Name: Fotoğraf Bağlı Çapraz Bağlanma Değiştirilmemiş Proteinler (PICUP) amiloidojenik Peptitler Uygulanan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Öğrenin amiloidojenik peptitlerde oligomer boyut dağılımını analiz etmek için PICUP yöntemini. Bu teknik nörodejeneratif hastalıklarda protein yapısını incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, California Halk Sağlığı Bölümü&#39;nden Larry L. Hillblom Alzheimer Derneği Vakfı, IIRG-07-58.334 ve 07-65798 NIH / NIA, 2005/2E AG027818 ve AG030709 hibe ile desteklendi.

1. Peptid hazırlık <ol><li> Etiketli, silikon kaplı, düşük adsorban mikrofuge&#39;de tüpler içine mikro ve transfer kullanarak liyofilize peptid yaklaşık 100-200 mg tartılır. Burada, insan Aβ40, dizileri, Aβ42, kalsitonin ve GRF kullanın. </li><li> Burada, peptidler 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) ile homojen, toplam hazırlıkları elde etmek için ön tedavi kullanın. Önceden oluşmuş agrega deneyleri 5 arasında kötü tekrarlanabilirlik neden amiloidojenik proteinlerin hızlı agregasyonu, neden çünkü bu adım gereklidir. Filtrasyon ve SEC gibi diğer yöntemleri de agrega-PICUP 6 için hazırlıklarını elde etmek için kullanılabilir. </li><li> HFIP ile peptitler tedavi için yeterli koruma (HFIP uçucu ve zehirli) giyen bir davlumbaz içinde buz üzerinde HFIP konteyner ön soğutun. 250 ml şişe soğutma genellikle 10-15 dakika gerektirir. Peptid lyophilizates içeren 0,5 mM nominal peptid konsantrasyonu elde etmek için önceden soğutulmuş tüplere HFIP ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir su banyosu sonikatör peptid çözümler sonikasyon. </li><li> Yavaşça vorteksleyin ve tüpler oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Buz (1 dakika için) tüpler Chill ve 10-50-ul alikotları etiketli 0.6 ml az emici tüplerin içine çözümler bölmek. </li><li> Nazik bir azot akımı altında buharlaşma HFIP çıkarın, ya da gece davlumbaz tüpleri açık bırakın. Gecede buharlaşma için, açık tüpleri rafa yerleştirin ve Kimwipes toz ve partikül kontaminasyonu engellemek için büyük bir levha ile onları karşılamak. </li><li> , Bir lyophilizer vakumlu kalan HFIP, ya da 30 dakika santrifüj konsantratör Exsiccate ya da 2 saat süreyle bir vakum girişine bağlı bir exsiccator Nihai ürün mikrofuge&#39;de tüplerin alt kısmında bir peptid film olacak. Eğer düzgün exsiccated, tüpler -20 veya -80 ° C, uzun süre (ay) hava geçirmeyen saklanabilir. </li></ol> 2. HFIP ile tedavi edilen peptitler çözücü ve fotoğraf çapraz bağlama <ol><li> Çapraz bağlama reaksiyonlar, çapraz bağlama ve soğutma reaktifler hazırlamak için bir ihtiyacı için HFIP ile tedavi edilen peptitler çözülebilmesinde önce. </li><li> Amonyum persülfat tartılır (APS, Sayın 228,2 g / mol) ve 10 mM sodyum fosfat, pH 7.4, 20 mM solüsyon hazırlanır. Çözüm netleşene kadar bir vorteks ile karıştırın. </li><li> 10 mM sodyum fosfat, pH 7.4, 1 mM çözüm Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hekzahidrat (RuBpy, Bay 748,63 g / mol) hazırlayın. Bir vorteks ile karıştırın ve tam dağılması doğrulamak. Tüp alüminyum folyo kullanarak ışık koruyun. </li><li> Çapraz bağlama sonrası SDS-PAGE analizi için uygun bir ısıl işlem reaktif% 5 β-mercaptoethanol 2 × SDS-PAGE numune tamponu. Alternatif olarak, 1 M dithiothreitol (DTT, Bay 154.5 g / mol) deiyonize su veya uygun bir tampon kullanılabilir. </li><li> HFIP ile tedavi edilen peptid filmler seyreltik NaOH ilk çözülür ve daha sonra sodyum fosfat tamponu ~ 30 mcM peptid konsantrasyonu elde etmek için eklenir. Ekle 60 mM NaOH, NaOH ve su sırasıyla 10 ve% 45, son hacim teşkil ettiğini gibi peptid film içeren tüpe deiyonize su ile izledi. Ucu, yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın ve bir su banyosunda sonikatör 5 dakika boyunca sonikasyon kullanarak mikrofuge&#39;de tüp iç duvarları kapalı peptid filmi Pençe. </li><li> 45% 20 mM sodyum fosfat, pH 7.4, pipetleme ile karıştırın ve 10 dakika 16.000 g de santrifüj ekleyin. Negatif