5.10: Hücre Döngüsü Analizi: CFSE Boyama ve Akış Sitometrisi Kullanılarak Stimülasyon Sonrası CD4 ve CD8 T Hücre Proliferasyonunun Değerlendirilmesi

1. Hazırlık

1. Başlamadan önce laboratuvar eldivenleri ve uygun koruyucu giysiler giyin.
2. Tüm diseksiyon aletlerini önce bir deterjanla ve ardından p etanol ile sterilize edin ve ardından iyice kurulayın.
3. % 2 fetal buzağı serumu (FCS) içeren 50 mL Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlayın.

2. Diseksiyon

1. Bir karbondioksit dağıtım sistemi kullanarak, fareyi hipoksi ile ötenazi yapın. Ötenazi fareyi sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon plakasına sabitleyin ve makas ve forseps kullanarak uzunlamasına laparotomi yapın.
2. Forseps kullanarak, mide ve dalağı ortaya çıkarmak için bağırsakları ve mideyi karnın sağ tarafında hareket ettirin. Dalak mideye yapışıktır.
3. Forseps kullanarak, dalağı mideden dikkatlice ayırın ve 5 mL HBSS% 2 FCS içeren Petri kabına yerleştirin.

3. Bağışıklık Hücresi İzolasyonu

1. Dalağı aynı Petri kabının üzerine 40 μm'lik bir hücre süzgecine yerleştirin. Dalağı ayırmak için bir pistonla ezin.
2. Ayrışmış dalağı ve sıvıyı 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
3. Tüpü 370 x g'da 10 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin ve peletten kaçınarak süpernatanı atın.
4. Eritrositleri parçalamak için peleti 2 mL potasyum asetat içinde yeniden süspanse edin. 2 dakika bekleyin ve ardından HBSS %2 FCS kullanarak sesi 15 mL'ye kadar yükseltin.
5. Tüpü 10 ° C'de 7 dakika boyunca 370 x g'da tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 5 mL HBSS% 2 FCS içinde yeniden süspanse edin.
6. Bir tripan mavisi boyama testi kullanarak hücreleri sayın ve uygun bir hacimde HBSS% 2 FCS kullanarak nihai hücre konsantrasyonunu 10⁷ hücre / mL'ye ayarlayın.

4. CFSE Boyama ve T Hücresi Stimülasyonu

1. 10⁷ izole dalak hücresi / tüpünü 4 tüpe dağıtın (15 mL tüpler, 1 ila 4 arasında etiketlenmiş)
2. Her tüpe 3 mL HBSS %2 FCS ekleyin.
3. Her tüpe 1 μL CSFE ekleyin (son konsantrasyon - 5 μM).
4. Tüpleri 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde 10 dakika inkübe edin.
5. Tüp 3 ve 4'te, 2.5 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda 12 mL HBSS% 2 FCS + anti-CD3 antikoru ekleyin. Tüp 3 ve 4, hücre döngüsü üzerindeki etkiyi gözlemlemek için anti-CD3 antikoru kullanılarak uyarılır.
6. Tüp 1 ve 2'ye 12 mL HBSS% 2 FCS ekleyin. Tüp 1 ve 2'deki hücreler uyarılmayacaktır.
7. Tüm tüpleri 370 x g'da 10 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları atın.
8. Peletleri 2 mL HBSS %2 FCS'de yeniden süspanse edin.
9. Elde edilen çözeltileri 6 oyuklu bir plaka üzerinde ayrı kuyucuklara aktarın.
10. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 3 gün boyunca inkübe edin.

5. Hücre Boyama

1. 3. günde, kuyu 1 ve 3'e 2 mL HBSS% 2 FCS ekleyin.
2. Kuvvetlice pipetleyin ve numuneleri 5 mL FACS tüplerine aktarın.
3. Kalan hücreleri 2-4 numaralı kuyulardan 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe etmeye devam edin. Stimülasyonun hücre döngüsü üzerindeki uzun vadeli etkilerini araştırmak için 5. günde analiz edilecekler.
4. Tüpleri 370 x g'da 10 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları atın.
5. Her tüpe 100 μL antikor karışımı ekleyin (bakınız Tablo 1).

Tablo 1: Antikor karışımı bileşimi. Konsantre antikor-floresan konjugatlar ve HBSS kullanan dört antikor kokteyli preparatı.

