Name: İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Öğrenin canlı zebrafish embriyolarında iki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme yöntemini. Bu teknik sinirbilim araştırmalarında akson dinamiklerini uzun süreli gözlemlemeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz zaman atlamalı görüntüleme için montaj tavsiye lokal doku hasarı, Kathy Joubin ve tartışmalar için Sagasti ve Portera-Cailliau laboratuvarları oluşturmak için bir iki foton mikroskop kullanarak ilk tavsiye Mark Terasaki teşekkür ederim. İlk deneyler, AS, MA Woods Hole Deniz Biyolojik Laboratuarlarında Çim Vakfı Üyesi olarak yapıldı. Whitehall Vakfı, Klingenstein Vakfı ve Biyolojik Bilimler Burroughs Wellcome Fonu Kariyer Ödülü hibe Sagasti laboratuarında çalışmalar desteklendi.

Bölüm 1: uzun vadeli görüntüleme Montaj zebrafish embriyolar <ol><li> Gömmek için% 1 düşük erime agaroz çözeltisi hazırlayın. Agaroz DI su ısıtma ile mikrodalga, küçük tüpler ve 42 santigrat derece bir ısıtma bloğu mağaza içine kısım çözülür. </li><li> Görüntüleme için embriyo seçin ve forseps ile yavaşça dışında koryon çekerek chorions kaldırmak. Embriyolar pigment oluşumunu engellediğini, 22-24 saat sonra döllenme (hpf)% 5 PTU Ringers çözüm içine yerleştirilebilir. Bu görüntü netliği artırır ve duyusal akson iki foton axotomies gerçekleştirmek için çok önemlidir. Doğal pigment formu izin verilirse, otoflöresans iki foton mikroskop aksonlar gizler. Çözüm zebrafish için 116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2, ve 5mM Hepes, pH 7,2 zilleri. </li><li> PTU Ringers ~ 0.02% tricaine ekleyerek embriyolar anestezisi. Emin hayvanların devam etmeden önce dokunmaya duyarlı olun. </li><li> Uzun vadeli, bir tarafı cam veya teflon halka vakum gres yağı uygulayarak ve cam kapak slip üzerine sabitleme görüntüleme odasının hazırlayın. </li><li> PTU Ringers aktarmak için özen, damlalıklı cam ile 42 derece agaroz çözüm, tek bir embriyo transfer, sonra hazırlanmış bir kapak kayma üzerine bir damla agaroz embriyo transferi. </li><li> Embriyo agaroz sertleşir olarak istediğiniz gibi yerleştirin. İşiniz bittiğinde görüntüleme odasının kapak kayma üst yüzeyinde olacak şekilde döndürülebiliyorlar, olacağını aklınızda bulundurun. </li><li> Motorlu bir sahne var ve görüntü tek seferde birden fazla yerde, her bir embriyo için 1,4-1,6 adımları tekrarlayın. </li><li> Agaroz tamamen katılaşmasını sağlayın, sonra% 0,02 tricaine PTU Ringers halka doldurun. </li><li> Sonra, bir bardak slayt halka (lar) kapağı halka (lar) diğer tarafında vakum gres yağı uygulayın. Üzerinde mühürlü odası (ler) çevirin. Bu odaların, dik ya da ters mikroskoplar görüntüleme için kullanılabilir. </li></ol> Bölüm 2: Chameleon Ti-Safir lazer ile özel bir inşa edilen iki foton mikroskop kullanan iki foton axotomy <ol><li> Görüntüleme için hazırlayın. Mikroskop altında bir slayt tutucuya monte embriyo (lar) yerleştirin. 