Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya
March 28th, 2009
Bu protokol disseke Drosophila larva immünohistokimya nasıl gerçekleştirileceği göstermektedir.
Bu protokol, sinaps gelişiminde rol oynayan proteinleri görselleştirmek için diseke edilmiş gsof larvaları üzerinde immünohistokimyasal boyamanın nasıl yapılacağını açıklar. Prosedür boyunca primer ve sekonder antikor inkübasyonu için ve ayrıca yıkama adımları için 1.7 mil'lik bir tüp kullanılır. Larvalar daha sonra bir işleme slaytına aktarılır, burada numuneleri görüntülemek için bir exacto bıçağıyla kesilir ve bir damla solma önleyici reaktife taşınır.
Bir montaj kızağında, son olarak oje ile sürgüye bir kapak fişi kapatılır. Merhaba, ben Columbia Üniversitesi Doktorlar ve Cerrahlar Koleji Fizyoloji ve Hücresel Biyofizik Bölümü'nden Brian McCade'in laboratuvarından Jonathan Brent. Bu prosedürü, nöromüsküler kavşakta sinaps oluşumunun genetik düzenlemesini incelemek ve bir düğüm geliştirmek için kullanıyoruz.
Öyleyse başlayalım. Gsof larva n MJ üzerinde immünohistokimya yapmadan önce, önce larvaları düzgün bir şekilde inceleyin. Bu prosedürü öğrenmek için, beraberindeki Drosophila Larva N MJ Diseksiyonu başlıklı video makalesini izleyin.
Prosedüre başlamak için üç yeni çözelti hazırlayın. İlk olarak, taze yapılmış PBS'ye deterjan ekleyerek PBT Çözeltisi yapın. İkinci olarak, sığır serum albümininden bir alikot alın ve bir PBT çözeltisine ekleyin.
PBTB'yi üçüncü yapmak için, bir aqua normal keçi serumu alın ve PBTN solüsyonu yapmak için PB TB solüsyonuna ekleyin. Bu çözeltileri hazırladıktan sonra, larvaları bir mil PBT içeren 1.5 mil'lik bir tüpe aktarın. Bu ilk yıkama.
Her yıkama, larvaların daldırıldığı çözeltinin değiştirilmesini ve daha sonra larvaların yavaşça dönen bir mutatör karıştırıcı üzerinde inkübe edilmesini içerir. Larvaları tüpten tüpe aktarmayın çünkü bu onlara zarar verir. Bu ilk yıkama oda sıcaklığında 15 dakikadır.
15 dakika karıştırdıktan sonra, PBT'yi bir pipet kullanarak taze PBT ile değiştirin ve larvaları 15 dakika daha yıkayın. Yıkama solüsyonlarını değiştirirken, PBT yıkamaları tamamlandığında larvalara zarar vermemek için daima dikkatli olun. Larvaları PBTB'de 30 dakika yıkayın.
Bu yıkamayı taze solüsyonla 30 dakika daha tekrarlayın. PBTB ile yıkama tamamlanmıştır. Yıkama başına 15 dakika boyunca PBTN ile iki kez yıkayın.
İkinci yıkama aşaması sırasında, primer antikor, istenen çalışma konsantrasyonunda PBTN içinde seyreltilebilir. Yıkamayı takiben, larvaları bu antikor karışımında bir saat boyunca oda sıcaklığında hafifçe karıştırarak veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, birincil antikor solüsyonunu sifonlayın ve kalan antikoru çıkarmak için larvaları PBTB ile birkaç kez hızlıca durulayın.
Larvaları bir sonraki antikor inkübasyonuna hazırlamak için, PBTB'de bir kez 15 dakika yıkayın ve PBTN ile iki kez 30 dakika yıkayın. PBTN'deki ikincil antikoru istenen çalışma konsantrasyonunda seyreltin ve larvaları bu karışımda bir buçuk saat inkübe edin. Oda sıcaklığında, ışığa maruz kalmayı önlemek ve dördüncü kat ağartmayı en aza indirmek için larvaları örttüğünüzden emin olun.
Bir buçuk saat sonra, ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve larvaları PBTB'de birkaç kez daha durulayın. Şimdi larvaları PBTV'de iki kez 15 dakika yıkayın. Larvaların kalan tüm yıkama ve depolanması minimum ışığa maruz bırakılarak yapılmalıdır, bu nedenle onları kapalı tuttuğunuzdan emin olun.
Larvaları 1.5 mil tüpten bir cam işleme slaytında PBT'ye aktarın. Larvalar artık lekeli larvaları 65 santigrat derecede bir su banyosunda iki ila üç dakika boyunca ısı uzun süreli altın çözeltisini monte etmek için montaja hazırdır. Sonra bir Eloqua alın ve 50 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısı bloğunda tutun.
İşleme slaydına biraz PB TB uygulayın. Larvaları PB tb'ye aktarın. Larvaları, 16 numaralı bıçaklı bir exacto bıçağı kullanarak kütikül tarafı aşağı gelecek şekilde döndürün, larvaların başlarını ve kuyruklarını kesin.
Bu adım için bir tıraş bıçağı da kullanabilirsiniz. Şimdi montaj sürgüsünü, ısıtılmış alikottan 40 mikrolitre uzun süreli altın içeren temiz bir sürgüye hazırlayın ve temiz forseps ile etrafına yayın. Forseps kullanarak.
Hazırlanan larvaların altı ila sekizini işleme slaytından montaj slaytına dikkatlice aktarın. Onları aynı yönde tutmaya çalışın ve larvaları monte etmek için kütikül taraflarını aşağıda tutun. Uzun süreli çözeltinin üzerine bir örtü fişi bırakın.