1. Tüpleri karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
2. 1 mL HBSS %2 FCS ekleyin ve tüpleri 370 x g'da 10°C'de 7 dakika santrifüjleyin.
3. Süpernatanı atın ve peletleri 200 μL HBSS% 2 FCS içinde yeniden süspanse edin.
4. Yeniden süspanse edilmiş peletleri yeni, etiketli FACS tüplerine aktarın.
5. FACS kullanarak T hücresi proliferasyonunu değerlendirin.
6. 5. günde, 6 oyuklu plakanın kalan iki oyuğundaki hücrelerle hücre boyama işlemini tekrarlayın.

6. Veri Analizi

1. "FlowJo" yazılımını açın ve dosyaları "Tüm örnekler" penceresine sürükleyin.
2. Y ekseninde ileri saçılma ve X ekseninde yan saçılma ile bir nokta grafiği görüntülemek için 3. günde toplanan uyarılmamış hücreler için dosyaya çift tıklayın.
3. "Çokgen"e tıklayın ve lenfoid hücreleri, Thy1.2⁺ CD3⁺ hücrelerini seçmek ve CD4⁺ ve CD8⁺ hücrelerini ayırt etmek için bir geçit stratejisi oluşturun (bkz. Şekil 1).

Şekil 1: Geçit stratejisi. Hücreler önce morfolojilerine göre kapılanır (solda: FSC-A, SSC-A). T hücreleri daha sonra kapılıdır (orta: CD3, Thy1.2) ve ayrıca CD4⁺ T hücreleri (turuncu) ve CD8⁺ T hücreleri (mavi) (sağda: CD4, CD8) olarak bölünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Adımları diğer dosyalarla tekrarlayın.
2. Bölünen ve bölünmeyen hücrelerin frekanslarını belirlemek için, önce "Düzen düzenleyici"ye tıklayarak hücre popülasyonlarını görselleştirin.
3. Dört tüpün her birinden CD4 T hücrelerini ve CD8 T hücrelerini "Tüm örnekler penceresi"ne sürükleyin
4. Her popülasyonu temsil eden grafikler görünecektir.
5. Sonuçları görselleştirmek için histogramı kullanın ve farklı tüplerin ve farklı popülasyonların karşılaştırılması için parametre olarak "CFSE"yi seçin.
6. Bölünmeyen hücreler daha yüksek CFSE seviyelerini korurken, çoğalan hücreler CFSE içeriğini bölünen hücrelere böler
7. Bölünmeyen hücreler üzerinde bir kapı oluşturun ve bunu tüm tüplere uygulayın.
8. Hücreleri bölmek için bir kapı oluşturun ve tüm tüplere uygulayın.
9. CD3 + hücrelerinin bölünme sıklığını incelemek için "Tablo düzenleyici" ye tıklayın.
10. İlgilenilen popülasyonları - CD8 T hücrelerini bölerek ve CD4 T hücrelerini bölerek - "Tablo" ya sürükleyin
.
11. "İstatistik" menüsünde, "T hücrelerinin frekansı"nı seçin, ardından frekansı yeni bir tabloda ortaya çıkarmak için "Tablo oluştur"a tıklayın.
12. "Tablo oluştur"a tıklayın. Frekans değerlerini ortaya çıkarmak için yeni bir tabloda görünün.

Çoğu immünoloji çalışması için, bağışıklık hücrelerinin proliferasyonunun ölçülmesi önemli bir adımdır ve CFSE floresan boya bazlı yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. Uygun hücre bölünmesi, bağışıklık hücreleri için önemlidir, çünkü bir bağışıklık tepkisinin hem seviyelerini hem de özgüllüğünü düzenler. Örneğin, T hücreleri kanser hücrelerini tanımlamak ve öldürmek için çoğalır ve B hücreleri spesifik antikorlar üretmek için hücre bölünmesine uğrar. CSFE testinin genel öncülü, hücrelerin canlı hücrelere giren ve içerideki proteinlere stabil bir şekilde bağlanan ve kalıcı etiketleme ile sonuçlanan yeşil floresan boya CFSE ile boyanmasını içerir. Sonuç olarak, boya içeren ana hücre bölündüğünde, her bir yavru hücre, ana hücreden floresansın yarısını alır.

