Name: Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Öğrenin Drosophila larvalarının sinir-kas kavşağı diseksiyonu için standart bir protokol. Bu yöntem, immünohistokimya ve görüntüleme için gerekli olan sinirbiyolojik araştırmalarda tutarlı sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Başlamadan önce <ol><li> Bütün kültürler, 25 ° C&#39;de yetiştirilebilir. </li><li> HL3.1 diseksiyonu tampon önceden hazırlanmış olabilir. HL3.1 50 ml&#39;lik bir kısım alın ve buz üzerinde tutmak. </li><li> HL3.1 15 ml taze% 3.5 Formaldehit hazırlayın. Buz üzerinde tutun. </li></ol> Larvaların Diseksiyon <ol><li> Diseksiyon plaka HL3.1 soğuk bir damla koyun. Bu daha kolay çalışmak için hayvan kurutma ve sersemletici hayvan tutacaktır. </li><li> Uzun forseps kullanarak, dolaşıp üçüncü instar larva seçin ve HL3.1 açılan yerleştirin. </li><li> Öncelikle, bir minutien pin kavramak için kısa forseps kullanabilir. Posterior spiracles arasında pin yerleştirin. Hayvan genellikle kendini germe ve ağız kanca yakın larva başkanı kare bir pin yerleştirmek için daha kolay hale pin sürünerek çalışacağız. Hayvan boyuna uzat. Bu kesim sırasında elde edebilirsiniz maruz kalan vücut duvarının miktarını en üst düzeye çıkarmanıza yardımcı olacaktır. Not: ilk baş pin seçerseniz, pim etrafında hayvan vücudu sarmak ya da zor pin ileri ve geri vücut kırbaç. Genellikle HL3.1 kaldırılması ve yine çarpıcı yeni bir soğuk damla hayvan koyarak bu sayaç. Ambidextrous bilim adamı aynı zamanda sadece hayvan yakala ve bir yerde tutun. </li><li> Yaylı makas kullanma larva dorsal tarafta posterior pin sadece ön yatay bir kesi yapmak. Kesi içine bir bıçak, makas ve larva rostral sonuna doğru dorsal orta hat boyunca dikey bir kesim yapmak. Hayvan kürsüden, sol ve sağ pin yatay kesiler olun. Not: bitmiş sonucu rostro ekseni boyunca larva dorsal tarafında I gibi görünmelidir. </li><li> Organları çıkarın. Larva HL3.1 birkaç ek damla koyarak başlayın. Bu organlar vücudun çok daha kolay bunları kaldırmak için izin float sağlayacaktır. İlk olarak, trakeal sistemini kaldırmak. İkincisi, organların geri kalanı kapmak için forseps kullanabilir ve bunları kaldırmak. </li><li> 3. adımı sırasında vücut duvarında, bir sol flep ve sağ flep yaptı. Pin vücut duvarı hem yatay hem de dikey olarak uzatmak için emin olmak için bir saat sipariş kapakları. </li></ol> Tespit 25 dakika HL3.1% 3.5 formaldehit her hayvan sabitleyin. 5 dakika boyunca iki kez HL3.1 hayvan yıkayın. Depolama Pimleri çıkarın ve 1,5 ml tüp 1X PBS içeren bir larva transferi. Erimiş floresan etiketlerini kullanarak NMJ görüntü planlıyorsanız, iki gün içinde görüntü hayvanlar. 4 ° C&#39;de bir hafta için disseke larvaları saklayabilirsiniz Temsilcisi sonuçları Uygun bir şekilde diseke Drosophila larva birkaç anahtar bileşenleri vardır. Birincisi, özellikle kaslar, kasların 4, 6, ve 7 zarar görmemesi için ekstra dikkat etmelisiniz. Bu çalışma için en popüler kas ve zarar görmüş, fileto hazırlık atmak ve başka bir hayvan teşrih. İkincisi, bir hayvan, her bir kas ve NMJ maksimum ayırt edilmesi, böylece gergin olduğunu emin olmalısınız.

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

Bu videoda gösterilen diseksiyon tekniği çeşitli deneysel teknikler Drosophila larvaları hazırlamak için kullanılabilir. Flüoresan protein etiketleri varsa, larva monte ve anında görüntülü olabilir. Aksi takdirde, immün belirli sinaptik bölmeleri işaretlemek için yapılabilir. Buna ek olarak, elektrofizyoloji kolayca nörotransmisyon işleyişini değerlendirmek için disseke larvaları olabilir. Drosophila NMJ temel yapısı ve işlevi aydınlatılan ilk çalışmalarda bu yana büyük bir...

