What is a fluorophore and how does it work in immunofluorescence microscopy?

A fluorophore is a molecule that absorbs light energy at a specific wavelength through excitation, then immediately releases the energy at a different wavelength through emission. Fluorophores are conjugated to antibodies and introduced into tissue samples through immunostaining. When the antibody binds to the target protein, the fluorophore labels it, allowing visualization under a fluorescence microscope.

How does a fluorescence microscope separate excitation and emission light?

A fluorescence microscope uses specialized optical components to separate wavelengths. Excitation light passes through an excitation filter, then reflects off a dichroic mirror toward the objective lens, which focuses it on the sample. Emitted light from excited fluorophores returns through the objective and dichroic mirror, which allows only emission wavelengths to pass. An emission filter removes unwanted wavelengths before the image reaches the eyepiece or camera.

Why is rehydration necessary before immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue?

Tissue sections are dehydrated during the paraffin embedding process. Before staining, sections must be rehydrated through graded ethanol incubations and PBS washes to restore tissue hydration and prepare it for antibody binding. This step ensures proper antibody penetration and reduces non-specific binding during the immunostaining procedure.

What is the purpose of a blocking buffer in immunofluorescence staining?

Blocking buffer reduces non-specific binding of antibodies to the tissue section. The tissue is incubated with blocking buffer for one hour at room temperature before primary antibody application. This step prevents the antibody from binding to sites other than the target protein, improving staining specificity and reducing background fluorescence in the final image.

Why is a control slide included in immunofluorescence staining procedures?

A control slide is treated identically to experimental slides but receives only blocking buffer instead of primary antibody. This control helps identify any non-specific binding of the secondary antibody to the tissue. By comparing the control to experimental slides, researchers can distinguish true target protein localization from background fluorescence caused by non-specific antibody interactions.

How can multiple proteins be visualized simultaneously in a single tissue sample?

Multiple different fluorophores with distinct excitation and emission wavelengths can be used to label different proteins within the same sample. DNA binding fluorescent dyes like DAPI label nuclei as a reference point. By using multiple fluorophores, researchers can compare the localization of different proteins and analyze their spatial relationships within the tissue section.

What information can immunofluorescence imaging provide about tissue samples?

Immunofluorescence imaging provides data on protein intensity and localization within tissue sections, revealing cell type heterogeneity, activation of signaling pathways, and biomarker expression. Researchers can quantify the frequency of specific cell populations by counting positively stained cells and comparing them to the total cell population, calculated using a simple ratio equation.

İmmünofloresan Mikroskobu: Parafine Gömülü Doku Bölümlerinin İmmünofloresan Boyaması

0 views09:56 min

1. Kurulum

Tipik boyama protokolü aşağıdaki adımları içerir:
1. Bir dizi dereceli etanol kullanarak slaytlar üzerindeki doku bölümlerinin yeniden hidratlanması.
2. Doku bölümlerinin, antikorun dokuya spesifik olmayan bağlanmasını engellemeye ve arka plan floresansını azaltmaya yardımcı olacak bir bloke edici tampon ile inkübe edilmesi.
3. Bloke edici tamponun çıkarılması ve bölümün birincil antikorda inkübe edilmesi, bu sırada antikor peptit hedefine bağlanacaktır.
4. Birincil antikorun çıkarılması ve bölümlerin yıkama tamponunda yoğun bir şekilde yıkanması.
5. Primer antikor doğrudan bir florofor ile etiketlenmemişse ve ikincil bir antikor gerekiyorsa, primer antikora bağlanmaya izin vermek için bölümlerin ikincil antikor ile inkübe edilmesi.
6. İkincil antikorun slaytlardan yıkanması.
7. Slaytları montaj ortamına monte etmek ve floresan mikroskopta görselleştirmeden önce kurumaya izin vermek.
Aşağıdaki öğeler gereklidir: sürgülü tutucular (cam veya plastik), kavanozlar, pipetler, pap kalem, nemli hazne, lameller ve DAPI'li montaj ortamı.
Ksilen, slaytların rehidrasyonu için kullanılır. Ksilen tehlikelidir ve eldiven ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere uygun KKD ile birlikte çeker ocakta kullanılmalıdır.
Tamponlar, çözeltiler ve reaktifler için tarifler
1. Dereceli etanoller
  Etanol - 160 mL 200 geçirmez EtOH ve 40 mL ddH₂O
  Etanol - 140 mL 200 geçirmez EtOH ve 60 mL ddH₂O
2. Antijen geri alma solüsyonu
  10 mM sodyum sitrat, pH 6.0
3. Engelleme arabelleği
  İkincil antikorun yapıldığı konakçı hayvandan 100 μL serum
  900 μL 1X PBS
  Not: Bu, 10 bölümlük cilttir; Gerektiği gibi, bölüm başına yaklaşık 100 μL tampon için hacmi ayarlayın.
4. Yıkama tamponu (1X PBS)