40X (0.8 NA) su amacı ile tek embriyo odaklanın. Lazer açın. Biz tekrarlanabilir görselleştirmek ve aşağıdaki parametreleri kullanarak nöronlar ifade GFP zarar başardık. Aksonlar görselleştirmek için zararlı olmayan bir güç, 910 nanometre dalga boyu (nm) ve 30 bir güç (mW listelenen örnek güç miktarı) miliwatt lazer ayarlayın. Görüntüleme yazılımı açın. Karel Svoboda laboratuarı 2, 3 geliştirilen ScanImage Yazılım kullanın. </li><li> Iki foton lazer ile embriyo tarama odağı basın axotomize isteyen akson bulun ve bu akson bir görüntü yakalamak. Ilk ve son Z konumlarının Mark, görüntü elde Z yığınlarının maksimum projeksiyon yapmak. </li><li> Tarama axotomize ve durdurmak için istediğiniz akson şube 70X zoom. Örnek mW, 180 mW zararlı güç artırın ve lazer ile tek bir tarama gerçekleştirebilirsiniz. Biz 1 Z dilim sayısını ayarlama ve &quot;tut&quot; tuşuna basarak bunu. Bu akson koparmak için yeterli olmalıdır. Mikroskop ve deneysel amaç için bu yordamı optimize yöntemleri tartışma bakın. </li><li> Uzaklaştır 30 mW güç azaltmak ve bir görüntü almak. </li></ol> Bölüm 3: İki foton axotomy Zeiss 510 konfokal / iki foton mikroskop <ol><li> Yeri sahneye embriyo monte edilmiş ve 25X su hedefi veya başka uygun bir amacı kullanarak odak noktası haline getirmek. </li><li> Birinden diğerine geçiş yapmak mümkün, böylece iki foton (910 nm) ve multi-track bir ortamda Argon (488 nm) lazerler açın. Her iki lazerler GFP tespit etmek için kullanılsa da, iki-foton emisyon kırmızı ile görüntülendi ve yeşil argon lazer emisyon ikisini ayırt etmek için. </li><li> Argon lazer zarar bir akson tanımlamak için kullanın. Z altında ayarları, ilk ve son optik bölümleri işaretleyin. Konfokal bir görüntü çekmek ve maksimum projeksiyon Z yığını oluşturmak. </li><li> Yaralı akson bölge seçin ve bu bölgede odak noktası haline getirmek. Argon lazer kapatın ve iki foton lazer açın. ~ 9% iletim akson odak hala emin olmak için bir lazer yoğunlukta iki foton örnek tarayın. </li><li> Kırpma aracını satışa sunulacak, böylece &quot;dur&quot; düğmesine tıklayın. Ilgi alanı yakınlaştırmak için kırpma kullanın. Genellikle ~ 70X (zoom &quot;mode&quot; sekmesi altında kontrol edilebilir) yakınlaştırma. &quot;Kanallar&quot; sekmesi altında iki-foton ~% 15-20 iletim% 9 iletim yoğunluğunu değiştirebilirsiniz. </li><li> Bir akson sever, fazla zarar vermemek için stop düğmesine basın ve sonra yaklaşık 1 saniye ve için &quot;hızlı XY&quot; düğmesini etkinleştirin. Prosedür çalıştı akson dağılmış enkaz olarak görülmelidir. </li><li> Emin olmak için akson488 nm argon lazer dönmek hasar gördü, bir başka konfokal görüntü çekmek ve maksimum projeksiyon oluşturmak. </li></ol> Bölüm 4: Zeiss LSM 510 Konfokal zaman atlamalı görüntüleme <ol><li> Görüntüleme için hazırlayın. Isıtılmış bir aşamada kullanıyorsanız, o zaman-lapse kurmadan önce en az 30 dakika açmak için emin olun. Mikroskop altında bir slayt tutucuya monte embriyo (lar) yerleştirin. İstenen hava amacı ile, tek bir embriyo odaklanın. Biz 20X, 0.5 NA objektif kullanın. Açık Zeiss LSM 510 görüntüleme yazılımı. Uygun lazerler açın ve istenen yapılandırma kurmak. Biz şimdi Zeiss LSM Çok Zaman yazılımı ile uzun vadeli görüntüleme için ayrıntılı bir protokol anlatacağız. Bu yöntemler, görüntüleme yazılımı ile kendi mikroskop kullanım için adapte edilebilir. </li><li> Çok Zaman penceresinde ilk embriyonun konumu ve yapılandırma tanımlayın. Tarama, sahne ve Çok Zaman pencereleri açın. Hızlı tarama penceresi tarama etkinleştirin. Aşamasında istenen XY konumunu taşıyın. Tarama penceresi ilk ve son Z konumlarının işaretleyin. Ayrıca tarama penceresinde, sonra Orta stop basın. Orta Z dilim bitirmek için tarama için bekleyin, sonra sahne pencere işareti konumunu basın. Tek bir embriyo tek görüntüleme Çok Zaman penceresinde, &quot;Tek Yer&quot; sekmesini tıklatın. &quot;Değiştir XYZ&quot; üzerine tıklayın ve ardından &quot;Yapılandırma Kaydet&quot;. Önceki yapılandırmaya üzerine sorulduğunda kabul etmiş sayılırsınız. 