Name: Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Öğrenin Drosophila larvalarında immünohistokimya yöntemiyle sinaps gelişimindeki proteinleri görselleştirme tekniğini. Bu protokol nöromüsküler bağlantı araştırmalarında genetik düzenlemeyi incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Başlamadan önce <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: PBT (1X PBS içinde% 0.1 Triton X 100), PBTB (% 0.2 PBT olarak BSA) ve PBTN (2 PBTB% NGS). </li><li> Drosophila larvaları parçalara ayır. Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon bakınız. </li></ol> İmmünohistokimya <ol><li> PBT içeren 1.5 ml tüp larvaları taşıyın. Larvaların PBT 15 dakika boyunca iki kez yıkayın. Not: yıkamak, bir nutator karıştırıcı 1.5 ml tüp yerleştirin. Pippetor ile sıvı çıkarın ve temiz sıvı ile değiştirin. </li><li> PBT çıkarın. 30 dakika boyunca iki kez PBTB yıkayın. </li><li> PBTB çıkarın. 15 dakika boyunca iki kez PBTN yıkayın. </li><li> 1 saat veya gece boyunca 4 º C&#39;de oda sıcaklığında PBTN içinde seyreltilmesi birincil antikor inkübe edin. </li><li> PBTB iki kez durulayın. Not: eklemek yıkama sıvısı ve hızlı bir şekilde kaldırmak için. </li><li> PBTB 15 dakika için iki kez yıkayın. </li><li> PBTN 30 dakika süreyle yıkayın. </li><li> PBTN içinde seyreltilmiş sekonder antikor (konjuge primer antikor birini kullanıyorsanız) inkübe edin. </li><li> Kalay ve oda sıcaklığında 1,5 saat süreyle inkübe Kapak. </li><li> PBTB iki kez durulayın. </li><li> PBTB ile 15 dakika boyunca iki kez yıkayın. </li><li> Montaj geçin. </li></ol> Montaj Not: örnekleri hemen görüntülü edilecektir gliserol Dağı. Altın Prolong Dağı örnekleri görüntüleme önce saklanabilir (bir haftadan fazla) veya numune birden çok kez görüntülenmiş olması gerekir. Kullanmak için, 2-3 dakika süreyle 65 º C su banyosunda uzatmak bir şişe yerleştirin. Altın Prolong bir kısım atın ve 45-50 º C&#39;de bir ısı bloğu üzerinde tutmak <ol><li> PBT bir saat cam vitray preparatlarıyla dökün. </li><li> Işlem için temiz bir cam slayt bazı gliserol koyun. </li><li> Forseps kullanarak bir köşesinde saat camı onları toplama, işleme slayt hayvanların hareket ettirin. Onlar aşağı manikür tarafında olduğundan emin olun. </li><li> Işleme cam slayt taze bir jilet ile baş ve kuyruk çıkarın. # 16 bıçak ile bir exacto-bıçak, bunun için iyi çalışır. </li><li> Başka bir slayt (slayt montaj), gliserol küçük bir damla koymak / temiz forseps ile uzatmak ve yaymak. </li><li> Onlara ters özen, kendi kenarına montaj slayt disseke hayvanların hareket ettirin. Aynı yönde satır mount deneyin. Mount slayt başına 6-8 hayvan. </li><li> Bir kapak kayma Prolong / gliserol bir kenar yerleştirerek ve yavaşça serbest bırakın. </li><li> Tırnak cilası ile slayt Seal. Not [vernik kuruyana kadar görüntü vermeyin. Bu genellikle on dakika sürer. Uzatmak altın monte örnekleri için, slaytlar, mühürleme ya da görüntüleme en az üç saat önce kurumasını bekleyin.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

NMJ görselleştirme sağlar çünkü immünhistokimyasal (İHK) NMJ biyoloji çalışması için hayati önem taşımaktadır. Bu nöronal membran (örneğin, HRP), presynapse (örneğin, CSP, SYT) ve / veya postsynapse (örneğin, DLG) tanıyan antikorlar kullanılarak yapılır. Sinyal molekülleri, yapısal protein, ya da ilgi roman proteinlerin de lekeli olabilir. Sonra, genler mutasyona uğramış veya missexpressed ve İHK sinaptik yapısı ve / veya nöronal sinyal pertürbasyon tespit edilebilir. Drosophila NMJ...