Bu işlem, sonraki bölümlerde devam eder ve boya yoğunluğu her bölünmede kademeli olarak azalır. İstenilen son noktada, her hücrenin floresan yoğunluğu akış sitometrisi ile ölçülür. Bu veriler daha sonra hücrelerin geçirdiği bölünmelerin sayısını ve modelini ölçmek için kullanılır. Burada gösterildiği gibi, en yüksek floresansa sahip hücre popülasyonu ana nesildendir. İkinci en yüksek, ikinci nesle aittir ve bu böyle devam eder. Tepe sayısı, hücre bölünmelerinin sayısını belirler.

Ek olarak, birincil bağışıklık hücreleri kullanılıyorsa, örneğin T hücreleri gibi spesifik hücre popülasyonları, CFSE ile birlikte farklı renkli bir floresan boya ile etiketlenebilir ve aynı anda çok renkli akış sitometrisi kullanılarak tanımlanabilir. Yeni veriler aynı grafik üzerinde çizilebilir, şimdi farklı CFSE boyama yoğunluklarına sahip T hücresi alt popülasyonunu gösterir ve bu sayede T hücrelerinin çoğalma hızı spesifik olarak analiz edilebilir. Bu video, bir anti-CD3 antikoru ile uyarılan fare splenositlerinin CFSE boyama protokolünü göstermektedir. Bunu, T hücrelerini etiketlemek için boyama ve hücre proliferasyonlarını izlemek için akış sitometrisi takip eder.

Başlamak için uygun koruyucu giysi ve laboratuvar eldivenleri giyin. Daha sonra, bir çift forseps ve diseksiyon makasını önce bir deterjanla ve sonradan% 70 etanol ile yıkayın ve ardından temiz bir kağıt havluyla kurulayın. 50 mililitrelik bir tüpte bir mililitre FCS'yi 49 mililitre HBSS ile birleştirerek% 2 konsantrasyonda fetal buzağı serumu veya FCS ile 50 mililitre Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS hazırlayın. Solüsyonu yaklaşık 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Daha sonra, splenik B-lenfositlerin FACS izolasyonu için video protokolünde gösterildiği gibi fare dalak hücrelerini izole edin.

Dört adet 15 mililitrelik tüpü bir ila dört arasında etiketleyin ve yedinci izole dalak hücrelerine bir kez 10 ekleyin. Daha sonra, her tüpe üç mililitre HBSS% 2 FCS ekleyin. Ardından, her bir tüpe bir mikrolitre beş mikromolar karboksifloresein süksinimidil ester veya CFSE pipetleyin. Tüpleri 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatörde 10 dakika inkübe edin. Birinci ve ikinci tüplerdeki hücreler uyarılmayacaktır. Splenik CD4 ve CD8 T hücrelerinin bazal proliferasyon seviyesini ortaya çıkarmak için kullanılacaktır.

Bu tüplere 10 mililitre HBSS% 2 FCS pipetleyin. Üçüncü ve dördüncü tüpler, hücre döngüsü üzerindeki etkileri gözlemlemek için anti-CD3 antikoru tarafından uyarılacaktır. Üçüncü ve dördüncü tüplere mililitre başına 2.5 mikrogramlık bir son konsantrasyonda 10 mililitre HBSS,% 2 FCS ve anti-CD3 antikoru ekleyin. Daha sonra, tüm tüpleri 370 x g'da 10 santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Süpernatanları atın. Peletleri iki mililitre HBSS% 2 FCS içinde yeniden süspanse edin ve elde edilen çözeltileri altı oyuklu bir plaka üzerinde ayrı kuyucuklara pipetleyin. Numune kimliklerini takip etmek için plakayı birden dörde kadar dikkatlice etiketleyin. Hücreleri üç gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin.

Üçüncü günde, birinci ve üçüncü tüplerdeki hücreleri içermesi gereken birinci ve üçüncü kuyucuklara iki mililitre HBSS% 2 FCS ekleyin. Kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından numuneleri etiketli beş mililitrelik FACS tüplerine aktarın. Altı oyuklu plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin. İkinci ve dördüncü kuyulardan kalan bu hücreler, stimülasyonun hücre döngüsü üzerindeki uzun vadeli etkilerini araştırmak için beşinci günde analiz edilecektir. Tüpleri 370 x g'da 10 santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanları atın. Şimdi, her tüpe 100 mikrolitre antikor karışımı ekleyin. Tüpleri karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, her tüpe bir mililitre HBSS% 2 FCS ekleyin ve tüpleri 10 santigrat derecede yedi dakika boyunca 370 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanları atın. Peletleri 200 mililitre HBSS% 2 FCS içinde tekrar süspanse edin ve iyice karıştırın. Yeniden askıya alınan peletleri yeni etiketli FACS tüplerine aktarın.