4.4 adıma geçin. Mekanize bir sahne varsa, görüntü çoklu embriyo birden fazla yerde ayarlayabilirsiniz. Bu durumda, ilk konum için XYZ ve yapılandırma tanımlamadan önce &quot;Birden fazla yerler&quot; sekmesini seçmelisiniz. Ayrıca, &quot;Çoklu Yerler&quot; sekmesi altında açılan menüden konumu 1 açık olduğundan emin olun ve size yapılandırmayı kaydetmek tıklatmadan önce yapılandırma bölümünde açılan menüden, loc 1 adet çok diyor. </li><li> Çok Zaman pencerede kalan embriyoların konumu ve yapılandırma tanımlayın. Sonraki embriyo bulun, daha sonra, hızlı tarama basın sahneye taşımak istediği XY pozisyonu, ve tarama penceresinde ilk ve son Z konumlarının işaretleyin. Ayrıca tarama penceresinde, sonra Orta stop basın. Orta Z dilim bitirmek için tarama için bekleyin, sonra sahne pencere işareti konumunu basın. &quot;Değiştir XYZ&quot; üzerine tıklayın. &quot;Yapılandırma Kaydet&quot; seçeneğini tıklatın, yapılandırma bölümünde açılan menüden çok loc 2 diyor ki, &quot;Birden fazla yerler&quot; sekmesi altında açılan menüden yeri 2 olduğunu kontrol edin ve. Önceki yapılandırmaya üzerine sorulduğunda kabul etmiş sayılırsınız. Kalan embriyolar için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Çok Loc penceresinde görüntü elde etmek için parametreleri ayarlayın. &quot;Blok Listesi&quot; bölümünde GR-GL seçeneğini seçin, daha sonra grup tekrarlar istediğiniz numarayı girin. Bu konfokal her yerde bir görüntü elde kaç kez. Parametreler bölümünde istenilen bekleme aralığı girin. Bu, başından itibaren bir görüntü tekrarı sonraki tekrarı başlangıç ​​zaman miktarıdır. Yapılandırma bölümü &quot;ZStackXY&quot; i seçin. Alt bölümünde temel dosya adı girin. &quot;Resim Seç DB&quot; tıklayın ve seçim sizin mdb. &quot;Seçenekler&quot; butonuna tıklayın. Geçici dosyaları kaydetmek için mdb klasörü seçin. Son görüntüyü kaydetmek &quot;ve&quot; z yığınının ortasında &quot;,&quot; son görüntüyü açık tutmak &quot;seçeneğini işaretleyin. Aralığı bekleyin seçin. Seçenekler penceresini kapatmak için Tamam tıklayın. &quot;Başlangıç ​​zamanı&quot; üzerine tıklayın. Çok Zaman pencere görüntüleme süresi boyunca açık bırakın. </li><li> Verileri analiz. Zaman atlamalı görüntüleme tamamlandığında, Çok Zaman yazılımı tüm geçici dosyaları her konum için bir özet dosyası içine derlenir. Tamamlanmadan önce filmi durdurmak istiyorsanız, emin olun, bu yüzden bir özet dosyası oluşturulur olacağını &quot;Dur&quot; yerine &quot;Finish&quot; tuşuna basın. Geçici dosyaları ve özet dosyaları otomatik olarak belirlenen mdb klasöre kaydedilmesi gerekir. LSM yazılım menüsünden, &quot;Projektör&quot;, sonra &quot;3D View&quot; üzerine tıklayın. Özet dosyası ile açılan menüden seçilen, &quot;Uygula&quot; yı tıklayın. Bu her konfokal görüntü için Z yığını maksimum projeksiyonları üretecektir. LSM yazılım menüsü, ardından &quot;İhracat&quot;, &quot;Dosya&quot; tıklayın. Tif dosyaları bir dizi olarak maksimum projeksiyonları kaydedin. Daha sonra dizi ImageJ veya QuickTime Pro kullanarak tif dosyaları dışında bir film yaratabilir. LSM görüntüler Aksonlar akson morfolojisi hakkında ayrıntılı kantitatif bilgiler üretmek için görüntü analiz yazılımı (örneğin NeuroLucida MicroBrightfield