Mikroskopi ve boyama: gram, kapsül ve endospor boyama

Bakteriler, hücrelerin şekli, dizilişi, kapsül üretip üretmedikleri, spor oluşturup oluşturmadıkları gibi birçok ayırt edici özelliğe sahip mikroskobik canlı organizmalardır. Bu özelliklerin tümü boyama ile görselleştirilebilir ve farklı bakteri türlerinin tanımlanmasına ve sınıflandırılmasına yardımcı olabilir.

Hücre şekli ve düzenlemesinin ilk iki özelliğini incelemek için Gram boyama adı verilen basit bir teknik kullanabiliriz. Burada, kristal viyole, bir lam üzerine ısıyla sabitlenmiş bakterilere uygulanır. Daha sonra, Gram'ın iyot çözeltisi slayta eklenir, bu da kristal viyole ile Gram'ın iyot çözeltisi arasında çözünmeyen bir kompleksin oluşmasına neden olur. Daha sonra bir renk giderici uygulanır ve kalın bir peptidoglikan tabakasına sahip herhangi bir bakteri, renk giderici tarafından kolayca nüfuz etmediği için mor renkte lekelenir. Bu bakteriler Gram pozitif olarak adlandırılır.

Gram negatif bakteriler daha ince bir peptidoglikan tabakasına sahiptir ve renk gidericide leke çıkararak mor rengi kaybeder. Bununla birlikte, dış kısımlarında bir lipopolisakkarit tabakasına bağlanan bir safranin karşı boyası eklendiğinde kırmızımsı pembe renkte boyanırlar. Boyandıktan sonra hücreler, sınıflandırma ve tanımlamaya daha fazla yardımcı olan zincirler veya kümeler gibi morfoloji, boyut ve düzenleme açısından gözlemlenebilir.

Mikrobiyoloğun araç setindeki bir başka yararlı teknik, bazı bakteri hücresi türlerini çevreleyen dış kapsülleri görselleştirmek için kullanılan kapsül boyasıdır. Kapsülün iyonik olmayan bileşimi ve lekeleri itme eğilimi nedeniyle, basit boyama yöntemleri işe yaramaz. Bunun yerine, bakteri hücreleri kristal viyole ile boyanmadan önce arka planı Kongo kırmızısı gibi asidik bir renklendirici ile boyayan negatif bir boyama tekniği kullanılır. Bu, hücrelerin etrafında açık bir hale olarak mevcut olan herhangi bir kapsülü bırakır.

Burada ele alınan son ana boyama tekniği, incelenen bakterilerin spor oluşturup oluşturmadığını belirlemeye yardımcı olabilir. Olumsuz koşullarda, bazı bakteriler, birincil işlevi aşırı sıcaklıklar veya dehidrasyon gibi çevresel stres dönemlerinde bakterilerin hayatta kalmasını sağlamak olan endosporlar, uykuda, sert, üreme dışı yapılar üretir. Bununla birlikte, tüm bakteri türleri endospor yapmaz ve birçok boyaya karşı geçirimsiz oldukları için standart tekniklerle boyanmaları zordur. Schaeffer-Fulton yöntemi, bir slayta sabitlenmiş bakterilere uygulanan malakit yeşili lekesini kullanır. Slayt daha sonra Safranin ile lekelenmeden önce su ile yıkanır. Vejetatif hücreler pembemsi-kırmızı görünürken, mevcut endosporlar yeşil görünecektir. Bu videoda, bu yaygın bakteri boyama tekniklerini nasıl uygulayacağınızı öğrenecek ve ardından ışık mikroskobu kullanarak boyama örneklerini inceleyeceksiniz.

Prosedüre başlamak için uzun saçları geriye bağlayın ve laboratuvar önlüğü ve eldiven de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanı giyin.