HL3 Diseksiyon Tampon: (mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehaloz, sakaroz, 115 ve 5 Hepes, pH 7.3.<br /<br /&gt; Sylgard Diseksiyon Plaka: yavaşça karıştırın (kabarcıkları önlemek için) bir beherdeki 10:01. Petri kabı (herhangi bir boyutta) içine karışımı dökün. SylGard 37C inkübatör geceleme tedavisi için izin ver.

drosophila larvaların nmj diseksiyon

Drosophila Larval NMJ Dissection

<em&gt; Drosophila</em&gt; Nöromüsküler bileşke (NMJ), sinaptik geliştirme ve plastisite çalışma için kullanılan bir model sistem. Yaygın kullanımı<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor sistemi, yüksek erişilebilirlik nedeniyle. Bu tek hücreli çözünürlük ile analiz edilebilir. Düzenleme periferik vücut duvarı içinde bilinen hemisegment başına 30 kas vardır. Toplam 35 motor nöronların yüksek sadakat olan bir model bu kaslara takın. Moleküler biyoloji ve genetik kullanarak, transgenik hayvanlar veya mutantlar oluşturabilirsiniz. Sonra, bir gelişimsel sonuçları NMJ morfolojisi ve fonksiyonu üzerine çalışma. Çalışma için NMJ erişmek için, her larva dikkatlice incelemek için gereklidir. Bu yazıda, düzgün bir şekilde incelemek için nasıl gösterilmektedir<em&gt; Drosophila</em&gt; Vücut duvarı olduğu gibi bırakarak, tüm iç organları kaldırarak NMJ çalışma larvaları. Bu teknik, görüntüleme, immünhistokimya, ya da elektrofizyoloji larvaları hazırlamak için uygundur.

Bu protokol incelemek için nasıl gösterir<em&gt; Drosophila</em&gt; Immünhistokimya ve / veya nöromüsküler kavşak görüntüleme için hazırlık larvaları.

Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

Drosophila nöromüsküler kavşağı (NMK), sinaptik gelişim ve plastisitenin incelenmesinde kullanılan yerleşik bir model sistemdir. Yaygın kullanımı...

Bu prosedür, üçüncü instarda bir larvanın diseksiyon plakasına yerleştirilmesiyle başlar. Larvanın arka ve ön uçlarına iğneler yerleştirilir. Larvayı açmak için makas kullanılır ve iç organları çıkarmak için pens kullanılır.Son olarak, fiksasyon sırasında gergin tutmak amacıyla larva vücut duvarının her köşesine dört adet daha iğne yerleştirilir. Merhaba, ben Columbia Üniversitesi Hekimler ve Cerrahlar Koleji Fizyoloji ve Selüler Biyofizik Bölümü'ndeki Brian McCabe Laboratuvarı'ndan Jonathan Brent. Bugün size drosophila larvası ve MJ diseksiyon prosedürünü göstereceğiz.Laboratuvarımızda nöromüsküler kavşak sinaptik gelişimini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Drosophila larvalarında, her hemi segmentte, periferik vücut duvarı içindeki düzenlemeleri bilinen 30 kas bulunur.Toplam 35 motor nöron, bu kasları oldukça stereotipik bir örüntüyle innerve eder. Nöromüsküler kavşağa veya NMJ'ye erişmek için, her bir larvanın uygun bir disseksiyonla dikkatlice diseke edilmesi gerekir. NMJ; görüntüleme, immünohistokimya veya elektrofizyoloji için kullanılabilir.Prosedüre, bir diseksiyon plakasına bir damla HL 3.1 tamponu koyarak başlayın. Tampon önceden hazırlanmış ve buz üzerinde soğutulmuş olmalıdır. Büyük SS pensleri kullanarak vialin kenarından gezinen bir third end star larvasını dikkatlice seçin.Hareket, larvanın pupasyona girmediğini gösterir. Larvayı, sırt kısmı yukarı bakacak şekilde diseksiyon plakası üzerindeki tampon damlasına yerleştirin. Soğuk tampon, larvayı anestezi edecek ve hareketsiz tutacaktır. Bir pens kullanarak, posterior sferlerin arasına bir minare iğnesi yerleştirin; ardından, larva gerginleşsin ve açılmaya hazır hale gelsin diye, koyu renkli ağız kancalarının yakınına ikinci bir iğne yerleştirin.Yaylı makas kullanarak, larvaların posterior ucuna doğru küçük bir yatay insizyon yapın. Makasın bir ucunu insizyona yerleştirin ve larvanın anterior ucuna doğru boyuna bir kesi yapın. Ardından, larvaların anterior ucunda, iğnenin soluna ve sağına yatay insizyonlar yapın.Bağırsak gibi organları çıkarmak için hayvana birkaç damla HL 3.1 tamponu ekleyin; bağırsak ve diğer organlar çözeltinin yüzeyine çıkacak ve pens kullanılarak gövdeden uzaklaştırılabilir. Ayrıca, trakeal sistemi de diğer organlarla birlikte çıkarın. Şimdi, insizyonlarla oluşturulan flepleri iğnelerle geriye sabitleyerek vücut iç kaslarını açığa çıkarın.Vücut duvarlarının yatay ve dikey olarak iyice gerildiğinden emin olun. Kapakçıklar iğnelenirken, kalan tüm organ parçalarını temizleyin ve bir kez yıkayın.Taze HL 3.1 tamponu eklendikten sonra, larva artık 1x PBS içinde %3,5'e seyreltilmiş taze hazırlanmış formaldehit ile fikse edilmeye hazırdır; larvaları ve fiksatifi tamamen daldırıp 25 dakika bekleyin. Fiksasyon süresi dolduğunda, larvaları üç dakika boyunca iki kez HL 3.1 tamponu ile yıkayın. Pinleri dikkatlice çıkarın ve gerekirse larvaları 1x PBS içeren 1,5 ml'lik tüplere aktarın.Larvalar dört derece Celsius'ta iki güne kadar saklanabilir. En iyi sonuçlar için diseke edilmiş larvaları hemen kullanın. Doğru şekilde diseke edilmiş bir drosophila larvasının birkaç temel bileşeni vardır.İlk olarak, özellikle altı, yedi ve dört numaralı kaslara zarar vermemeye dikkat edin. İkinci olarak, hayvan düzgünce gerilmelidir. Aksi takdirde, nöromüsküler kavşağa erişilemeyebilir veya bu yapı ayırt edilemeyebilir.Burada uygun şekilde diseke edilmiş bir larva görebilirsiniz. NMJ açıkça görünür durumdadır ve sistem artık deneyler için hazırdır. Nöromüsküler kavşağı incelemek için özofageal larvanın nasıl diseke edileceğini size göstermiş olduk.Bu prosedür gerçekleştirilirken, kasların bütünlüğünün korunması önemlidir. Kaslar hasar görürse, incelenecek nöromüsküler kavşaklar kalmayacaktır. İşlem bu şekildedir.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yazıda, merkezi sinir sistemi incelemek için nasıl üçüncü instar Drosophila larvaları göstermektedir.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