gelen) kullanarak üç boyutlu olarak takip edilebilir. </li></ol> Bölüm 5: Temsilci sonuçları Başarılı bir deney hücresel dinamik doğru bir temsili neden olacaktırakson kurtarma yaralanma. Embriyolar görünür dejenerasyon ve güçlü bir kalp atışı, görüntüleme sonra sağlıklı olacaktır. Axotomy sadece akson tanımlanan şube kesilmesinin, kesin hasar görmesine neden olacaktır. Akson ve minimal hücre ölümünü çevreleyen herhangi bir yaralanma olmamalıdır. Biz doğrudan deneylerin ~% 50 axotomy site üzerinden tek bir epidermal hücre ölümü görmek inanıyoruz. Daha fazla zarar gözlemlemek tartışma açıklandığı gibi, iki-foton protokol optimize gerekir.

<ol><li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li>
<li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgery%3A+functional+regeneration+after+laser+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li>
<li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li>
</ol>

Biz tam periferik duyusal aksonlar axotomize ve oturma zebrafish embriyo rejenerasyon doğrudan gözlemlemek için açıklanan yöntemleri kullanmışlardır. Zebrafish Uzun vadeli zaman atlamalı konfokal görüntüleme in vivo birçok gelişimsel süreçlerini gözlemlemek için kullanılabilir. Açıklanan iki foton axotomy prosedürü, pek çok farklı deneysel amaçları için değiştirilebilir. Biz hücre gövdesi ziyade periferik akson bir şube yakınlaştırma, tüm trigeminal duyusal nöron hücre gövdeleri kesebilme genel olarak aynı pros...

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebra balığı uzun zaman atlamalı görüntüleme ile yaşayan şeffaf embriyonun gelişim hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Burada uzun vadeli görüntüleme için zebrafish embriyolar montaj ve konfokal bir mikroskop kullanılarak zaman atlamalı görüntüleri yakalama otomatikleştirmek için nasıl göstermek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz de iki foton mikroskop üzerine monte edilmiş bir femtosaniye lazer odaklı güç kullanarak zebrafish periferik duyusal aksonlar bireysel şube kontrollü, kesin hasar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Başarılı iki foton axotomy için parametreler her mikroskop için optimize edilmiş olmalıdır. Biz iki örnek sağlamak için özel inşa edilen iki foton mikroskop ve Zeiss 510 konfokal / iki-foton hem de iki foton axotomy gösterecektir. Zebra balığı trigeminal duyusal nöronlar bir duyusal nöron spesifik 1 organizatörü tarafından yönlendirilen bir transgenik hattı ifade GFP görüntülenebilir. Biz doğrudan doğruya zebrafish embriyolar yaşayan duyusal akson rejenerasyonu gözlemlemek için bu zebrafish trigeminal model adapte var. Embriyolar tricaine ile anestezi ve agaroz bir damla içinde katılaşır olarak konumlandırılmış. İmmobilize embriyolar phenylthiourea (PTU) Zil sesleri ile dolu bir görüntüleme odası içinde mühürlenir. Embriyoların 12-48 saat boyunca sürekli bu odaları görüntülü olduğunu bulduk. Sonra tek bir konfokal görüntü axotomy istenen site belirlemek için yakalanır. Ilgi bölge görüntüleme, düşük, zararlı olmayan güç altında duyusal aksonlar tarafından iki foton mikroskop yer almaktadır. Axotomy istenen sitesinde yakınlaştırma sonra, gücü artar ve tanımlanan bölgenin tek bir tarama akson koparmaya yeterli olur. Çoklu konumu zaman atlamalı görüntüleme sonra yaralanma aksonal kurtarma doğrudan gözlemlemek için bir konfokal mikroskop kurulur.