kontrol için su verme reaktifi ile karışık çizgilerini iptal bağlantılı peptidler hacimde bir kenara koyun. </li><li> 1 s kamera deklanşör gecikmesi ayarlayın. Yüksek ışınlama zamanlarda, geniş radikal reaksiyonlar protein düşmesine neden olabilir. Fotoğraf makinesi obtüratör yükleyin. Işınlama süresi yeni bir protein ile yöntemi kullanılarak optimize edilmesi gerekebilir. </li><li> Tipik bir PICUP reaksiyonu 20 ul reaksiyon hacmi yapılır. Peptid çözüm 18 ul açık, ince duvarlı, 0.2 ml PCR tüpü içine aktarın. </li><li> Peptid çözüm için, 1 1 ul APS takip ul RuBpy ekleyin ve reaktifler pipetleme (reaksiyon karışımı RuBpy ve APS son konsantrasyonu 0.05 ve 1 mM, sırasıyla olacak) karıştırın. </li><li> Reaksiyon tüpü 1.8 ml&#39;lik cam flakon içinde hızlı bir şekilde yerleştirin. Kamera gövdesi önünde bağlı körük içindeki şişe yerleştirin. Lens koruyucusu takın ve örnek körük içinde 1 sn için ışınlanmış, böylece deklanşöre basın. </li><li> Örnek ışınlama sonra, hızla flakon flakon körük ve PCR tüp almak. 1 ul DTT ya da 10 ul azaltarak SAYFA numune tamponu ekleyerek reaksiyon hızla gidermek. Reaksiyon peptid her kısım için tekrarlayın. </li><li> 7 günden daha uzun ya da SDS-PAGE ve gümüş boyama ile analizden önce buz üzerinde tutulmalıdır tepkime saklama için -20 ° C&#39;de dondurulur. </li></ol> 3. SDS-PAGE ve şerit boyamaçapraz bağlı peptid ürünleri <ol><li> Rutin SDS-PAGE ve gümüş boyama çapraz bağlı peptidler görselleştirmek için yapılmaktadır. </li><li> ~ 130 pmol her kulvar için peptid elde etmek için her kulvar için reaksiyon karışımı 5 ul yükleyin. </li><li> Karşılaştırma için benzer miktarlarda çizgilerini iptal bağlantılı peptitler içerir. Ayrıca peptid bantları moleküler ağırlığı görsel yaklaşım için standart bir protein merdiven içerir. </li><li> Standart bir jel elektroforez cihazları kullanırken jel çalıştırın. Biz Invitrogen XCell SureLock Mini-Hücre sistemi kullanımı ve Invitrogen yayın IM-1002, Novex Pre-Cast Jel Elektroforez Kılavuzu göre gümüş boyama gerçekleştirmek. </li></ol> Bölüm 4: Temsilcilik Sonuçları (Şekil 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result no demarcation.png" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: çizgilerini iptal-bagli gösteren gümüş lekeli poliakrilamid jeller (+ -) GRF, kalsitonin, Aβ40 ve Aβ42 ve foto-çapraz bağlı () SDS-PAGE ve PICUP oluşturulan Aβ40 oligomerler gümüş boyama analizleri yüksek oligomerler 7 bolluk içinde keskin bir düşüş takip tetramer yoluyla monomer yaklaşık benzer bant yoğunlukları göstermektedir. Çizgilerini iptal bağlı Aβ40 monomer 7 ile tutarlı bir Bay ile geçirir. Aβ42 ayrı bir oligomer boyut dağılımı gösterir. Aβ42 oligomerler 2-3 8 grupları oluşturmaktadır. Birinci grup, trimer yoluyla monomer, artan oligomerlerdir sipariş ile azalan yoğunluk gösterir. İkinci grupta ise, bir Gauss dağılımı, pentamer ve hexamer maksimum tetramer ve heptamer arasında görülmektedir. Burada gösterilen üçüncü grup, Bay ~ 30,000-60,000 Da 8 oligomerler içerir. Bu yüksek Bay oligomerler genellikle SEC izole LMW Aβ42 kullanarak gözlenen ama peptid filtrasyon veya HFIP tedavisi 6 tarafından hazırlanmıştır. Çizgilerini iptal-bağlantılı Aβ42 ağırlıklı olarak iki grup, bir monomer bant ve 5,9 SDS tarafından uyarılan bir eserdir, geniş bir trimer / tetramer bant, üretir. Kalsitonin dimerleri, trimerler ve tetramers 7 pre-varlığını düşündüren, tetramer yoluyla bölge monomer monoton bir üstel azalma uzaklaşmakta oligomer boyutu dağılımı verir. Kontrolü polipeptid, GRF, dimer oligomerlerinin belirgin göreceli miktarları ile katlanarak artan moleküler kütlesi azaldığı gibi hexamer kadar monoton oligomer dağıtım üretir. Diğer deneylerde, yüksek oligomerler görüntülenmiştir 7 de olabilir. Tam sayısı ve göreceli yoğunlukları oligomer bantları biraz gerçek protein konsantrasyonu, jel yüklenen protein miktarı, ve gümüş boyama protokol geliştirme adım için kullanılan zaman bağlı olarak deneyler arasında değişebilir.

