İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

In vivo iki foton görüntüleme kullanarak aksonları kesmek için, anestezi uygulanmış zebra balığı embriyolarını, TEFLON ve lamdan oluşan özel bir hazne içerisinde sertleşmekte olan bir agar damlasının içine yerleştirin. Haznenin üzerine cam bir plaka yerleştirin ve eksonotomi işleminden önce düzeneği ters çevirin. Kesmek istediğiniz aksonun 40x büyütmede bir öncesi görüntüsünü alın ve ardından eksonomize etmek istediğiniz bölgeye 70x büyütmede odaklanın.

Ardından lazer kapalıyken lazer gücünü artırın. Lazeri kısa bir süreliğine açın. Aksonun artçı görüntüsünde, eksotomi başarılı olduysa dağılmış aksonal kalıntılar göreceksiniz.

Merhaba, ben Georgia O'Brien. Merhaba, ben Sandra Rigo. Ve ben Shauna Martin.

University of California Los Angeles'taki Moleküler Hücre ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü'nde bulunan Alvarez TI laboratuvarındayız. Bugün size canlı zebra balığı embriyolarında iki fotonlu eksodomi ve zaman ayarlı konfokal görüntüleme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü periferik somatosensoriyel aksonların dejenerasyonunu ve rejenerasyonunu incelemek için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Başlangıç olarak, gömme işlemi için %1'lik düşük erime noktalı agaroz çözeltisi hazırlayacağız. Agarozu, çift distile su içerisinde mikrodalga ile ısıtarak çözeceğiz; ardından küçük tüplere paylaştırıp 42 °C'deki bir ısıtma bloğunda saklayacağız.

Pigment oluşumunu engellemek için, döllenmeden 22 ila 24 saat sonra ilk embriyolar %5 PTU'lu ringer çözeltisine yerleştirilebilir; zira pigment parlak şekilde otofloresan özellik gösterir ve iki fotonlu mikroskopta aksonların görünürlüğünü engeller. Ardından, görüntüleme için embriyolar seçilir ve pens yardımıyla nazikçe çekilerek koroionları uzaklaştırılır. Embriyolar seçildikten sonra, PTU'lu ringer çözeltisine yaklaşık %0,02 tricaine eklenerek anestezi uygulanır.

Devam etmeden önce, hayvanların dokunmaya yanıt vermediğinden emin olun. Bir cam veya Teflon halkanın bir tarafına vakum gresi sürerek ve halkayı bir cam lamı üzerine sabitleyerek uzun süreli görüntüleme haznesini hazırlayın. PTU ringer çözeltisinin çoğunun aktarılmamasına dikkat edin.

Bir embriyoyu cam bir pipet yardımıyla 42 derece agro çözeltisine aktarın. Ardından, embriyoyu bir damla agro ile birlikte hazırlanmış bir lameline aktarın. Aktarım tamamlandıktan sonra, agro sertleşirken embriyoyu istediğiniz konuma getirin.

İşleminiz bittiğinde, bakır lamın üst yüzey olması için görüntüleme haznesinin ters çevrileceğini unutmayın. Motorize bir sahneniz varsa ve aynı anda birden fazla konumu görüntüleyebiliyorsanız, bu adımları her embriyo için tekrarlayın. Agarozun tamamen katılaşmasını bekleyin.

Ardından halkayı %0,02'lik canine PTU ringers çözeltisi ile doldurun. Son olarak, halkaların diğer tarafına vakum gresi uygulayın. Daha sonra üzerlerini bir lamel ile kapatın.

Mühürleme odalarını ters çevirin. Artık iki dört ton ekso tomografi görüntülemesi için hazırız. Görüntülemeye hazırlanmak için, monte edilmiş embriyoları mikroskop altındaki bir lam tutucuya yerleştirin.

40 x 0.8 sayısal açıklıklı bir su objektifi ile bir embriyoya odaklanın. Ardından lazeri açın. Lazeri 910 nanometre dalga boyuna ve 30 milliwatt güce ayarlayın.

Görüntüleme yazılımını açın. Boar Laboratuvarı için mercanlar üzerinde geliştirilen tarama görüntüleme yazılımını kullanıyoruz. Bu güçte, kesilecek olan aday bir akson için alan taraması yapılabilir.

Hedef akson bulunduğunda, hedef aksonun bir görüntüsünü alın. İlk ve son Z konumlarını işaretleyin, görüntüyü elde edin ve Z yığınlarının maksimum projeksiyonunu oluşturun. Ardından, incelemek istediğiniz akson dalına 70 x yakınlaştırın.