Uzun havuzun çevresinde bir kenara yerleştirin ve numuneleri örtmek için kaymayı dikkatlice bırakın. Kapak kaymasının kenarlarını en sevdiğiniz kalın, ucuz oje rengiyle slayta kapatın. Slaytı en az üç saat kurumaya bırakın.
Slaytlar hazırlandıktan hemen sonra yalnızca bir kez görüntülenecekse, uzun süreli altın çözeltisi gliserol ile ikame edilebilir. Daha sonra oje ve gliserolün kuruma süresi, herhangi bir boyama protokolü ile üç saatin aksine sadece yaklaşık 10 dakikadır. Amaç, düşük arka planla birleştirilmiş yüksek özgül sinyaldir.
Bu, yüksek kaliteli antikorlar kullanılarak ve blokaj ve yıkama adımlarının eksiksiz bir şekilde gerçekleştirilmesiyle elde edilir. Bu görüntüler, vahşi tip sinapsların yanı sıra, hüsnükuruntu veya cadı mutantı olarak bilinen mutasyona uğramış bir tip iki BMP reseptörünü ifade eden bir sinek suşundan gelenleri gösterir. Nöronal zar, at turpu peroksidaz karşı bir antikorla maviye boyanır.
Kırmızı ile gösterilen sinaptik veziküller antis sinaptik antikor ile boyanır. Yeşil renkle gösterilen post sinaps, büyük disklere karşı antikorla boyanmıştır. Bu sonuçlar, tip iki BMP reseptörünün mutasyona uğratılmasının sinaptik bir çalı fenotipi ürettiğini gösterdi.
Bu mutant, BMP'lerin sinaptik terminal buton sayısını düzenleyen retrograd sinyaller olarak kurulmasında anahtardı. Az önce size özofagus larva nöromüsküler kavşağında immünohistokimyanın nasıl yapıldığını gösterdik. Bu prosedürü yaparken.
Maksimum tekrarlanabilirlik ve düşük arka plan sağlamak için prosedürü uygun zamanlama ile yürütmek önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, sinaps gelişimine dahil olan proteinleri görselleştirmek için ayrılmış Drosophila larvalar üzerinde immünohisokimyasal boyama yapılmasına dair bilgi verir. Prosedür, birincil ve ikincil antikor inkübasyonu, yıkama adımları ve görüntüleme için montajı içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- İmmünohistokimya, dokulardaki spesifik proteinleri görselleştirmek için kullanılan bir tekniktir.
- Drosophila larvalar, sinaps gelişimini incelemek için bir model organizma olarak kullanılır.
- Sinaps oluşumunun anlaşılması, sinir gelişimi hakkındaki bilgiler için kritik öneme sahiptir.
- Bu protokol, nöromüsküler kavşakta genetik düzenlemeyi incelemeye yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Sinaps gelişimine dahil olan proteinleri görselleştirmek.
- Sinaps oluşumunun genetik düzenlenmesini araştırmak.
- Nöromüsküler kavşak gelişimi hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Drosophila larvalarının ayrılması.
- Birincil ve ikincil antikorlarla inkübasyon.
- Bağlı olmayan antikorları çıkarmak için yıkama adımları.
- Mikroskobik görüntüleme için spesimenlerin montajı.
Ana Sonuçlar
- Nöromüsküler kavşakta proteinlerin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Sinaps gelişimini etkileyen genetik faktörlere ilişkin bilgiler.
- İmmünohistokimya protokolünün etkinliğinin gösterilmesi.
- Drosophila'daki sinaptik yapıların anlaşılmasına katkıda bulunma.
Sonuçlar
- Protokol, Drosophila'da sinaps gelişimini incelemek için etkilidir.
- İmmünohistokimya, protein lokalizasyonu hakkında değerli bilgiler sağlar.
- Bu yöntem, sinir gelişimi üzerinde daha fazla araştırmaya uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-resolution visualization of synaptic proteins in a genetically tractable model, supporting target validation in neurodevelopmental pathways. By providing quantitative, reproducible imaging of NMJ architecture, it aids in mechanistic de-risking of genetic modifiers prior to mammalian translation. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular perturbations to structural phenotypes at single-cell resolution.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of synaptic protein localization and morphology.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying functional consequences of genetic mutations on NMJ architecture.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by correlating molecular interventions with quantifiable synaptic phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible biological samples suitable for downstream screening applications.
- Quantitative Output: Generates measurable readouts (e.g., bouton number, protein intensity) enabling compound or genetic screen analysis.
- Scalability: Supports multi-sample processing with consistent staining and mounting procedures for platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved synaptic development mechanisms relevant to neurodegenerative and neurodevelopmental disorders.
- Translational Continuity: Bridges genetic findings in Drosophila to preclinical validation through conserved BMP signaling pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by establishing phenotypic rescue or exacerbation in a validated disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing structural validation that complements biochemical and behavioral assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by visualizing synaptic outcomes of genetic perturbations.
- Screening: Enables assay-ready preparations with quantitative imaging outputs for reliable compound or genetic evaluation.
- Analytics: Delivers standardized measurements (e.g., synaptic bouton count, fluorescence intensity) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work via conserved retrograde BMP signaling regulating synaptic growth.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for iterative target validation across multiple genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in synaptic phenotype interpretation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined antibody incubation, washing, and mounting steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage biological risk assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic rescue in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila dissection, immunohistochemistry, and fluorescence microscopy.
- Dependent on antibody quality, blocking efficiency, and light-protected handling during washes and storage.
- Necessitates standardized processing slides, mounting reagents, and sealing techniques to prevent sample degradation.
- Adaptation to other model systems would require validation of antibody cross-reactivity and tissue permeability.
- Practical limitations include tissue fragility during transfer and the need for meticulous washing to minimize background signal.