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

Zebrafishler, canlı ve şeffaf embriyoların zaman ayarlı görüntülemesi sayesinde gelişimle ilgili hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için uzun süredir kullanılmaktadır.

In vivo iki foton görüntüleme kullanarak aksonları kesmek için, anestezi uygulanmış zebra balığı embriyolarını, TEFLON ve lamdan oluşan özel bir hazne içerisinde sertleşmekte olan bir agar damlasının içine yerleştirin. Haznenin üzerine cam bir plaka yerleştirin ve eksonotomi işleminden önce düzeneği ters çevirin. Kesmek istediğiniz aksonun 40x büyütmede bir öncesi görüntüsünü alın ve ardından eksonomize etmek istediğiniz bölgeye 70x büyütmede odaklanın.Ardından lazer kapalıyken lazer gücünü artırın. Lazeri kısa bir süreliğine açın. Aksonun artçı görüntüsünde, eksotomi başarılı olduysa dağılmış aksonal kalıntılar göreceksiniz.Merhaba, ben Georgia O'Brien. Merhaba, ben Sandra Rigo. Ve ben Shauna Martin.University of California Los Angeles'taki Moleküler Hücre ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü'nde bulunan Alvarez TI laboratuvarındayız. Bugün size canlı zebra balığı embriyolarında iki fotonlu eksodomi ve zaman ayarlı konfokal görüntüleme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü periferik somatosensoriyel aksonların dejenerasyonunu ve rejenerasyonunu incelemek için kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Başlangıç olarak, gömme işlemi için %1'lik düşük erime noktalı agaroz çözeltisi hazırlayacağız. Agarozu, çift distile su içerisinde mikrodalga ile ısıtarak çözeceğiz; ardından küçük tüplere paylaştırıp 42 °C'deki bir ısıtma bloğunda saklayacağız.Pigment oluşumunu engellemek için, döllenmeden 22 ila 24 saat sonra ilk embriyolar %5 PTU'lu ringer çözeltisine yerleştirilebilir; zira pigment parlak şekilde otofloresan özellik gösterir ve iki fotonlu mikroskopta aksonların görünürlüğünü engeller. Ardından, görüntüleme için embriyolar seçilir ve pens yardımıyla nazikçe çekilerek koroionları uzaklaştırılır. Embriyolar seçildikten sonra, PTU'lu ringer çözeltisine yaklaşık %0,02 tricaine eklenerek anestezi uygulanır.Devam etmeden önce, hayvanların dokunmaya yanıt vermediğinden emin olun. Bir cam veya Teflon halkanın bir tarafına vakum gresi sürerek ve halkayı bir cam lamı üzerine sabitleyerek uzun süreli görüntüleme haznesini hazırlayın. PTU ringer çözeltisinin çoğunun aktarılmamasına dikkat edin.Bir embriyoyu cam bir pipet yardımıyla 42 derece agro çözeltisine aktarın. Ardından, embriyoyu bir damla agro ile birlikte hazırlanmış bir lameline aktarın. Aktarım tamamlandıktan sonra, agro sertleşirken embriyoyu istediğiniz konuma getirin.İşleminiz bittiğinde, bakır lamın üst yüzey olması için görüntüleme haznesinin ters çevrileceğini unutmayın. Motorize bir sahneniz varsa ve aynı anda birden fazla konumu görüntüleyebiliyorsanız, bu adımları her embriyo için tekrarlayın. Agarozun tamamen katılaşmasını bekleyin.Ardından halkayı %0,02'lik canine PTU ringers çözeltisi ile doldurun. Son olarak, halkaların diğer tarafına vakum gresi uygulayın. Daha sonra üzerlerini bir lamel ile kapatın.Mühürleme odalarını ters çevirin. Artık iki dört ton ekso tomografi görüntülemesi için hazırız. Görüntülemeye hazırlanmak için, monte edilmiş embriyoları mikroskop altındaki bir lam tutucuya yerleştirin.40 x 0.8 sayısal açıklıklı bir su objektifi ile bir embriyoya odaklanın. Ardından lazeri açın. Lazeri 910 nanometre dalga boyuna ve 30 milliwatt güce ayarlayın.Görüntüleme yazılımını açın. Boar Laboratuvarı için mercanlar üzerinde