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Işık Kaynağı KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS Pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Adams&amp;#8482; Nutator Karıştırıcı</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>No.1 Hassas bıçak</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>No. 16 Bıçak uçları</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila larvaların nmj İmmünohistokimya

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

<em&gt; Drosophila</em&gt; Nöromüsküler bileşke (NMJ), sinaptik geliştirme ve plastisite çalışma için kullanılan bir model sistem. Yaygın kullanımı<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor sistemi, yüksek erişilebilirlik nedeniyle. Bu tek hücreli çözünürlük ile analiz edilebilir. Düzenleme periferik vücut duvarı içinde bilinen hemisegment başına 30 kas vardır. Toplam 31 motor nöronların yüksek sadakat olan bir model bu kaslara takın. Moleküler biyoloji ve genetik kullanarak, transgenik hayvanlar veya mutantlar oluşturabilirsiniz. Sonra, bir gelişimsel sonuçları NMJ morfolojisi ve fonksiyonu üzerine çalışma. İmmünohistokimya NMJ bileşenleri net görüntü için de kullanılabilir. Bu makalede, görselleştirmek için antikor boyama nasıl kullanılacağını göstermek<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva NMJ.

Bu protokol disseke Drosophila larva immünohistokimya nasıl gerçekleştirileceği göstermektedir.

Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

Drosophila nöromüsküler kavşağı (NMK), sinaptik gelişim ve plastisitenin incelenmesinde kullanılan yerleşik bir model sistemdir. Yaygın kullanımı...