2. Protokol

Ksilenler ve etanoller ile rehidrasyon
1. Slaytları bir slayt tutucuya yerleştirin ve ardından slaytları %100 Ksilen izomerleri çözeltisine batırın ve slaytların tamamen çözelti ile kaplandığından emin olun.
2. Slaytları %100 Ksilen izomerlerinde 3 dakika inkübe edin. Toplam 3 ayrı inkübasyon için iki kez tekrarlayın. Kirlenmeyi en aza indirmek için yeni bir çözeltiye aktarmadan önce sürgülü rafı bir kağıt havluyla sildiğinizden emin olun.
  Not: Bu inkübasyonların üç ayrı kapta yapılması tavsiye edilir.
3. Slaytları 2 dakika% 100 EtOH'de inkübe edin. Toplam 3 ayrı inkübasyon için iki kez tekrarlayın.
  Not: Bu inkübasyonların üç ayrı kapta yapılması tavsiye edilir.
4. Slaytları %95 EtOH'de 2 dakika inkübe edin.
5. Slaytları %80 EtOH'de 2 dakika inkübe edin.
6. Slaytları %70 EtOH'de 2 dakika inkübe edin.
7. Slaytları 1X PBS'de 5 dakika inkübe edin.
(İsteğe bağlı) Primer antikor tarafından tanınan epitopları maskelemek için antijen alımı
Not 1: Bu prosedür büyük ölçüde kullanılan antikora bağlıdır ve antijen alımı gereksinimini belirlemek için ilk optimizasyon prosedürlerinin gerçekleştirilmesi önerilir.
Not 2: Bu işlem aşağıda gösterilen F4/80 boyama ile gerçekleştirilmemiştir. Antijen alımı gereksinimi her yeni antikorla optimize edilmelidir.
1. Slaytları ısıya dayanıklı plastik veya cam sürgülü tutucuya yerleştirin ve eşit ısı dağılımı sağlamak için rafın slaytlarla doldurulduğundan emin olun. Raftaki yuvalardan daha az numune varsa boş slaytlar kullanılabilir.
2. Rafı 2 litrelik beherde 1000 mL antijen maskeleme solüsyonuna yerleştirin - 10 mL antijen maskeleme stoğuna 990 mL suya.
3. Mikrodalgada toplam 20 dakika yüksekte, slaytların suyla kaplı kaldığından emin olun.
4. Slaytları beherde 20 dakika soğutun.
5. ddH₂O içeren sürgülü tutucularda her biri 5 dakika boyunca sürgülü rafı yıkayın. Her seferinde taze ddH₂O kullanarak toplam 3 ayrı inkübasyon için iki kez tekrarlayın. Slaytlar her yıkama sırasında aynı sürgü tutucuda yıkanabilir.
6. Slaytları 1X PBS'de 5 dakika inkübe edin.
Bölümleri pap kalemle daire içine alın. Bu, doku bölümlerini kaplamak için gereken minimum hacimde tamponların kullanılmasına izin verecektir. Doku bölümlerinin kurumasına izin vermeyin.
Her bölüme engelleme arabelleği ekleyin. Kesiti kaplamak için gereken tampon miktarı, kesitin boyutuna bağlı olarak değişecektir, ancak 25-500 μL arasında değişebilir. Kenarlar da dahil olmak üzere tüm kesit yüzeyini kaplayan bir boncuk oluşturmak için yeterli tampon kullanılmalıdır.
Not: Bloke edici tampon seçimi, kullanılan antikora bağlı olarak değişebilir. Örneğin, ikincil antikorun yükseltildiği konakçı hayvandan% 10 serum, ikincil antikorun spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için kullanılabilir (örneğin, ikincil antikor keçide yükseltildiyse normal keçi serumu kullanılabilir). Her primer antikor için bloke edici tamponun optimizasyonu yapılmalıdır. Meme tümörü kesitlerini F4/80 ile boyamak için PBS'de 0.1 ml %10 normal keçi serumu kullanıldı.
Bölümleri nemlendirilmiş bir odada nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1 saat veya 4 ° C'de 24 saate kadar inkübe edin. Nemlendirilmiş oda, bölümlerin kurumamasını sağlar.
Sürgüden boşaltarak engelleme arabelleğini çıkarın. Alternatif olarak, engelleme tamponu bir pipet kullanılarak çıkarılabilir, ancak pipet ucuyla bölüme dokunmamaya dikkat edin.
Birincil antikoru bloke edici tamponda seyreltin.
Not: Her antikor ve numune tipi için doğru seyreltmenin belirlenmesi gerekecektir. Optimizasyon, optimal boyamayı belirlemek için bir dizi seyreltme gerçekleştirmeyi içerecektir. Meme tümörü kesitlerini F4/80 ile boyamak için, doku kesitleri PBS'de% 1 normal keçi serumunda 1:100 oranında seyreltilmiş 0.1 mL sıçan anti-F4 / 80 antikoru içinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edildi.
Birincil antikoru her bölüme ekleyin ve nemlendirilmiş bir odada 4 ° C'de 16 saate kadar (gece boyunca) inkübe edin. İkincil antikor tarafından spesifik olmayan bağlanmayı tanımlamaya yardımcı olacak bir kontrol görevi görmesi için birincil antikor olmadan bloke edici tamponda en az bir bölüm bırakın.
Birincil antikoru veya bloke edici tamponu bölümden boşaltın ve slaytları sürgülü rafa yerleştirerek ve 1x PBS'li bir sürgülü tutucuya yerleştirerek bölümleri PBS ile yıkayın. Her seferinde 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
İkincil antikoru bloke edici tamponda 1:200 oranında seyreltin. Seyreltme, ikincil antikora bağlı olarak optimize edilebilir.
İkincil antikoru kontrol de dahil olmak üzere tüm bölümlere ekleyin ve ışıktan korunan nemlendirilmiş bir odada 1 saat inkübe edin.
İkincil antikoru bölümlerden boşaltın ve her seferinde 10 dakika boyunca PBS'de 3 kez yıkayın.
Slaytlara 2-3 damla DAPI içeren montaj ortamı ekleyin ve numunelerin üzerine bir lamel yerleştirin. Montaj ortamı hızlı kuruyan bir ortam türü değilse, sızıntıyı önlemek ve numuneleri uzun süreli tutmak için sürgünün kenarlarını erimiş parafin mumu veya tırnak cilası ile kapatmak gerekebilir.
Slaytların gece boyunca karanlıkta kurumasını bekleyin ve bölümleri bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin.