<ol><li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions%3A+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).</li>
<li>Kluger, R., Alagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+protein-protein+interactions%E2%80%94a+review+with+illustrative+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols.</a> Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).</li>
<li>Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+chemistry+and+biology%3A+development+of+multifunctional+photoaffinity+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rec%22%5BJournal%5D)">Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes.</a> Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers%E2%80%94what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+aggregate-free%2C+low+molecular+weight+amyloid-%CE%B2+for+assembly+and+toxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays.</a> Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+%28A%CE%B2%29+assembly%3A+A%CE%B240+and+A%CE%B242+oligomerize+through+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).</li>
<li>Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+state+characterization+of+amyloid+%CE%B2-derived+diffusible+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands.</a> Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+photochemical+cross-linking%E2%80%94a+new+tool+for+studies+of+metastable%2C+amyloidogenic+protein+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies).</a> Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).</li>
<li>Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+crosslinking+of+prion+protein+oligomers+and+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions.</a> Amyloid. 13, 67-77 (2006).</li>
<li>Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+events+of+%CE%B1-synuclein+oligomerization+revealed+by+photo-induced+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept.+Lett%22%5BJournal%5D)">The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking.</a> Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).</li>
<li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li>
</ol>

PICUP, istikrarlı bir protein kompleksleri 2 çalışma ilk geliştirilmiştir . Aβ 10, prion hastalığı ile ilişkili PrP Sc 11 ve α-sinüklein 12 metastabil amiloid protein meclisleri, kantitatif çalışma yöntemi uygulandı. PICUP Deney tasarlama dikkate alınması gereken en önemli faktörler, reaktif stokiyometri, ışınlama süresi ve numune hazırlama prosedürü. Ikinci sorun, büyük ölçüde deneysel verilerin yorumlanması etkiler ise eski iki konu, deneysel optimizasyon gerekebilir. Özellikle amiloidojenik pro...