Bu protokol, sinaps gelişimiyle ilişkili proteinleri görselleştirmek için diseke edilmiş gsof larvalarında immünohistokimyasal boyamanın nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır. Primer ve sekonder antikor inkübasyonlarının yanı sıra yıkama basamakları boyunca 1,7 ml'lik bir tüp kullanılır. Larvalar daha sonra, bir exacto bıçağı ile düzeltildikleri bir işlem lamına aktarılır; örneklerin görüntülenmesi için bunlar bir damla solma önleyici (anti-fading) reajene taşınır.Bir montaj lamı üzerinde, lamel nihayet oje ile lama sabitlenir. Merhaba, ben Columbia Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji ve Hücresel Biyofizik Bölümü'nde Brian McCade'in laboratuvarından Jonathan Brent. Bu prosedürü, nöromüsküler kavşaktaki sinaps oluşumunun genetik düzenlemesini ve gelişen bir düğümü incelemek için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. gsof larva n MJ üzerinde immünohistokimya gerçekleştirmeden önce, larvaları uygun şekilde disseke edin. Bu prosedürü öğrenmek için, Drosophila Larva N MJ Dissection başlıklı beraberindeki video makaleyi izleyin.Prosedüre başlamak için üç taze çözelti hazırlayın. İlk olarak, taze hazırlanmış PBS'ye deterjan ekleyerek PBT Çözeltisi hazırlayın. İkinci olarak, sığır serum albümini alikotunu alın ve bunu bir PBT çözeltisine ekleyin.PBTB hazırlamak için, normal bir keçi serumu alıp PBTN çözeltisi oluşturmak üzere bunu PB TB çözeltisine ekleyin. Bu çözeltileri hazırladıktan sonra, larvaları 1 mL PBT içeren 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Bu, ilk yıkamadır.Her yıkama işlemi, larvaların içinde bulunduğu solüsyonun değiştirilmesini ve ardından larvaların yavaşça dönen bir mutator mikserde inkübe edilmesini içerir. Larvalara zarar vereceği için onları tüpten tüpe aktarmayın. Bu ilk yıkama, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca uygulanır.15 dakikalık karıştırmanın ardından, bir pipet kullanarak PBT'yi taze PBT ile değiştirin ve larvaları 15 dakika daha yıkayın. Yıkama solüsyonlarını değiştirirken, larvalara zarar vermemeye her zaman dikkat edin. PBT yıkamaları tamamlandığında, larvaları 30 dakika boyunca PBTB içinde yıkayın.Bu yıkama işlemini taze çözelti ile 30 dakika daha tekrarlayın. PBTB ile yıkama işlemi tamamlanmıştır. PBTN ile her yıkama 15 dakika sürecek şekilde iki kez yıkayın.İkinci yıkama adımı sırasında, primer antikor istenen çalışma konsantrasyonunda PBTN içerisinde seyreltilebilir. Yıkamanın ardından, larvaları bu antikor karışımında, oda sıcaklığında hafifçe karıştırarak bir saat boyunca veya dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, primer antikor çözeltisini sifonla çekin ve kalan tüm antikorları temizlemek için larvaları PBTB ile birkaç kez hızlıca durulayın.Larvaları bir sonraki antikor inkübasyonuna hazırlamak için, bir kez 15 dakika boyunca PBTB ile yıkayın ve iki kez 30 dakika boyunca PBTN ile yıkayın. Sekonder antikoru istenen çalışma konsantrasyonunda PBTN ile seyreltin ve larvaları bu karışımda bir buçuk saat inkübe edin. Oda sıcaklığında, ışığa maruz kalmayı önlemek ve dördüncü kat beyazlamasını en aza indirmek için larvaların üzerini örttüğünüzden emin olun.Bir buçuk saat sonra, sekonder antikor çözeltisini uzaklaştırın ve larvaları birkaç kez daha PBTB ile durulayın. Şimdi, larvaları iki kez 15 dakika boyunca PBTV ile yıkayın. Larvaların geri kalan tüm yıkama ve saklama işlemleri ışığa minimum düzeyde maruz bırakılarak yapılmalıdır, bu nedenle larvaların örtülü tutulduğundan emin olun.Larvaları 1,5 ml'lik tüpten cam bir işlem lamı üzerindeki PBT'ye aktarın. Larvalar artık mount işlemi için hazırdır; boyanmış larvaları mount etmek için, larvaları 2 ila 3 dakika boyunca 65 °C'deki bir su banyosunda ısıtılmış altın çözeltisine yerleştirin. Ardından bir Eloqua alın ve bunu 50 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğu üzerinde tutun.Bir işlem lamına bir miktar PB TB uygulayın. Larvaları PB tb'ye aktarın. 16 numaralı bıçağa sahip bir eksaktı bıçağı kullanarak larvaları kütikül tarafı aşağı gelecek şekilde döndürün, larvaların baş ve kuyruk kısımlarını kesin.Bu adım için bir jilet de kullanabilirsiniz. Şimdi, ısıtılmış alikottan 40 µL prolonged gold kullanarak temiz bir lamı hazırlayın ve temiz bir penset yardımıyla yayıştırın. Penset kullanarak.Hazırlanan larvalardan altı ila sekiz tanesini işlem lamından montaj lamına dikkatlice aktarın. Larvaları monte etmek için onları aynı yönelimde tutmaya ve kütikül kısımları aşağıda kalacak şekilde yerleştirmeye çalışın. Uzatılmış solüsyonun üzerine bir kapatma lamelini bırakın.Sürekli havuzun çevresindeki bir kenara yerleştirin ve lamelleri numunelerin üzerini kapatacak şekilde dikkatlice damlatın. Lamelin kenarlarını, tercih ettiğiniz renkte, kalın ve ucuz bir oje ile lamete sabitleyin. Lamelin en az üç saat boyunca kurumaya bırakın.Slaytlar sadece bir kez ve hazırlıktan hemen sonra görüntülenecekse, uzun süreli altın solüsyonu yerine gliserol kullanılabilir. Bu durumda, oje ve gliserolün kuruma süresi, herhangi bir boyama protokolündeki üç saatin aksine sadece yaklaşık 10 dakikadır. Amaç, düşük arka planla birleşmiş yüksek spesifik sinyal elde etmektir.Bu, yüksek kaliteli antikorlar kullanılarak ve bloklama ile yıkama adımlarının titizlikle gerçekleştirilmesiyle sağlanır. Bu görüntüler, vahşi tip sinapsların yanı sıra, "wishful thinking" veya "witch" mutantı olarak bilinen mutasyona uğramış tip iki BMP reseptörü eksprese eden bir sinek suşuna ait sinapsları göstermektedir. Nöronal membran, horse radish peroxidase'e karşı bir antikor ile maviye boyanmıştır.Kırmızı ile gösterilen sinaptik veziküller anti-sinaptik antikor ile boyanmıştır. Yeşil ile gösterilen post-sinaps, discs large'a karşı antikor ile boyanmıştır. Bu sonuçlar, tip iki BMP reseptörünün mutasyona uğratılmasının sinaptik gelişme yetersizliği fenotipi oluşturduğunu göstermiştir.Bu mutant, BMP'lerin sinaptik terminal buton sayısını düzenleyen retrograd sinyaller olduğunu belirlemede kilit rol oynamıştır. Size, özofageal larval nöromüsküler kavşakta immünohistokimya işleminin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken.Maksimum tekrarlanabilirlik ve düşük arka plan gürültüsü sağlamak için prosedürü uygun zamanlama ile yürütmek önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

