Name: Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Öğrenin, plazmitlerde hedefe yönelik mutagenez için basit ve maliyet etkin bir yöntemi. Bu teknik, moleküler biyoloji araştırmalarında gen fonksiyonlarını incelemek ve protein mühendisliği yapmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yöntemin prensibi: Bu site tüm plazmid mutagenez Bu video doğrudan bir plazmid içine birkaç üsleri ikamesi, silme veya ekleme klonlanmış bir hedef gen değiştirmek için izin veren bir mutagenez yöntemi açıkladı yönetti. Olmayan bir PCR tabanlı thermocycling tepki olarak, tüm plazmid yükseltme çalışır. Reaksiyon sırasında orijinal plazmid uyumsuzlukları şeklinde istenen mutasyonu taşıyan mutajenik astar, yeni sentezlenmiş plazmid entegre edilmiştir. Reaksiyon orijinal plazmid çıkarıldıktan sonra mutasyona uğramış plazmid E. dönüşmüş olur Bu yöntemin mutasyon verimliliği% 100 değildir, çünkü coli aşağıdaki adımları, sadece tarama amaçlı . Tüm prosedürü üç gün sürer, ancak ana kısmı bir gün içinde yapılabilir. 1.0 Birinci gün: 1.1 Thermocycling reaksiyon: Orijinal Plazmid: Bu site mutagenez protokolü yönettiği 10kb için plazmid ile iyi çalışır. Büyük Plazmidler bu yöntem ile mutasyona biraz zor ve biraz sabır ve thermocycling koşullar ve / veya yetkili hücreleri ayarı alabilir. Ayrıca plazmid ile çalıştıkları bir baraj + bakteri suşu izole edilmelidir. Thermocycling reaksiyon için 10 ila 60 NGS mutasyona istediğiniz plazmid gerekecektir. Astarlar: thermocycling tepki kurmadan önce elinizde primerler var. Her mutajenik astar yaklaşık 150 ng gerekir. 01:10 seyreltilmiş 100 pM stokunun 1.5 ul alırsak tamam. Mutajenik primerler dizayn ederken göz önünde bulundurmanız gereken birkaç basit kurallar vardır: <ul><li> Primerler birbirini tamamlayıcı olmalıdır </li><li> Primerler uzunluğu 25 ve 45 nükleotidler arasında olmalıdır </li><li> Orijinal plazmid uyumsuzlukları şeklinde mutasyonlar her iki astarın yer almalıdır </li><li> Uyumsuzlukları astar merkezli ve her iki tarafta en az 8 nükleotidler tarafından çevrili olmalıdır </li><li> Astar en az% 40 GC-İçerik olmalıdır </li><li> Primerler, 5 başbakan, 3 başbakan, bir veya daha fazla Gs veya Cs ile bitmeli </li><li> Primerler fosforile olmak zorunda değildir, ne de FPLC veya SAYFA saflaştırılmış, sadece olmaları gerektiği desalted olmaya gerek yok. </li><li> Tm hesaplanması için herhangi bir formül değil, nakliye belgesi Tm 60 daha yüksek ° C olmalıdır gerekmez </li><li> Tarama amacıyla mutasyonu ile bir kısıtlama site eklemek veya silmek için pratiktir. Çünkü genetik kod dejenerasyon istediğiniz mutasyon ile bir kısıtlama sitesine girmek için birçok olasılık vardır. New England Biolabs web sitesi, böylesine uygun bir kısıtlama site bulmak için bir araç sağlar. DNA belirsizlik kodu kullanarak, arzu amino asit dizisi için kodlama astar dizisine girmek yeterlidir. Enzim bulucu aracı kısıtlama siteleri istediğiniz mutasyon paralel olarak tanıtıldı olabilir anlatacağım. Bu şekilde, mümkün ya da pratik herhangi bir kısıtlama sitesinde bulamazsanız, mutasyon yerinde genetik kod ile ilgili yeni bir kısıtlama olmadan herhangi bir site ekleyebilirsiniz. Bundan sonra bu kısıtlamayı sitesi yeni mutajenik astar ekleme silinecek olan mutasyonlar bir dizi şablon olarak bu plazmid kullanabilirsiniz. Bu yaklaşım, aynı yerde plazmid mutasyonların bir dizi yapmak planlıyorsanız çok kullanışlı olabilir. </li></ul> DNA Polimeraz: Bu yöntem için 3&#39;-5 &#39;eksonükleaz faaliyet gösteren ve künt uçları oluşturur thermostable DNA Polimeraz gerekir. Biz her zaman Fermentas rekombinant Pfu-Polimeraz kullanın. Amplifikasyon adımları ile ilgili sorunlar var ise daha yüksek bir kalite polimeraz deneyebilirsiniz, ama bir çok amaç için standart Pfu yeterli olacaktır. DNTP, polimeraz tampon ve su ile reaksiyona tamamlayın. 1.2 Thermocycling koşulları PCR şu şekilde ayarlanması gerekir. Ilk ve tekrarlayan denatürasyon faz 95 ° C 30sn ayarlanır Primerlerin tavlama sıcaklığı, karmaşık formüller ile hesaplanır olmamalıdır. Biz genellikle, tavlama sıcaklığı 55 ° C ve bir dakika tavlama zaman ayarlayın. Çoğunlukla kullanarak 25 - 30 nükleotidlerin primerler için, bu bizim için zaman% 95 çalışır. Ve 60 ° C - Bu işe gerekir Zaten, sadece tavlama sıcaklığı 50 arasında değişen deneyin Uzama sıcaklığı kullanmak polimeraz bağlıdır. Bu gösteri biz bir uzama sıcaklığı 72 çağrıları Fermentas Pfu Polimeraz ° C. Uzama süresi plazmid büyüklüğüne göre değişir. Biz her zaman kb başına 1 dakika hesaplamak ve buna bir ekstra dakika eklemekzaman. Örneğin, bir 9KB&#39;e plazmid uzama süresi olarak 10dk seçsin. 18 döngüleri, daha sonra kullanmak için yeterli plazmid mutasyona uğramış oluşturmak için yeterlidir. Düşük döngülerinin sayısını tutmak, aynı zamanda size zaman kazandırır. <img src="/files/ftp_upload/1135/figure1.png" alt="Şekil 1" width="600" height="287" /> Thermocycling reaksiyon sonra 1.3 Gelcheck Başarılı amplifikasyon bir elektroforez yaparak kontrol edilmelidir. Bisiklet bittikten sonra doğrudan reaksiyon 5 ul,% 1 TAE agaroz jel üzerine yerleştirin. Amplifikasyon başarılı olursa, farklı bir bant göreceksiniz. Ancak, yeni sentezlenen DNA jel üzerinde açıkça görünür değilse, bütün tepki çökelmesine denemek ve bir sonraki adım dönüşüm için kullanabilirsiniz. Bizim için bu, nadiren çalıştı ama denemeye değer. Reaksiyon işe yaramazsa, yapılacak en iyi şey, tavlama sıcaklığını ayarlamak için. 1.4 DpnI sindirim: Dönüşüm reaksiyon güçlü bir arka plan önlemek için önce bir şablon olarak görev orijinal plazmid uzaklaştırılmalıdır. Bu DpnI ile sınırlama sindirim yapılır. Bu kısıtlama endonükleaz sadece plazmid metil keser. Bir metil sahipken, tanıma ve kısıtlama sitesi sırası GAİK. DpnI ile sindirerek zaman sadece bir baraj izole edildiği orijinal unmutated plazmid + suşu kesim alır, metil değil, yeni sentezlenmiş mutasyona uğramış plazmid DpnI etkilenmez. Sadece reaksiyon 1-2 ul DpnI eklemek ve en az bir saat inkübe 37 ° °. Hızlı sindirimi DpnI kullanarak kuluçka süresi yaklaşık 15 dakika azaltılabilir. DpnI ve bu kısıtlamanın sindirim inkübasyon süresi kalitesi, büyük ölçüde unmutated plazmid ile arka plan ne kadar güçlü olacaktır belirler. 1.5 Dönüşüm: DpnI sindirim sonra plazmid yetkili E. dönüşebilmesi için hazır coli hücrelerinde. Sadece yetkili hücrelerin içine DpnI sindirim reaksiyon 5 ul eklemek ve laboratuarda önerildiği gibi, dönüşümü gerçekleştirmek. Bizim durumumuzda bu plazmid bakteri karışımı 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ve sonra 42 ° C&#39;de 90 sn ısı şok ısı şok yordamı kullanın. 200 ul SOC çözüm ekledikten sonra, bakteri, şiddetle, 1 saat boyunca 37 ° C sallayarak inkübe edilir 1 saat sonra bakterilerin agar ortamı seçme kaplanmıştır. 2.0 Gün iki 2.1 klonlar parçası 1 Eleme: klonların seçimi Çünkü mutasyon verimi% 100 değildir, sizin mutantlar için ekran gerekir. Biz bunu biz eklenen veya astar entegrasyon yoluyla silinen kısıtlama sitenin varlığı ya da yokluğu kontrol sınırlama sindirim. Bu amaçla genellikle sekiz koloniler pick up ve ertesi gün plazmid hazırlık için onları gece boyunca büyüyecek. 3,0 Gün üç 3.1 klonlar parçası 2 Tarama: Kısıtlama belirteç enzim ile sindirim Üçüncü gününde belirteç enzim Mini Hazırlık ve sonraki sınırlama sindirim gerçekleştirin. Jel sonra istenilen mutasyon taşıyan ve hangilerinin klonların hangisinin görebilirsiniz. Sınırlama sindirim kullanarak tarama yöntemi çok iyi çalışıyor. Bununla birlikte, sıralama başarılı mutasyon olduğunu teyit etmelidir.