<table><tbody><tr><td>Dolan-Jenner 200-W akkor lamba</td><td>Diğer</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Model 170-D</td><td>Lamba tarafından üretilen ısı&amp;#8211;kısa inkübasyon süreleri için örnekleri etkilemez.</td></tr><tr><td>35 mm SLR kamera gövdesi</td><td>Araç</td><td>Pentax</td><td>SP500 modeli</td><td>Kurulumumuzda, ışık kaynağından 10 cm uzağa yerleştirilen örneğin ışınlanması için uygun bir hazne sağlamak amacıyla kamera gövdesine bir körük takılmıştır.</td></tr><tr><td>Şeffaf, ince duvarlı PCR tüpleri</td><td>Diğer</td><td>Eppendorf</td><td>Fisher tarafından tedarik edilen 951010006 L22-003-24</td><td></td></tr><tr><td>Cam flakonlar (1,8 mL)</td><td>Diğer</td><td>Kimble Chase</td><td>Fisher 03-340-60 tarafından tedarik edilen 60940A 2</td><td></td></tr><tr><td>GRF</td><td>Reaktif</td><td>Bachem</td><td>H-3695</td><td></td></tr><tr><td>HFIP</td><td>Reaktif</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Çeker ocak içerisinde kullanın.</td></tr><tr><td>A&amp;#946;40 ve A&amp;#946;42</td><td>Reaktif</td><td>UCLA Biyopolimerler Laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsitonin</td><td>Reaktif</td><td>American Peptide</td><td>22-1-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipiridil)diklororutenyum(II) hekzahidrat</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Çözelti berraklaşana kadar vorteksleyin. Reajeni ortam ışığından korumak için RuBpy tüpünü folyo ile kapatın. RuBpy her seferinde taze olarak hazırlanır ve 48 saat içinde kullanılmalıdır.</td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Çözelti berraklaşana kadar vorteksleyin. APS her seferinde taze olarak hazırlanmalı ve 48 saat içinde kullanılmalıdır. </td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154-25 ML</td><td>SDS-PAGE analizi gerçekleştirildiğinde kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Örnek Tamponu (2x)</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;i&gt;SureLock&lt;/i&gt; Mini-Hücre</td><td>Araç</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine Jelleri (%10-20)</td><td>Diğer</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Çalıştırma Tamponu (10x)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Gümüş Boyama Kiti</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr></tbody></table>

fotoğraf bağlı Çapraz bağlanma değiştirilmemiş proteinler (picup) amiloidojenik peptitler uygulanan