3. Veri Analizi ve Sonuçlar

Lekeli bölümler bir floresan mikroskobu kullanılarak analiz edilir. Görüntü yakalama ve analizinin belirli ayrıntıları, mikroskobun özelliklerine ve analizi gerçekleştirmek için kullanılan yazılıma bağlı olacaktır. Tipik olarak, görüntüler tek renkli görüntüler olarak alınabilir ve çok renkli görüntüler oluşturmak için üst üste bindirilebilir. Pozitif hücrelerin yüzdesi, pozitif lekeli hücrelerin sayısını sayarak ve bir bölümdeki DAPI ile boyanmış hücrelerin toplam sayısına bölünerek ölçülebilir. Meme tümörü bölümlerinin F4/80 boyanması için, Leica Application Suite, sürüm 3.8 yazılımı kullanılarak, Al sekmesi altında ve Image Overlay edinme modunda, DAPI ve RFP'nin her ikisi de etkinleştirildi. Maruz Kalma, Kazanç ve Gama ayarlandı (DAPI için sırasıyla 20.0 ms, 1.0x ve 1.53 ve RFP için sırasıyla 944.2 ms, 1.0x ve 1.08), ancak bu deneyler arasında değişir. Yer Paylaşımı Al düğmesi, DAPI ve RFP pozlamalarının bindirme görüntülerini oluşturmak için kullanıldı.
Aşağıdaki resim (Şekil 1), makrofajlar ve diğer miyeloid hücreler üzerinde bir antijen tespit eden F4/80 ile boyanmış bir tümör bölümünün örnek bir immünofloresan görüntüsünü göstermektedir. Bölüm, DAPI içeren montaj ortamı kullanılarak monte edildi ve çekirdekler mavi renkle gösterildi.

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4 ve Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
¹ Minnesota Üniversitesi, Laboratuvar Tıbbı ve Patolojisi Anabilim Da…