geliştirilen tarama görüntüleme yazılımını kullanıyoruz. Bu güçte, kesilecek olan aday bir akson için alan taraması yapılabilir.Hedef akson bulunduğunda, hedef aksonun bir görüntüsünü alın. İlk ve son Z konumlarını işaretleyin, görüntüyü elde edin ve Z yığınlarının maksimum projeksiyonunu oluşturun. Ardından, incelemek istediğiniz akson dalına 70 x yakınlaştırın.Gücü 180 milliwatt seviyesine yükseltin ve Z kesit sayısını bir olarak ayarlayın. Grab düğmesine basarak lazerle tek bir tarama başlatın. Bu işlem aksonu koparmak için yeterli olmalıdır, ancak bu prosedürün kullandığınız mikroskoba ve deneysel amacınıza göre optimize edilmesi gerekir.Son olarak, görüntüyü uzaklaştırın. Gücü 30 milliwatts seviyesine düşürün ve yeni kesilmiş aksonumuzun bir görüntüsünü alın. Laboratuvarınızda özel yapım bir iki foton mikroskobu mevcut değilse, aksonları kesmek için Zes five 10 konfokal iki foton mikroskobu da kullanılabilir.İşleme, monte edilmiş embriyoyu sahneye yerleştirerek ve 25 x su objektifi kullanarak odağa getirerek başlıyoruz. Ardından, birinden diğerine geçiş yapılabilmesi için iki fotonlu ve Argonne lazerlerini çoklu izleme ayarında açın. Her iki lazer de GFP'yi tespit etmek için kullanılsa da, iki fotonlu emisyon kırmızı, Argonne lazer emisyonu ise yeşil ile görselleştirilir.İkisini ayırt etmek için, Z ayarları altında izlenecek bir aksonu belirlemek amacıyla Argonne lazerini kullanın. İlk ve son optik kesitleri işaretleyin. Bir konfokal görüntü alın ve Zack'in maksimum projeksiyonunu oluşturun.Argon lazerini kapatın ve iki foton lazer taramasını yaklaşık %9 iletim yoğunluğunda açın. Aksonun hâlâ odak noktasında olduğundan emin olmak için, kırpma aracının kullanılabilir hale gelmesi amacıyla durdur düğmesine tıklayın. İlgilenilen bölgeye yakınlaşmak için kırpma özelliğini kullanın.Genellikle yaklaşık 70 x yakınlaştırma yapılır. Aksonun hasar verilecek bölgesini seçin ve bu bölgeyi odağa getirin. Yakınlaştırma düzeyi mod sekmesinden kontrol edilebilir.Ardından, kanallar sekmesi altında, iki foton yoğunluğunu yaklaşık %9 geçirgenlikten %15 ila %30 geçirgenliğe değiştirin. Yeni ayarları etkinleştirmek için hızlı XY düğmesine tıklayın ve ardından hemen ardından durdur düğmesine tıklayın. Aşırı hasarı önlemek için, prosedür başarılı olduysa akson dağılmış kalıntılar şeklinde görülmelidir.Son olarak, aksonun gerçekten hasar gördüğünden emin olmak için 488 nanometrelik argon lazerine geri dönün. Bir konfokal görüntü daha alın ve aksonların maksimum projeksiyonunu oluşturun. İki foton lazer mikroskopisi kullanarak aksonları kesmenin iki yolunu gösterdiğimize göre, şimdi Zeiss LSM 510 kullanarak rejenerasyonun konfokal zaman ayarlı görüntülemesine bakacağız.Zaman ayarlı görüntüleme hazırlığı için, zaman ayarlı videonuzu kurmadan en az 30 dakika önce ısıtmalı sahneyi açtığınızdan emin olun. Monte edilmiş embriyoları mikroskop altındaki bir lam tutucuya yerleştirin. İstenen hava objektifi ile bir embriyoya odaklanın.20 x 0,5 sayısal açıklıklı bir objektif kullanıyoruz; Zeiss LSM five 10 görüntüleme yazılımını açıyoruz ve ardından uygun lazerleri çalıştırıp istenen konfigürasyonu ayarlıyoruz. Tarama aşamasını ve çok zamanlı (multi-time) pencereleri açın. Eğer çok zamanlı yazılımınız varsa, çok zamanlı pencerede ilk embriyonuzun konumunu ve konfigürasyonunu tanımlayın.Tarama penceresinde hızlı taramayı (fast scan) etkinleştirin, ardından tablasını istenen XY konumuna taşıyın. Tarama penceresinde ilk ve son Z konumlarını işaretleyin. Tarama penceresinde durdur (stop) ve ardından orta (mid) düğmesine basın, orta Z kesitinin taramasının tamamlanmasını bekleyin.Ardından sahne penceresinde konum işaretle (mark position) düğmesine basın. Eğer yalnızca tek bir embriyo görüntülüyorsanız, çoklu zaman penceresindeki tek konum (single location) sekmesine tıklayın. X, y, Z değiştir (replace X, y, Z) seçeneğine tıklayın. Sonrasında konfigürasyonu kaydet (save configuration) düğmesine tıklayın.