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

Toksik oligomerler amiloidojenik proteinlerin montaj protein misfolding hastalıkları, Alzheimer, Parkinson ve Huntington hastalıkları, kalıtsal Amyotrofik lateral skleroz, ve tip 2 diyabet patogenezinde yeni ufuklar açan bir olaydır. Bu protein meclislerinin metastabil yapısı sayesinde, elektroforez, kromatografi, floresan veya dinamik ışık saçılımı gibi klasik yöntemlerle kantitatif oligomer boyutu dağılımını değerlendirmek için zordur. Amiloidojenik proteinlerin Oligomerleri oligomerler monomerlerin ilgimiz büyük meclisleri içine aynı anda ilişkilendirmek metastabil hangi karışımlar var. PICUP çapraz önce varolan oligomer boyutu dağılımları kovalent çapraz bağlama ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ya da boyut dışlama kromatografisi (SEC) gibi fraksiyon yöntemleri ile kombine edildiğinde, PICUP sağlar anlık görüntülerini oligomer popülasyonları stabilize bağlama. Bu nedenle, PICUP metastabil protein popülasyonlarının görselleştirme ve kantitatif analiz sağlar ve montaj ve deşifre dizisi değişiklikler ve oligomerization arasındaki ilişkileri izlemek için kullanılabilir<sup&gt; 1</sup&gt;. Mekanistik, PICUP Ru foto-oksidasyon içerir<sup&gt; 2 +</sup&gt; Tris (bipyridyl) Ru (II) kompleksi (RuBpy) Ru için<sup&gt; 3 +</sup&gt; Bir elektron alıcısı varlığı görünür ışık ile ışınlama. Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; Bir protein radikal üreten, komşu bir protein molekülünün bir elektron soyutlama yeteneğine sahip güçlü bir elektron oksitleyici<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Radikaller, kararsız, son derece reaktif türler ve bu nedenle içi ve moleküller arası reaksiyonlar çeşitli hızla kaybolur. Radikal, daha sonra bir hidrojen atomu kaybetmesi ve istikrarlı, kovalent bağlantılı dimer oluşturur dimerik radikal başka protein oluşturan monomer ile reaksiyona paylaşılmamış elektronu yüksek enerji kullanabilir. Dimer sonra, monomerlerin veya diğer dimerleri üst düzey oligomerler formu ile benzer bir mekanizma aracılığıyla daha fazla tepki gösterebilir. PICUP göreli avantajları diğer fotoğraf ya da kimyasal çapraz bağlama yöntemleri<sup&gt; 3,4</sup&gt; (≤ 1 saniye) kısa tahribatsız görünür ışığa maruz kalma, gerek<i&gt; Ön facto</i&gt; Yerli dizi modifikasyon, sıfır uzunlukta kovalent çapraz bağlama. Buna ek olarak, PICUP sağlar fizyolojik parametreleri de dahil olmak üzere geniş bir pH ve sıcaklık aralıkları içinde proteinlerin çapraz bağlama. Burada üç amiloidojenik proteinler, 40 çapraz-bağlantı PICUP uygulama göstermektedir - ve 42-kalıntı amiloid β-protein türevleri (Aβ40 ve Aβ42), kalsitonin ve kontrol protein, büyüme hormonu salgılatıcı faktör (GRF).

Foto-bağlı çapraz bağlama değiştirilmemiş proteinleri (PICUP) metastabil protein karışımları oligomer boyutu dağılımı karakterizasyonu sağlar. Biz üç temsilci amiloidojenik peptidler 40 PICUP uygulama göstermektedir - ve 42-amiloid β-protein ve kalsitonin kalıntı formları ve kontrol peptid büyüme hormonu salgılatıcı faktör.

Fotoğraf Bağlı Çapraz Bağlanma Değiştirilmemiş Proteinler (PICUP) amiloidojenik Peptitler Uygulanan

Amyloidojenik proteinlerin toksik oligomerler şeklinde birleşmesi, Alzheimer'dakiler de dahil olmak üzere protein katlanma bozuklukları hastalıklarının patogenezinde temel bir olaydır...