Gücü 180 milliwatt seviyesine yükseltin ve Z kesit sayısını bir olarak ayarlayın. Grab düğmesine basarak lazerle tek bir tarama başlatın. Bu işlem aksonu koparmak için yeterli olmalıdır, ancak bu prosedürün kullandığınız mikroskoba ve deneysel amacınıza göre optimize edilmesi gerekir.

Son olarak, görüntüyü uzaklaştırın. Gücü 30 milliwatts seviyesine düşürün ve yeni kesilmiş aksonumuzun bir görüntüsünü alın. Laboratuvarınızda özel yapım bir iki foton mikroskobu mevcut değilse, aksonları kesmek için Zes five 10 konfokal iki foton mikroskobu da kullanılabilir.

İşleme, monte edilmiş embriyoyu sahneye yerleştirerek ve 25 x su objektifi kullanarak odağa getirerek başlıyoruz. Ardından, birinden diğerine geçiş yapılabilmesi için iki fotonlu ve Argonne lazerlerini çoklu izleme ayarında açın. Her iki lazer de GFP'yi tespit etmek için kullanılsa da, iki fotonlu emisyon kırmızı, Argonne lazer emisyonu ise yeşil ile görselleştirilir.

İkisini ayırt etmek için, Z ayarları altında izlenecek bir aksonu belirlemek amacıyla Argonne lazerini kullanın. İlk ve son optik kesitleri işaretleyin. Bir konfokal görüntü alın ve Zack'in maksimum projeksiyonunu oluşturun.

Argon lazerini kapatın ve iki foton lazer taramasını yaklaşık %9 iletim yoğunluğunda açın. Aksonun hâlâ odak noktasında olduğundan emin olmak için, kırpma aracının kullanılabilir hale gelmesi amacıyla durdur düğmesine tıklayın. İlgilenilen bölgeye yakınlaşmak için kırpma özelliğini kullanın.

Genellikle yaklaşık 70 x yakınlaştırma yapılır. Aksonun hasar verilecek bölgesini seçin ve bu bölgeyi odağa getirin. Yakınlaştırma düzeyi mod sekmesinden kontrol edilebilir.

Ardından, kanallar sekmesi altında, iki foton yoğunluğunu yaklaşık %9 geçirgenlikten %15 ila %30 geçirgenliğe değiştirin. Yeni ayarları etkinleştirmek için hızlı XY düğmesine tıklayın ve ardından hemen ardından durdur düğmesine tıklayın. Aşırı hasarı önlemek için, prosedür başarılı olduysa akson dağılmış kalıntılar şeklinde görülmelidir.

Son olarak, aksonun gerçekten hasar gördüğünden emin olmak için 488 nanometrelik argon lazerine geri dönün. Bir konfokal görüntü daha alın ve aksonların maksimum projeksiyonunu oluşturun. İki foton lazer mikroskopisi kullanarak aksonları kesmenin iki yolunu gösterdiğimize göre, şimdi Zeiss LSM 510 kullanarak rejenerasyonun konfokal zaman ayarlı görüntülemesine bakacağız.

Zaman ayarlı görüntüleme hazırlığı için, zaman ayarlı videonuzu kurmadan en az 30 dakika önce ısıtmalı sahneyi açtığınızdan emin olun. Monte edilmiş embriyoları mikroskop altındaki bir lam tutucuya yerleştirin. İstenen hava objektifi ile bir embriyoya odaklanın.

20 x 0,5 sayısal açıklıklı bir objektif kullanıyoruz; Zeiss LSM five 10 görüntüleme yazılımını açıyoruz ve ardından uygun lazerleri çalıştırıp istenen konfigürasyonu ayarlıyoruz. Tarama aşamasını ve çok zamanlı (multi-time) pencereleri açın. Eğer çok zamanlı yazılımınız varsa, çok zamanlı pencerede ilk embriyonuzun konumunu ve konfigürasyonunu tanımlayın.

Tarama penceresinde hızlı taramayı (fast scan) etkinleştirin, ardından tablasını istenen XY konumuna taşıyın. Tarama penceresinde ilk ve son Z konumlarını işaretleyin. Tarama penceresinde durdur (stop) ve ardından orta (mid) düğmesine basın, orta Z kesitinin taramasının tamamlanmasını bekleyin.

Ardından sahne penceresinde konum işaretle (mark position) düğmesine basın. Eğer yalnızca tek bir embriyo görüntülüyorsanız, çoklu zaman penceresindeki tek konum (single location) sekmesine tıklayın. X, y, Z değiştir (replace X, y, Z) seçeneğine tıklayın. Sonrasında konfigürasyonu kaydet (save configuration) düğmesine tıklayın.

