yıkayın. Slaytlar 1X PBS'de yıkanırken, ikincil antikoru bloke edici tamponda seyreltin. 1:200 seyreltme için, 1.5 mililitrelik bir tüpe 995 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin, ardından aynı tüpe beş mikrolitre ikincil antikor ekleyin. İkincil antikoru, kontrol de dahil olmak üzere tüm bölümlere ekleyin ve ışıktan korunan nemlendirilmiş bir odada bir saat boyunca inkübe edin. Zamanlayıcı çaldığında, slaytları inkübatörden çıkarın. İkincil antikoru bölümlerden boşaltın. İkincil antikor çıkarıldıktan sonra, slaytları bir slayt rafına yerleştirin ve ardından slaytları ışıktan koruyarak 10 dakika boyunca 1X PBS'ye tamamen daldırın. Her yıkama için taze 1X PBS kullanarak bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. Yıkamaları takiben, her slayta iki ila üç damla DAPI içeren montaj ortamı ekleyin ve numunelerin üzerine bir cam lamel yerleştirin. Floresan dürbün kullanarak bölümleri görüntülemeden önce slaytların gece boyunca karanlık bir yerde kurumasını bekleyin.

Görüntüleme sırasında, görüntü yakalamanın ayrıntıları, mevcut özel mikroskop ve yazılıma bağlı olacaktır. Ancak, bu özel örnekte, yazılım Leica Application Suite, Sürüm 3. 8, analizi gerçekleştirmek için kullanılır. Bu programı kullanarak, Al sekmesine tıklayın ve Image Overlay Acquisition modunda hem DAPI'yi hem de RFP'yi etkinleştirin. Ardından, yazılım tarafından tanımlanan varsayılan ayarları kullanarak bir başlangıç yaparak ve ardından pozlama süresini ve kazancı değiştirerek parlaklığı optimize ederek hem DAPI hem de RFP için Pozlama, Kazanç ve Gama'yı ayarlayın, görüntü doygunluğunu ve örneklerin foto ağartılmasını önlemek için minimum optimum ayarların arzu edildiğini unutmayın. Gama, bir görüntünün daha koyu alanlarını optimize etmek için değiştirilebilir.

Ayarlar yapıldıktan sonra, DAPI ve RFP pozlarının bindirme görüntülerini oluşturmak için Yer Paylaşımı Al düğmesine basın. Gösterilen teknik kullanılarak yakalanan bu örnek görüntü, makrofajlar ve diğer miyeloid hücreler üzerinde kırmızı ile gösterilen bir antijeni tespit eden F4/80 antikoru ile boyanmış bir fare meme tümörü bölümünü göstermektedir. DAPI içeren montaj ortamı kullanıldığından, çekirdekler mavi renkle gösterilir. Görüntülemeden elde edilen veriler, doku bölümü içindeki proteinin yoğunluğu ve lokalizasyonu hakkında bilgi sağlayacaktır.

Örneğin, F4/80 ile boyanmış tümör görüntüsünde, bu antijenin hücre yüzeyinde boyanması gözlenir. Bu veriler ayrıca doku bölümündeki belirli hücre popülasyonlarının sıklığı hakkında bilgi sağlayabilir. Bu, burada kırmızı ile gösterilen pozitif lekeli hücrelerin sayısını sayarak ve bunu mavi ile gösterilen toplam hücre popülasyonu ile karşılaştırarak ve aşağıdaki denklemi kullanarak frekansı hesaplayarak ölçülebilir.