Ardından, yeni bir mikroskop lamını laboratuvar bezi ile temizleyin. Ardından, ilk slaytın üzerine 10 mikrolitre 1X fosfat tamponlu salin pipetleyin. Ardından, LB agar plakasından tek bir bakteri kolonisi seçmek için steril bir pipet ucu kullanın. İnce, eşit bir tabaka oluşturmak için bakteri kolonisini sıvıya sürün. Sürgüyü tezgahın üzerine yerleştirin ve tamamen kurumasını bekleyin.

Kuruduktan sonra, bakterileri ısıyla sabitlemek için bir Bunsen brülörü yakın. Maşa kullanarak, sürgünü bakteri tarafı yukarı bakacak şekilde brülör alevinden birkaç kez geçirin, sürgünü alevin içinde çok uzun süre tutmamaya dikkat edin, bu hücreleri bozabilir.

Şimdi, lavabonun üzerinde çalışarak, slayt seviyesini tutun ve bakteri bulaşmasını tamamen kaplamak için birkaç damla Gram kristal viyole uygulayın ve ardından slaytı 45 saniye bekletmek için tezgahın üzerine yerleştirin. Ardından, slaytı belirli bir açıyla tutun ve bakteri bulaşmasını doğrudan fışkırtmamaya dikkat ederek sürgünün üstüne hafifçe bir su akışı püskürtün. Şimdi, slayt seviyesini tekrar tutarak, lekeli bakterileri tamamen kaplamak için Gram'ın iyot solüsyonunu uygulayın ve ardından 45 saniye daha bekletin. Daha sonra, daha önce gösterildiği gibi iyotu slayttan dikkatlice durulayın. Slaytı belirli bir açıyla tutarken, slayta birkaç damla Gram renk giderici ekleyin ve yaklaşık 5 saniye boyunca, akıntı netleşene kadar lekeli bakterilerin üzerinden akmasına izin verin. Hemen, daha önce gösterildiği gibi suyla durulayın. Bu, lekenin aşırı renginin açılmasını sınırlayacaktır. Ardından, slayt seviyesini tekrar tutarak, lekeli bakterileri tamamen kaplamak için Gram'ın safranin karşı boyasını uygulayın. 45 saniye sonra, Safranin'i slayttan daha önce gösterildiği gibi suyla nazikçe durulayın ve ardından kağıt havluyla kurulayın.

Son olarak, slayta doğrudan bir damla daldırma yağı ekleyin ve ardından slaytı 100X yağ objektif lensi ile bir ışık mikroskobu kullanarak inceleyin.

Bu boyama protokolüne başlamak için önce doğru kişisel koruyucu ekipmanı giyin ve ardından kullanılacak cam slaytların temiz olduğundan emin olun.

Ardından, çözümleri hazırlayın. % 1 kristal viyole çözeltisi yapmak için, 0.25 gram kristal viyole tozunu 25 mililitre damıtılmış su ile karıştırın ve çözünene kadar girdap yapın. Daha sonra, 0.25 gram Kongo kırmızı tozunu 25 mililitre damıtılmış su ile karıştırarak% 1 Kongo kırmızısı çözeltisi hazırlayın ve çözünene kadar girdap yapın. Şimdi, 10 mikrolitre Kongo kırmızısı solüsyonunu slaytın üzerine pipetleyin. Temiz, steril bir pipet ucu kullanarak, LB agar plakasından tek bir bakteri kolonisi seçin. Ardından, ince, eşit bir tabaka oluşturmak için bakteri kolonisini boyaya sürün. Bakteri slaytını 5-7 dakika tamamen havayla kurutun. Slayt kuruduktan sonra, lekeyi kaplayacak kadar% 1 kristal viyole ile doldurun ve 1 dakika bekletin. Şimdi, slaytı belirli bir açıyla tutun ve bakterileri doğrudan fışkırtmamaya dikkat ederek slaytın üstüne hafifçe bir su akışı püskürtün. Tamamen kuruyana kadar sürgüyü 45 derecelik bir açıyla tutmaya devam edin. Son olarak, slayta doğrudan bir damla daldırma yağı ekleyin ve ardından slaytı 100X yağ objektifli bir ışık mikroskobu kullanarak inceleyin.