Önceki yapılandırmanın geçersiz kılınması istendiğinde onaylayın. Artık çoklu konum penceresinde görüntüleme için parametreleri ayarlayabilirsiniz. Mekanik bir sahneniz varsa, birden fazla embriyoyu görüntülemek için çoklu konumlar ayarlayabilirsiniz.

Bu durumda, ilk konumunuz için X, Y, Z ve konfigürasyonu tanımlamadan önce çoklu konumlar sekmesini seçmelisiniz. Ayrıca, çoklu konumlar sekmesinin hemen altındaki açılır menünün konum bir'de ve konfigürasyon bölümündeki açılır menünün multi lo one şeklinde olduğundan emin olun. Konfigürasyonu kaydet düğmesine tıklamadan önce, kalan embriyolarınızın konumunu ve konfigürasyonunu çoklu zaman penceresinde tanımlayın.

Bir sonraki embryo press hızlı taramanızı belirleyin, ardından sahneyi istenen XY konumuna taşıyın ve tarama penceresinde ilk ve son Z konumlarınızı işaretleyin. Durdur düğmesine basın. Daha sonra, tarama penceresindeki orta düğmesine basın ve orta Z diliminin taramasının tamamlanmasını bekleyin.

Ardından mark position düğmesine basın. Sahne penceresinde replace X, Y, Z seçeneğine tıklayın. Multiple locations sekmesinin hemen altındaki açılır menünün location two konumunda ve konfigürasyon bölümündeki açılır menünün multi lobe two şeklinde olduğunu kontrol edin. Sonra save configuration düğmesine tıklayın. Onaylayın. Önceki konfigürasyonun üzerine yazılması istendiğinde, bu işlemi geri kalan embriyolar için tekrarlayın.

Çoklu lo penceresinde görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Blok bölüm listesinden GR GL seçeneğini seçin. Ardından, istenen grup tekrarlama sayısını girin.

Bu, konfokal mikroskobun her konumda kaç kez görüntü alacağını belirten sayıdır. Parametre bölümüne istenen bekleme aralığını giriniz. Bu, bir görüntüleme tekrarının başlangıcından bir sonrakinin başlangıcına kadar geçen süredir.

Yapılandırma bölümünden Zack XY'yi seçin. Alt bölüme temel dosya adınızı girin. Görüntü veri tabanını seç (select image db) düğmesine tıklayın ve veri tabanınızı seçin.

Seçenekler düğmesine tıklayın, ardından geçici dosyaları kaydetmek için MDB klasörünüzü seçin. Final görüntüsünü açık tut seçeneğini işaretleyin. Final görüntüsünü, Zack'in ortasını kaydedin ve ağırlık aralığını seçin.

Seçenekler penceresini kapatmak için tamam'a tıklayın, ardından başlangıç zamanına tıklayın. Çoklu zaman penceresini görüntüleme süresi boyunca açık bırakın. Şimdi verilerinizi analiz etme zamanı.

Zaman atlamalı görüntüleme tamamlandığında, multi-time yazılımı tüm geçici dosyalarınızı her konum için bir özet dosyada derleyecektir. Eğer videoyu tamamlanmadan durdurmak isterseniz, bir özet dosyasının oluşturulması için "stop" yerine "finish" düğmesine bastığınızdan emin olun.

Geçici dosyalar ve özet dosyaları otomatik olarak belirlenmiş MDB klasörüne kaydedilmelidir. Burada, döllenmeden 54 saat sonra gerçekleştirilen eksotomi sonrası zaman ayarlı konfokal görüntülemenin temsilci bir örneği yer almaktadır. İlk kare, eksotomi öncesi aksonun dorsal görünümünü göstermekte olup, sarı ok bir sonraki zaman dilimindeki eksotomi bölgesini işaret etmektedir.

Time-lapse görüntüleme, ekstomi sonrası bir saat içinde başlar ve 12 saat sürer. Her 20 dakikada bir konfokal yığın toplandı. Bu time-lapse konfokal görüntüleme, döllenmeden 78 saat sonra aynı parametreler kullanılarak kaydedilmiştir.

İlk kare, eksonomi öncesi aksonun yan görünümünü göstermekte olup sarı ok eksonomi bölgesini işaret etmektedir. Size, iki fotonlu eksonomi ve zaman ayarlı konfokal görüntüleme kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında nasıl hassas doku hasarı oluşturulacağını ve bunların nasıl görselleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, aşırı hasara yol açmamak için iki fotonlu lazer eksonomisinde kullanılan güç miktarını optimize etmek önemlidir.

Her şey bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneyinizde başarılar dileriz.