Hücre Döngüsü Analizi: CFSE Boyama ve Akış Sitometrisi Kullanılarak Stimülasyon Sonrası CD4 ve CD8 T Hücre Proliferasyonunun Değerlendirilmesi

1. Hazırlık

1. Başlamadan önce laboratuvar eldivenleri ve uygun koruyucu giysiler giyin.
2. Tüm diseksiyon aletlerini önce bir deterjanla ve ardından p etanol ile sterilize edin ve ardından iyice kurulayın.
3. % 2 fetal buzağı serumu (FCS) içeren 50 mL Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlayın.

2. Diseksiyon

1. Bir karbondioksit dağıtım sistemi kullanarak, fareyi hipoksi ile ötenazi yapın. Ötenazi fareyi sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon plakasına sabitleyin ve makas ve forseps kullanarak uzunlamasına laparotomi yapın.
2. Forseps kullanarak, mide ve dalağı ortaya çıkarmak için bağırsakları ve mideyi karnın sağ tarafında hareket ettirin. Dalak mideye yapışıktır.
3. Forseps kullanarak, dalağı mideden dikkatlice ayırın ve 5 mL HBSS% 2 FCS içeren Petri kabına yerleştirin.

3. Bağışıklık Hücresi İzolasyonu

1. Dalağı aynı Petri kabının üzerine 40 μm'lik bir hücre süzgecine yerleştirin. Dalağı ayırmak için bir pistonla ezin.
2. Ayrışmış dalağı ve sıvıyı 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
3. Tüpü 370 x g'da 10 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin ve peletten kaçınarak süpernatanı atın.
4. Eritrositleri parçalamak için peleti 2 mL potasyum asetat içinde yeniden süspanse edin. 2 dakika bekleyin ve ardından HBSS %2 FCS kullanarak sesi 15 mL'ye kadar yükseltin.
5. Tüpü 10 ° C'de 7 dakika boyunca 370 x g'da tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 5 mL HBSS% 2 FCS içinde yeniden süspanse edin.
6. Bir tripan mavisi boyama testi kullanarak hücreleri sayın ve uygun bir hacimde HBSS% 2 FCS kullanarak nihai hücre konsantrasyonunu 10⁷ hücre / mL'ye ayarlayın.

4. CFSE Boyama ve T Hücresi Stimülasyonu

1. 10⁷ izole dalak hücresi / tüpünü 4 tüpe dağıtın (15 mL tüpler, 1 ila 4 arasında etiketlenmiş)
2. Her tüpe 3 mL HBSS %2 FCS ekleyin.
3. Her tüpe 1 μL CSFE ekleyin (son konsantrasyon - 5 μM).
4. Tüpleri 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde 10 dakika inkübe edin.
5. Tüp 3 ve 4'te, 2.5 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda 12 mL HBSS% 2 FCS + anti-CD3 antikoru ekleyin. Tüp 3 ve 4, hücre döngüsü üzerindeki etkiyi gözlemlemek için anti-CD3 antikoru kullanılarak uyarılır.
6. Tüp 1 ve 2'ye 12 mL HBSS% 2 FCS ekleyin. Tüp 1 ve 2'deki hücreler uyarılmayacaktır.
7. Tüm tüpleri 370 x g'da 10 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları atın.
8. Peletleri 2 mL HBSS %2 FCS'de yeniden süspanse edin.
9. Elde edilen çözeltileri 6 oyuklu bir plaka üzerinde ayrı kuyucuklara aktarın.
10. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 3 gün boyunca inkübe edin.

5. Hücre Boyama

1. 3. günde, kuyu 1 ve 3'e 2 mL HBSS% 2 FCS ekleyin.
2. Kuvvetlice pipetleyin ve numuneleri 5 mL FACS tüplerine aktarın.
3. Kalan hücreleri 2-4 numaralı kuyulardan 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe etmeye devam edin. Stimülasyonun hücre döngüsü üzerindeki uzun vadeli etkilerini araştırmak için 5. günde analiz edilecekler.
4. Tüpleri 370 x g'da 10 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları atın.
5. Her tüpe 100 μL antikor karışımı ekleyin (bakınız Tablo 1).