Endospor boyaması yapmak için önce 0'ı karıştırarak% 0.5 malakit yeşili bir çözelti hazırlayın. 25 mililitre damıtılmış su ile 125 gram malakit yeşili tozu ve daha sonra çözünene kadar çözeltiyi girdaplayın. Ardından, slaytın ortasına 10 mikrolitre 1X PBS pipetleyin. Ardından, LB agar plakasından tek bir bakteri kolonisi seçmek için steril bir pipet ucu kullanın. İnce, eşit bir tabaka oluşturmak için bakterileri sıvıya sürün. Şimdi, sürgüyü tezgahın üzerine yerleştirin ve tamamen kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, bakterileri ısıyla sabitlemek için bir Bunsen brülörü yakın. Slaytı, bakteri tarafı yukarı bakacak şekilde mavi brülör alevinden birkaç kez geçirin. Ardından, slayt soğuduktan sonra, ısıyla sabitlenmiş lekenin üzerine bir parça önceden kesilmiş lens kağıdı yerleştirin. Ardından, bir ocak gözünü en yüksek ayara getirin ve bir bardak suyu kaynatın.

Lens kağıdını malakit yeşili solüsyonla doyurun ve maşa kullanarak slaytı kaynar su kabının üzerine yerleştirin ve 5 dakika buharda pişirin. Gerektiği kadar her seferinde bir damla olmak üzere daha fazla boya ekleyerek lens kağıdını nemli tutun. Ardından, yine maşa kullanarak, slaytı beherden alın ve lens kağıdını çıkarın ve atın. Slaytın 2 dakika soğumasını bekleyin. Lavabonun üzerinde çalışırken, sürgüyü belirli bir açıyla tutun ve sürgünün üstüne hafifçe bir su akışı püskürtün. Şimdi, slayt seviyesini tutun ve slaytı tamamen kaplamak için Safranin uygulayın. Ardından 1 dakika bekletin. Ardından, sürgüyü belirli bir açıyla tutun ve daha önce gösterildiği gibi durulayın. Kaydırağın tezgah üzerinde kurumasına izin verin. Son olarak, slayta doğrudan bir damla daldırma yağı ekleyin ve ardından slaytı 100X yağ objektifi ile bir ışık mikroskobu ile inceleyin.

Gram boyama protokolünde iki farklı renkte leke ortaya çıkabilir. Koyu mor lekelenme, bakterilerin Gram pozitif olduğunu ve kristal viyole lekesini koruduklarını gösterir. Buna karşılık, kırmızımsı-pembe boyama, Gram-negatif bakterilerin bir özelliğidir ve bunun yerine Safranin karşı boyası ile renklendirilecektir. Ek olarak, Gram boyamadan sonra farklı şekil ve bakteri düzenlemeleri görselleştirilebilir. Örneğin, Cocci veya yuvarlak bakterileri çubuk şeklindeki Bacillus'tan ayırt etmek veya tipik olarak kümeler halinde toplanan veya tek başına meydana gelenlere kıyasla iplikler oluşturan bakterileri tanımlamak mümkündür.

Kapsül lekeli bir mikroskop görüntüsünde, bakteri hücreleri tipik olarak mor renkte boyanır ve slaydın arka planı koyu renkli bir şekilde boyanmalıdır. Bu karanlık arka plana karşı, eğer varsa, bakteri kapsülleri hücrelerin etrafında net bir hale olarak görünecektir.

Son olarak, endospor boyamasında, Vejetatif hücreler Safranin karşı boyası ile kırmızıya boyanacaktır. Numunede endosporlar varsa, bunlar malakit yeşili lekesini koruyacak ve mavimsi-yeşil renkte görünecektir.