Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Hi.My adı Mark Blo. Almanya'daki Maden Üniversitesi'nde biyoloji yüksek lisans öğrencisiyim. Bugün, arkadaşım Kajo ve ben size ev yapımı bir site odaklı nörojenezin nasıl yapıldığını göstermek istiyoruz.

Yöntem ilk olarak Ethal tarafından geliştirildi ve diğerleri tarafından uyarlandı. Bu nedenle, bugün internete baktığınızda, az ya da çok önemli noktalarda farklılık gösteren birçok farklı protokol bulacağız. Bugün size bizim için iyi çalışan basit ve uygun maliyetli bir yol göstermek istiyoruz.

Öyleyse başlayalım. Bu deney için, termo kararlı bir redaksiyona, DNA polimeraza ihtiyacınız var. Her zaman fermentörlerden PFU polimeraz kullanırız. Mantıklı.

Ayrıca polimeraz tamponuna, DNTP'ye, karışıma ve suya ihtiyacınız vardır. Ayrıca, kısıtlama enzimine, DPN olana, yetkin e coli hücrelerine, bir burgu plakasına, bakteri kültürü suyuna ve bir sürü kürdana ihtiyacınız var. Bu yöntemin en önemli ve kritik kısmı, mutajenik primerlerin tasarımıdır.

Astar çiftinizi tasarlarken göz önünde bulundurmanız gereken birkaç basit yönerge vardır. Primerler birbirini tamamlayıcı nitelikte ve 25 ila 45 nükleotid uzunluğunda olmalıdır. Mutasyonlar, orijinal plazmide uyumsuzluklar şeklinde eklenir.

Uyumsuzluklar her iki astarda da bulunmalı ve astarın ortasında, her iki tarafta en az sekiz nükleotid ile çevrili olmalıdır. Primerler en az %40'lık bir GC içeriğine sahip olmalı ve beş asal ve üç asal uçlarında bir veya daha fazla G ve C'ye sahip olmalıdır. PCR kullanmadan önce, primerler fosforilasyonun tuzundan arındırılmalıdır.

FPLC veya sayfa saflaştırma gerekli değildir. Erime sıcaklığının hesaplanmasına gerek yoktur. Nakliye sertifikasındaki erime sıcaklığının 60 derece C'den yüksek olduğundan emin olun. Tarama amacıyla, plazmidden her zaman bir kısıtlama bölgesi ekler veya sileriz.

Bununla ilgili ayrıntılar için lütfen yazılı protokolümüzü kontrol edin. Tüm prosedürün ilk adımı, termosiklasyon reaksiyonunun ayarlanmasıdır. Bunun için mutasyona uğratmak istediğiniz 10 ila 60 nanogram plazmide ihtiyacınız var.

Plazmidin nemli bir pozitif bakteri suşundan izole edilmesi çok önemlidir. Daha sonra her mutajenik astardan yaklaşık 150 nanogram ekleyin. 1.5 mikrolitresi 10'da bir seyreltilmiş yüz Picomolar stoğu 150 nanogram astar verecektir.

Reaksiyonu dn, tps, polimeraz tamponu, PFU polimeraz ve su ile tamamlayın. Bir termodöngüleyicide ilk ve tekrarlayan olgunlaşma süresini ve sıcaklığını 30 saniyeye ayarladık. 95 ° C'de, saçak sıcaklığı ve süresi 55 ° C ve bir dakikaya ayarlanır.

Polimeraz. Uzama süresini deşifre etmek C.To 72 derecelik bir uzama sıcaklığı çağrıları kullanıyoruz. Plazmidin kilogram bazında başına bir dakika hesaplıyoruz ve fazladan bir dakika ekliyoruz.

O zamana kadar, döngü bittikten hemen sonra yeterli mutasyona uğramış plazmit oluşturmak için 18 döngü yeterlidir reaksiyonun beş mikrolitresini bir %1 TAE agros jeli üzerine yükleyin. Amplifikasyon başarılı olduysa, orijinal plazmiti reaksiyondan çıkarmak için ayrı bir bant görmelisiniz. Metilasyona duyarlı kısıtlama enzimi DPN'den bir mikrolitre ekliyoruz.

Daha sonra, kısıtlama sindirimini 37 derece C'de en az bir saat inkübe ediyoruz, bundan sonra, DPN bir sindirimden beş mikrolitre yetkin hücrelere dönüştürülür. Bu amaçla, her zaman standart ısı şoku dönüşümünü kullanırız. Yetkin hücreler, bu yöntemin başarısını belirleyen anahtar bir faktördür.

Bu nedenle, orta veya oldukça yetkin hücreler tercih edilir. Bir gecelik kuluçka döneminden sonra koloniler ortaya çıkmalıdır, çünkü mutasyon verimliliği yüzde yüz değildir. Mutantları taramamız gerekiyor.

Bunu sindirimi kısıtlayarak yapıyoruz, bu nedenle prosedürün ikinci gününde, sadece bazı klonları seçmemiz ve ertesi gün mini hazırlık için gece boyunca büyütmemiz gerekiyor. Mini hazırlıktan sonraki gün, marker kısıtlama enzimi ile bir kısıtlama sindirimi gerçekleştiriyoruz. Daha sonra kısıtlama sindirimlerini bir agro agros jeli üzerine yüklüyoruz ve bir elektroforez gerçekleştiriyoruz.

Bitmiş jel üzerinde, hangi koloninizin başarılı bir şekilde mutasyona uğramış plazmidi taşıdığını doğrudan görebilirsiniz. Bu durumda, mutasyonu eklerken bir eco Armon sitesini sildik. Yani soldan üçüncü bant negatif bir klonu temsil ederken, diğerleri pozitiftir.

Bununla birlikte, başarılı mutasyonunuzu sıralama ile onaylamanız gerekir. Zaten buydu. Dediğimiz gibi, bu çok basit ve anlaşılır bir yöntemdir.

Herhangi bir büyük tuzak olmadan, öğreticimizin çok fazla maliyetten tasarruf etmenize ve laboratuvarınızdaki verimi artırmanıza yardımcı olacağını umuyoruz. Araştırmalarınız için başarılar dileriz. İzlediğiniz için teşekkürler.