) ) Serisi Serisi Serisi

antikor	Florokrom	Seyreltme
CD3 (İngilizce	Pasifik Mavisi	1/100
CD4 (İngilizce	BV786	1/1600
CD8	Pe	1/400
thy1.2	BV605	1/400

Tablo 1: Antikor karışımı bileşimi. Konsantre antikor-floresan konjugatlar ve HBSS kullanan dört antikor kokteyli preparatı.

1. Tüpleri karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
2. 1 mL HBSS %2 FCS ekleyin ve tüpleri 370 x g'da 10°C'de 7 dakika santrifüjleyin.
3. Süpernatanı atın ve peletleri 200 μL HBSS% 2 FCS içinde yeniden süspanse edin.
4. Yeniden süspanse edilmiş peletleri yeni, etiketli FACS tüplerine aktarın.
5. FACS kullanarak T hücresi proliferasyonunu değerlendirin.
6. 5. günde, 6 oyuklu plakanın kalan iki oyuğundaki hücrelerle hücre boyama işlemini tekrarlayın.

6. Veri Analizi

1. "FlowJo" yazılımını açın ve dosyaları "Tüm örnekler" penceresine sürükleyin.
2. Y ekseninde ileri saçılma ve X ekseninde yan saçılma ile bir nokta grafiği görüntülemek için 3. günde toplanan uyarılmamış hücreler için dosyaya çift tıklayın.
3. "Çokgen"e tıklayın ve lenfoid hücreleri, Thy1.2⁺ CD3⁺ hücrelerini seçmek ve CD4⁺ ve CD8⁺ hücrelerini ayırt etmek için bir geçit stratejisi oluşturun (bkz. Şekil 1).

Şekil 1: Geçit stratejisi. Hücreler önce morfolojilerine göre kapılanır (solda: FSC-A, SSC-A). T hücreleri daha sonra kapılıdır (orta: CD3, Thy1.2) ve ayrıca CD4⁺ T hücreleri (turuncu) ve CD8⁺ T hücreleri (mavi) (sağda: CD4, CD8) olarak bölünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Adımları diğer dosyalarla tekrarlayın.
2. Bölünen ve bölünmeyen hücrelerin frekanslarını belirlemek için, önce "Düzen düzenleyici"ye tıklayarak hücre popülasyonlarını görselleştirin.
3. Dört tüpün her birinden CD4 T hücrelerini ve CD8 T hücrelerini "Tüm örnekler penceresi"ne sürükleyin
4. Her popülasyonu temsil eden grafikler görünecektir.
5. Sonuçları görselleştirmek için histogramı kullanın ve farklı tüplerin ve farklı popülasyonların karşılaştırılması için parametre olarak "CFSE"yi seçin.
6. Bölünmeyen hücreler daha yüksek CFSE seviyelerini korurken, çoğalan hücreler CFSE içeriğini bölünen hücrelere böler
7. Bölünmeyen hücreler üzerinde bir kapı oluşturun ve bunu tüm tüplere uygulayın.
8. Hücreleri bölmek için bir kapı oluşturun ve tüm tüplere uygulayın.
9. CD3 + hücrelerinin bölünme sıklığını incelemek için "Tablo düzenleyici" ye tıklayın.
10. İlgilenilen popülasyonları - CD8 T hücrelerini bölerek ve CD4 T hücrelerini bölerek - "Tablo" ya sürükleyin
.
11. "İstatistik" menüsünde, "T hücrelerinin frekansı"nı seçin, ardından frekansı yeni bir tabloda ortaya çıkarmak için "Tablo oluştur"a tıklayın.
12. "Tablo oluştur"a tıklayın. Frekans değerlerini ortaya çıkarmak için yeni bir tabloda görünün.