Bu protokol disseke Drosophila larva immünohistokimya nasıl gerçekleştirileceği göstermektedir.

Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

Drosophila melanogaster larvaları larva segmental sinirler içinde aksonal taşıma mekanizmalarının araştırılması için ideal bir model sistem sağlar. Bu yordamı kullanarak, 3. instar larvaları çeşitli mutasyonları taşıyan vahşi tip larva mukayese edilebilir.

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Bu protokol, bozulmamış anesthetization ve görüntüleme için güvenilir bir yöntem...

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

In situ yama kelepçe kayıtları bozulmamış devresi nöronların elektrofizyolojik karakterizasyon için kullanılır. MSS küçük ve sağlam bir kılıf ile çevrili olduğundan Drosophila genetik model yama klemp ise zordur. Bu makale sonraki yama klemp kayıtları için kılıf ve temiz nöronlar kaldırmak için prosedürü açıklar.

Hazırlanması<em&gt; Drosophila</emIçin&gt; Orta Nöronlar<em&gt; In situ</em&gt; Patch Sıkma

Bu videoda, Drosophila larvaları sinir lifleri, hücre zarı lipidlerine bağlanan FM boyasına daldırılır. Emme mikroelektrodu ve elektrik darbeleri, FM boyasını yeni oluşan endositik veziküllere dahil ederek endositoz sürecini uyarır. Nörotransmisyonun presinaptik aşamalarını görselleştiren bu yöntem, sinaptik fonksiyonu ve nörotransmitter salınımını incelemek için yararlıdır.

Drosophila Larva Sinir Hücrelerinde Mikroelektrot Aracılı FM Boya Yükleme ve Boşaltma

Hücre içi organellerin morfolojisi, büyüklüğü ve konumu evrimsel olarak korunur ve işlevlerini doğrudan etkiliyor gibi görünmektedir. Bu süreçlerin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak, modern biyolojinin önemli bir hedefi haline gelmiştir. Burada, bu çalışmaların nicel tekniklerin uygulanmasıyla nasıl kolaylaştırılabileceğini gösteriyoruz.

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Burada, Drosophila larva'daki segmental sinirlere zarar vermek için basit ve yaygın olarak erişilebilen bir yöntem tarif ediyor ve üçüncü instar larva nöromüsküler kavşakta (NMJ) motor nöronların nörodejenerasyonunu görselleştirip sayısallaştırıyor.

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Nöron Dejenerasyonu

Nöromüsküler kavşağın mimarisini koruyan ve yetişkin Drosophila bacağındaki motor nöronların ayrıntılı bir immünostokimyasal çalışmasını sağlayan bir diseksiyon tekniğini tarif ediyoruz.

Tanımlanmış Bir Motor Nöron için Nöromüsküler Kavşaktaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Drosophila Yetişkin Bacağının Diseksiyonu ve İmmünhistokimyası

Burada, nöromüsküler kavşaklar ve kas hücrelerindeki mikrotübül ağlarını görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Drosophila melanogaster'in güçlü genetik araçlarıyla birleştiğinde, bu protokol, sinir sistemindeki mikrotübül ağı düzenleyici proteinlerin rolü için genetik taramayı ve mikrotübül dinamiği analizini büyük ölçüde kolaylaştırır.

Mikrotübül Ağını Görselleştirmek için Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşak ve Kas Hücrelerini Kullanma

Öğrenin Drosophila larvalarının sinir-kas kavşağı diseksiyonu için standart bir protokol. Bu yöntem, immünohistokimya ve görüntüleme için gerekli olan sinirbiyolojik araştırmalarda tutarlı sonuçlar sağlar.

Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

Daha fazla video keşfet