Önceki yapılandırmanın geçersiz kılınması istendiğinde onaylayın. Artık çoklu konum penceresinde görüntüleme için parametreleri ayarlayabilirsiniz. Mekanik bir sahneniz varsa, birden fazla embriyoyu görüntülemek için çoklu konumlar ayarlayabilirsiniz.Bu durumda, ilk konumunuz için X, Y, Z ve konfigürasyonu tanımlamadan önce çoklu konumlar sekmesini seçmelisiniz. Ayrıca, çoklu konumlar sekmesinin hemen altındaki açılır menünün konum bir'de ve konfigürasyon bölümündeki açılır menünün multi lo one şeklinde olduğundan emin olun. Konfigürasyonu kaydet düğmesine tıklamadan önce, kalan embriyolarınızın konumunu ve konfigürasyonunu çoklu zaman penceresinde tanımlayın.Bir sonraki embryo press hızlı taramanızı belirleyin, ardından sahneyi istenen XY konumuna taşıyın ve tarama penceresinde ilk ve son Z konumlarınızı işaretleyin. Durdur düğmesine basın. Daha sonra, tarama penceresindeki orta düğmesine basın ve orta Z diliminin taramasının tamamlanmasını bekleyin.Ardından mark position düğmesine basın. Sahne penceresinde replace X, Y, Z seçeneğine tıklayın. Multiple locations sekmesinin hemen altındaki açılır menünün location two konumunda ve konfigürasyon bölümündeki açılır menünün multi lobe two şeklinde olduğunu kontrol edin. Sonra save configuration düğmesine tıklayın. Onaylayın. Önceki konfigürasyonun üzerine yazılması istendiğinde, bu işlemi geri kalan embriyolar için tekrarlayın.Çoklu lo penceresinde görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Blok bölüm listesinden GR GL seçeneğini seçin. Ardından, istenen grup tekrarlama sayısını girin.Bu, konfokal mikroskobun her konumda kaç kez görüntü alacağını belirten sayıdır. Parametre bölümüne istenen bekleme aralığını giriniz. Bu, bir görüntüleme tekrarının başlangıcından bir sonrakinin başlangıcına kadar geçen süredir.Yapılandırma bölümünden Zack XY'yi seçin. Alt bölüme temel dosya adınızı girin. Görüntü veri tabanını seç (select image db) düğmesine tıklayın ve veri tabanınızı seçin.Seçenekler düğmesine tıklayın, ardından geçici dosyaları kaydetmek için MDB klasörünüzü seçin. Final görüntüsünü açık tut seçeneğini işaretleyin. Final görüntüsünü, Zack'in ortasını kaydedin ve ağırlık aralığını seçin.Seçenekler penceresini kapatmak için tamam'a tıklayın, ardından başlangıç zamanına tıklayın. Çoklu zaman penceresini görüntüleme süresi boyunca açık bırakın. Şimdi verilerinizi analiz etme zamanı.Zaman atlamalı görüntüleme tamamlandığında, multi-time yazılımı tüm geçici dosyalarınızı her konum için bir özet dosyada derleyecektir. Eğer videoyu tamamlanmadan durdurmak isterseniz, bir özet dosyasının oluşturulması için "stop" yerine "finish" düğmesine bastığınızdan emin olun.Geçici dosyalar ve özet dosyaları otomatik olarak belirlenmiş MDB klasörüne kaydedilmelidir. Burada, döllenmeden 54 saat sonra gerçekleştirilen eksotomi sonrası zaman ayarlı konfokal görüntülemenin temsilci bir örneği yer almaktadır. İlk kare, eksotomi öncesi aksonun dorsal görünümünü göstermekte olup, sarı ok bir sonraki zaman dilimindeki eksotomi bölgesini işaret etmektedir.Time-lapse görüntüleme, ekstomi sonrası bir saat içinde başlar ve 12 saat sürer. Her 20 dakikada bir konfokal yığın toplandı. Bu time-lapse konfokal görüntüleme, döllenmeden 78 saat sonra aynı parametreler kullanılarak kaydedilmiştir.