Amiloidojenik proteinlerin çözünür oligomerlerininle sitotoksik özellikleri aracılığıyla nörodejeneratif hastalıkların patofizyolojisinin temelini oluşturduğuna inanılmaktadır. Bu oligomerler, çözelti halindeyken sürekli olarak oluşup ayrışırlar. Bu durum, söz konusu sorunu giderecek inhibitör moleküller geliştirmek için kritik öneme sahip olan yapısal çalışmaları zorlaştırmaktadır.Modifiye edilmemiş proteinlerin veya pickup'ın foto-indüklenmiş çapraz bağlanması kullanılır. Bu yöntem, disagrege edilmiş ve çözünür hale getirilmiş amiloidojenik peptidlerin çapraz bağlayıcı reaktiflere maruz bırakılmasını ve dimerlerin ve oligomerlerin kovalent olarak bağlanması için bir saniyelik yoğun bir ışık darbesini içerir. Oligomer boyut dağılımı daha sonra standart biyokimyasal tekniklerle analiz edilebilir.Merhaba, ben Los Angeles'taki California Üniversitesi Nöroloji Bölümü'ndeki Batan Laboratuvarı'ndan Far Rahimi. Ben de Bean Laboratuvarı'ndan Al Mai. Bugün size modifiye edilmemiş proteinlerin foto-indüklenmiş çapraz bağlanması prosedürünü göstereceğiz.Laboratuvarımızda, stabilize edilmiş amiloid beta protein oligomerleri üretmek ve yüksek dağılımlı oligolar üzerindeki yapısal modifikasyonları incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Bu prosedür, başlangıçta kararlı protein komplekslerini incelemek amacıyla Fancy ve Coate tarafından yayınlanmıştır. Yöntem daha sonra Battan ve diğerleri tarafından, beta-amiloid ve alfa-sinüklein dahil olmak üzere metastabil amiloid protein düzeneklerinin kantitatif çalışması için uygulanmıştır.Öyleyse başlayalım. Protokole başlamak için, buz üzerinde ön soğutulmuş olan HEKZA floroisopropanol veya HFIP, 1 ila 200 µg liyofilize peptit içeren silikon kaplı, düşük absorpsiyonlu bir tüpe, nihai konsantrasyon yaklaşık 0,5 olacak şekilde eklenir.Milimolar HFIP, amiloidojenik peptitlerin agregasyonunu önleyerek sonuçların tutarlılığını artıracaktır. Şimdi peptit tüpünü oda sıcaklığında beş dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.Sonikasyon tamamlandığında, tüpleri hafifçe vorteksleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilmeye bırakın. 30 dakika sonra, peptitleri buz üzerinde bir dakika boyunca soğutun. Soğutulan peptitler artık 10 ila 50 µL'lik alikotlar halinde 0,6 mil düşük adsorpsiyonlu tüplere bölüştürülebilir.Ardından tüpleri kapakları açık şekilde çeker ocağa yerleştirin. HFIP'nin gece boyunca buharlaşmasını sağlamak için, tüplerin içine toz kaçmasını önlemek amacıyla tüp rafını ve Kim wipe'ları sarın. HFIP'nin çoğu buharlaştıktan sonra, tüpler iki saat boyunca vakum altında bir eksoikatöre yerleştirilerek kalan tüm HFIP izleri giderilmelidir.Nihai ürün, tüpler içerisinde ince bir peptit film tabakasıdır. Bu tüpler, eksi 20 veya eksi 80 santigrat derecede aylarca saklanabilir. Çözündürme ve foton çapraz bağlama adımlarına başlamak için, peptit film öncelikle seyreltik sodyum hidroksit çözeltisinde çözülür.Sodyum hidroksit eklendikten sonra, deiyonize su ve ardından fosfat tamponu eklenir; nihai çözelti %45 fosfat tamponu, %45 su ve %10 sodyum hidroksit çözeltisinden oluşmalıdır. Tüpün kenarlarında kalıntı protein filmi kalmışsa, bunu kazıyarak çözeltinin içine aktarın. Bir pipet ucu kullanarak süspanse peptitleri pipetleyip yukarı aşağı hareket ettirin ve ardından bir Sonica su banyosunda bir ila iki dakika boyunca sonikasyon uygulayın.Sonikasyondan sonra, fosfat çözeltisini ekleyin ve pipetle yukarı-aşağı hareketler yaparak karıştırın. Ardından tüpü 16.