Ardından, FACS protokolünde gösterildiği gibi akış sitometrisi kullanarak T hücresi proliferasyonunu değerlendirin. Lenfoid CD3 pozitif hücreleri seçmek ve CD4 pozitif ve CD8 pozitif hücreleri ayırt etmek için hücreleri kapatın ve verileri bir ve üç tüpler için kaydedin. Beşinci günde, altı oyuklu plakanın kalan iki oyuğundaki hücrelerle hücre boyama işlemini tekrarlayın.

CD3 stimülasyonunun CD4 ve CD8 pozitif hücrelerin hücre döngüsü üzerindeki etkilerini, stimülasyondan üç gün ve beş gün sonra analiz edeceğiz. Başlamak için FlowJo simgesine tıklayın ve dosyalarınızı Tüm Örnekler penceresine sürükleyin. Y ekseninde ileri saçılma ve x ekseninde yan saçılma ile bir nokta grafiği görüntülemek için üçüncü günde toplanan uyarılmamış hücreler için dosyaya çift tıklayın. Lenfosit popülasyonlarını morfolojilerine göre daire içine almak için çokgene tıklayın. Alt popülasyon tanımlama penceresinde, popülasyon lenfositlerini adlandırın ve Tamam'a tıklayın. Ardından, daire içine alınmış popülasyona çift tıklayın ve yeni pencerede y ekseninde Thy1.2'yi ve x ekseninde CD3'ü seçin. Ardından, CD3 ve Thy1.2 çift pozitif hücreleri daire içine almak için çokgene tıklayın. Yeni alt popülasyon tanımlama penceresinde, popülasyonu T-Hücreleri olarak adlandırın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, daire içine alınmış popülasyona çift tıklayın. Yeni pencerede, y ekseninde CD4'ü ve x ekseninde CD8'i seçin. Ardından, CD4 pozitif popülasyonu daire içine almak için çokgen üzerine tıklayın. Yeni alt popülasyon tanımlama penceresinde, popülasyonu CD4 T-Hücreleri olarak adlandırın ve Tamam'ı tıklatın. Şimdi, CD8 pozitif popülasyonu daire içine almak için çokgene tıklayın. Yeni alt popülasyon tanımlama penceresinde, popülasyonu CD8 T-Hücreleri olarak adlandırın ve Tamam'ı tıklatın. Bu adımları diğer dosyalarla yineleyin.

Bölünen ve bölünmeyen hücrelerin frekanslarını belirlemek için önce Düzen Düzenleyici'ye tıklayarak hücre popülasyonlarını görselleştirin. Ardından, dört tüpün her birinden CD4 T hücrelerini ve CD8 T hücrelerini Tüm Örnekler penceresine sürükleyin. Nüfuslarınızı temsil eden grafikler görünecektir. Her tüp için, CD8 T hücreleri için nokta grafiğine çift tıklayın ve sonuçları görselleştirmek için Grafik Tanımı altında Histogram'ı seçin. Her zaman noktasında uyarılmış ve uyarılmamış hücre popülasyonlarını karşılaştırmak için parametre olarak CFSE'yi seçin. Bölünmeyen hücreler daha yüksek CFSE seviyelerini korurken, çoğalan hücreler CFSE içeriğini bölünen hücrelere böler.

Şimdi, Shift tuşuna basarken histograma çift tıklayın. Yeni pencerede, aralığa tıklayın ve en yüksek zirveye karşılık gelen CFSE aralığını seçin. Alt popülasyon tanımlama penceresinde, popülasyonu Bölünmeyen CD8 T-Hücreleri olarak adlandırın ve popülasyonu Bölen CD8 Hücrelerini etiketleyin. Şimdi, her tüpte bölünen ve bölünmeyen CD4 T hücrelerini seçmek için tekrarlayın. CD3 pozitif hücrelerin bölünme sıklığını incelemek için Tablo Düzenleyici'ye tıklayın. Ardından, ilgilenilen popülasyonları, CD8 T-Hücrelerini Bölme ve CD4 T-Hücrelerini Bölme tabloya sürükleyin. İstatistik menüsünde T hücrelerinin sıklığı'nı seçin. Ardından, frekansı yeni bir tabloda ortaya çıkarmak için Tablo Oluştur'a tıklayın.