İlk kare, eksonomi öncesi aksonun yan görünümünü göstermekte olup sarı ok eksonomi bölgesini işaret etmektedir. Size, iki fotonlu eksonomi ve zaman ayarlı konfokal görüntüleme kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında nasıl hassas doku hasarı oluşturulacağını ve bunların nasıl görselleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, aşırı hasara yol açmamak için iki fotonlu lazer eksonomisinde kullanılan güç miktarını optimize etmek önemlidir.Her şey bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneyinizde başarılar dileriz.

two-photon-axotomy-time-lapse-confocal-imaging-live-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Multiphoton mikroskobu optik derin penetrasyon ve azaltılmış fototoksisite düşük enerjili fotonların kontrol sağlar. Biz zebrafish embriyolar canlı hücre etiketlenmesi için bu teknolojinin kullanımını anlatmayacağız. Bu protokol fotoğraf indüksiyonu için çeşitli ışık duyarlı moleküllerin kolayca adapte edilebilir.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon teknikleri verilmektedir. Time-lapse görüntüleme ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için...

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Bu video, iki foton lazer aksotomi kullanarak ve yaralanmadan aksonal iyileşmeyi gözlemleyerek zebra balığı embriyolarında aksonları yaralama yöntemini açıklamaktadır.

İki Fotonlu Lazer Aksotomi: Zebra Balığı Embriyolarında Aksonları Yaralamak ve Aksonal İyileşmeyi Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Kaynak: Williams, A. L.,  et al. Gelişimi Gerçek Zamanlı Olarak Görselleştirmek için Çoklu Foton Hızlandırılmış Görüntüleme: Zebra Balığı Embriyolarında Göç Eden Nöral Krest Hücrelerinin Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, bir zebra balığı embriyosundaki nöral krest hücrelerinin göçünü gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlükte görselleştirmek için çok fotonlu hızlandırılmış bir görüntüleme protokolünü göstermektedir.

Çoklu Foton Zaman Atlamalı Görüntüleme Kullanarak Bir Zebra Balığı Embriyosunda Nöral Krest Hücre Göçünü Görselleştirme

Zaman atlamalı konfokal görüntüleme embriyo gelişimini karakterize etmek için yararlı olan bir güçlü bir tekniktir. Burada, yöntemini açıklar ve iskeletsel vahşi tür morfolojilerinden yanı sıra, PDGFRA, smad5 ve smo mutant embriyolar karakterize eder.

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Mitoz her canlı organizma için kritiktir ve kusurlar genellikle kansere ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Araştırmacılar, bu görüntüleme protokolünü ve zebra balığını bir model sistem olarak kullanarak, canlı bir omurgalı organizmasında mitozu ve mitotik süreçler kusurlu olduğunda ortaya çıkan çok sayıda kusuru görselleştirebilirler.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Gelişmekte olan zebra balığı optik tektumunda mikroglia hücrelerinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için hızlı taramalı konfokal mikroskopiden yararlanan ve bu hücrelerin dinamiklerinin in vivo analizine olanak tanıyan bir yöntem gösteriyoruz.

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Öğrenin canlı zebrafish embriyolarında iki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme yöntemini. Bu teknik sinirbilim araştırmalarında akson dinamiklerini uzun süreli gözlemlemeyi mümkün kılar.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Daha fazla video keşfet