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi sırasında, kameranızı foto-çapraz bağlama adımları için hazırlayın.Kamera perde gecikmesi bir saniyeye ayarlanmalı ve perde kurulmalıdır. Tüplerin santrifüj işlemi tamamlandığında, şeffaf 0.2 ml PCR tüplerine peptit çözeltisinden 18 µL'lik alikotlar hazırlayın. Bu alikotlar foto-çapraz bağlama işlemi için kullanılacaktır.Çapraz bağlama işleminden hemen önce, negatif kontrol olarak kullanılmak üzere bir miktar peptit solüsyonunu ayırdığınızdan emin olun. Bir mikrolitre amonyum persülfat ve bir mikrolitre rutenyum ekleyin. Şimdi tüpü hızlıca 1,8 M'lık bir cam şişeye ve şişeyi de kamera gövdesinin ön kısmına takılı olan körüğün içine yerleştirin.Kamerayı lens koruyucu ile kapatın ve deklanşöre basın. Örnek şu an bir saniye boyunca ışınlanmaktadır. Daha uzun ışınlama sürelerinde, kapsamlı radikal reaksiyonlar protein degradasyonuna neden olur.Işınlama işleminden sonra, 0,2 mil PCR tüpünü hızla geri alın ve Beta merkaptoetanol içeren, önceden hazırlanmış sayfa örnek tamponundan 10 µL ekleyin. Çapraz bağlı peptitler, -20 °C'de yedi güne kadar saklanabilir. SDS-PAGE, fraksiyonlama ve gümüş boyama öncesinde.Çapraz bağlanmış peptitleri incelemek için rutin SDS-PAGE ve gümüş boyama kullanılabilir; hacimlerin tahmin edilmesinde beş mikrolitre reaksiyon karışımının yaklaşık 130 pikomol peptit vermesi gerekir. Jel elektroforezi ve gümüş boyama işlemleri için Invitrogen'in Xcel Sherlock mini hücre sisteminin kullanılması önerilir. Invitrogen yayını IM 1 0 0 2, no NOx ön dökümlü jel elektroforez kılavuzuna göre, gümüş boyama sonrası SDS-PAGE jelini analiz ettiğinizde, çapraz bağlanmamış kontrol polipeptidi GRF temel olarak monomer şeklinde yürür.Çapraz bağlı GRF, dimerden heksamere kadar uzanan sürekli bir liga dağılımı oluşturur; böylece oligomerlerin görünür bağıl bant yoğunluğu, artan moleküler kütle ile eksponansiyel olarak azalır. Çapraz bağlı olmayan kalsitonin temel olarak monomer ve bir kısmı dimer şeklinde yürür. Çapraz bağlı kalsitonin, bölgede monoton bir eksponansiyel azalıştan güçlü bir şekilde sapan bir liga boyut dağılımı verir.Çapraz bağlanmamış dimerlerin, trimerlerin ve tetramerlerin önceden mevcut olduğunu gösteren monomerden tetramere kadar olan yapı. Beta 40 yalnızca monomer olarak hareket eder; Beta 40 üretilmiş bir örnek alınmıştır. Tüm ligandlar, monomerden tetramere kadar yaklaşık olarak benzer bant yoğunlukları göstermekte, bunu daha yüksek mertebeli tüm ligandların bolluğundaki bir azalma takip etmektedir.Çapraz bağlanmamış A beta 42 ağırlıklı olarak iki bant oluşturur: bir monomer bandı ve bir trimer-tetramer bandı. Trimer-Tetramer Bandı, SDS çapraz bağlanması tarafından oluşturulan bir artefaktır.Beta 42, iki gruptan oluşan belirgin bir oligomer boyut dağılımı göstermektedir. Monomerden trimer'e kadar olan ilk grup, oligomer derecesi arttıkça azalan bir yoğunluk sergilemektedir. İkinci grupta ise tetramer ile heptamer arasında, pentamer ve heksamer'de maksimuma ulaşan, çan benzeri bir dağılım gözlemlenmektedir.Bu prosedürü kullanarak proteinlerin pika ile nasıl çapraz bağlanacağını gösterdik. Amiloidojenik proteinler kullandığımızda, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için preparatların agregat içermediğinden emin olmamız gerektiğini unutmamak önemlidir. Burada gösterilen koşullar ve deneyler, ilgilenilen lizatlara göre deneysel olarak modifiye edilebilir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, toplama deneyini kullanırken başarılar dileriz.