drosophila-larval-nmj-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

Bu protokol, bozulmamış anesthetization ve görüntüleme için güvenilir bir yöntem...

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

Morfolojik analiz Drosophila</emGenetik Mozaikler> Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

Nöron dendritler gibi karmaşık hücre şekilleri, geliştirme sırasında nasıl elde edilir anlamak için, bu, doğru tahlil mikrotübül organizasyonu edebilmek için önemlidir. Burada dendritik arborization duyusal nöron dendritler mikrotübül organizasyonu, trakea, kas incelemek için sağlam bir immünohistolojik bir etiketleme yöntemi açıklamak ve...

Immünohistolojik Duyusal Nöron Dendritler Mikrotübüller Etiketleme, trakea ve kaslar Drosophila Larva Vücut Duvar

Drosophila nöromüsküler kavşağı (NMJ), sinapsların morfolojisini ve işlevini incelemek için bir model olarak kullanılır. Bu video, araştırmacıların NMJ'yi karakterize etmek için ölçtüğü önemli özellikleri açıklamaktadır. Örnek protokol, nicelemeyi otomatik olarak gerçekleştirebilen bir yazılımı gösterir.

Drosophila Nöromüsküler Kavşak (NMJ) Miktar Tayini: Sinaptik Morfoloji ve Fonksiyonu Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Bu protokol Proximity ligasyon Testi Drosophila larva nöromüsküler kavşakta yerinde protein-protein etkileşimleri tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Bu teknikle, Diskler, büyük ve Hu-li tai shao postsinaptik bölgede bir kompleks, daha önce birlikte immunoprecipitation ile tespit dernek kurma gösterilmiştir.

Algılama In Situ Protein-protein kompleksleri Drosophila Larva Nöromüsküler Junction

Hücre içi organellerin morfolojisi, büyüklüğü ve konumu evrimsel olarak korunur ve işlevlerini doğrudan etkiliyor gibi görünmektedir. Bu süreçlerin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak, modern biyolojinin önemli bir hedefi haline gelmiştir. Burada, bu çalışmaların nicel tekniklerin uygulanmasıyla nasıl kolaylaştırılabileceğini gösteriyoruz.

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Bu rapor, Drosophila Larvalarında nöromüsküler kavşakları görselleştirmek için yeni bir numune hazırlama prosedürü sunmaktadır. Bu yöntem, geleneksel yönteme kıyasla örneklerin kıvrılmasını önlemede daha etkilidir ve özellikle Drosophila nöromüsküler kavşak ultrastrüktürel analizi için yararlıdır.

Drosophila larvalarında nöromüsküler kavşakların transmisyon elektron mikroskobu için numune hazırlama sürecinin optimize edilmesi

Burada, nöromüsküler kavşaklar ve kas hücrelerindeki mikrotübül ağlarını görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Drosophila melanogaster'in güçlü genetik araçlarıyla birleştiğinde, bu protokol, sinir sistemindeki mikrotübül ağı düzenleyici proteinlerin rolü için genetik taramayı ve mikrotübül dinamiği analizini büyük ölçüde kolaylaştırır.

Mikrotübül Ağını Görselleştirmek için Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşak ve Kas Hücrelerini Kullanma

Öğrenin Drosophila larvalarında immünohistokimya yöntemiyle sinaps gelişimindeki proteinleri görselleştirme tekniğini. Bu protokol nöromüsküler bağlantı araştırmalarında genetik düzenlemeyi incelemeye yardımcı olur.

Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

Daha fazla video keşfet