photo-induced-cross-linking-unmodified-proteins-picup-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Amiloid beta-Protein, Alzheimer hastalığının etkeni Aptamers Seçimi

Proteinler ya doğal bir yapıyı benimseyebilir ya da çözünmeyen amiloid'e yanlış katlanabilir. Yanlış katlanma yolunu destekleyen koşullar, farklı tipte amiloid fibrillerin oluşumuna yol açar. Burada açıklanan yöntemler, doğal proteinlerin in vitro olarak amiloid'e hızlı bir şekilde dönüştürülmesine izin verir.

İn vitro Yerli Proteinlerden Hızlı Amiloid Üretimi

Hücre yüzey proteinlerinin nakil nispeten kolay çalışılan birlikte, hücre içi proteinlerin kaçakçılığı görselleştirme çok daha zordur. Burada, biz fotoaktıfleştırılebılır GFP içeren yapıları kullanmak ve doğru aşağı akım bölmelerine Golgi aygıtı gelen amiloid öncü proteinin izleyin ve açıklığını takip etmek bir yöntem ortaya koymaktadır.

Photoactivatable GFP ile APP Hücre içi Ticareti Görüntüleme

Amiloid-β (Aβ) hayvan modeli tanımlanmış bir miktar ve Aβ parçalarının türlerinin yönetimini sağlayan ve her çalışma grubu içinde bireysel farklılıkları azaltır -injected. Bu protokol, normal farelerde Alzheimer-benzeri davranış bozukluğu üretimini sağlayan, stereotaktik araçlar olmaksızın Aβ intraserebroventriküler (ICV) enjeksiyonu anlatılmaktadır.

Normal Farelerde Amiloid-β Peptitler intraserebroventriküler enjeksiyon Akut Alzheimer gibi Bilişsel Açıkları tetikleyebilecek

Bu yazıda oligomer oluşturabilen yüksek saflıkta amiloid beta 42 (Aβ42) ve amiloid beta 40 (Aβ40) peptidler, veren bir özel HPLC arıtma protokolü sunduk. Amiloid P Alzheimer hastalığında rol yüksek çekiş eğilimli hidrofobik peptittir. peptid amiloidojenik doğası onun saflaştırma bir meydan okuma yapar.

Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,

Amiloid birikimi farklı hastalıklar özelliğidir ve birçok farklı organları afflicts. Bu kağıt Işıksaçan konjuge oligothiophene floresan Floresans mikroskobu teknikleri ile birlikte boyama uygulaması açıklanır. Bu boyama yöntemi algılama ve klinik ve bilimsel kurulumları protein toplamları keşfi için güçlü bir araç temsil eder.

Amiloid doku Imaging ile Işıksaçan konjuge Oligothiophenes Hyperspectral tarafından Confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu görüntüleme lekeli

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Bu iletişim kuralı bir sentetik peptid vitro üzerinden Aβ reaksiyonlar hazırlamak için ve göreli Aβ oligomer miktarda analiz kurutma bir nokta tarafından değerlendirmek için açıklar.

A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi

1,2-dithiolane sentezi için bir protokol peptid ve peptid kendinden montajlı kaynaklanan supramolecular yapıları karakterizasyonu değiştiren.

1,2-Dithiolane malzemelerin ve kendi kendine montaj peptidler değiştirilme tarihi

Bu makale, polarizasyona duyarlı iki foton mikroskobunun etiketsiz amiloid üst yapıları-sferülitler içindeki yerel organizasyonu karakterize etmek için nasıl uygulanabileceğini açıklamaktadır. Ayrıca, numunenin nasıl hazırlanacağını ve ölçüleceğini, gerekli kurulumun nasıl bir araya getirileceğini ve amiloid fibrillerin yerel organizasyonu hakkında bilgi edinmek için verilerin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Etiketsiz amiloid yapısal karakterizasyonu için polarizasyona duyarlı iki foton mikroskobu

Burada, amiloid beta 1-40 (Aβ 1-40) kaplı 20 nm altın agregalarının yarı tersinir kendi kendine montajını tanımlayan sistematik bir yöntem sunuyoruz. Peptitler arasındaki nano boyuta bağlı yarı tersinir ağ, spesifik amino asitler veya Aβ 1-40 monomerinin bölümleri ile ilişkilendirildi.

Amiloid Beta 1-40 Kaplı Altın Kolloidlerin pH'a Bağlı Tersinir Kendi Kendine Montajının Karakterizasyonu

Öğrenin amiloidojenik peptitlerde oligomer boyut dağılımını analiz etmek için PICUP yöntemini. Bu teknik nörodejeneratif hastalıklarda protein yapısını incelemeye yardımcı olur.

Fotoğraf Bağlı Çapraz Bağlanma Değiştirilmemiş Proteinler (PICUP) amiloidojenik Peptitler Uygulanan

Daha fazla video keşfet