<ol><li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuikChange+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">QuikChange site-directed mutagenesis.</a> Strategies. 9, 3-4 (1996).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Sitesi directed mutagenesis bir plazmid tarafından taşınan bir gen mutasyona hızlı bir şekilde sağlayan bir mutagenez yöntemdir. Tüm reaksiyon sadece bir gün içinde yapılabilir. Bu yöntemle, istenilen mutasyonları taşıyan ücretsiz primerler sadece bir çift ve Pfu-Polimeraz gibi bir redaksiyon polimeraz gerekecektir. Yeni sentezlenmiş plazmid restriksiyon enzim DpnI ile reaksiyon sindirerek ebeveyn plazmid ayrılabilir. Bu enzim sadece metillenmiş DNA sindirir. Bu nedenle sadece yeni sentezlenmiş plazmid dönüştürülebilir....

<table><tbody><tr><td>Pfu polimeraz (rekombinant veya doğal)</td><td>Fermentas</td><td>EP0571 veya EP0501</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı 10 mM </td><td>Fermentas</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DpnI veya DpnI Fast sindirim enzimi</td><td>Fermentas</td><td>ER1701</td><td></td></tr><tr><td>primerler</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>tuzsuz</td></tr></tbody></table>

tüm plazmidler homemade sitesi yönetmen mutagenez

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Tüm plazmid Site directed mutagenesis özgün bir plazmid biraz farklı varyasyonlarını oluşturmak için basit bir yoludur. Bu yöntem ile klonlanmış hedef gen doğrudan bir plazmid içine birkaç üslerinden ikame, silme veya ekleme tarafından değiştirilebilir. Sadece olmayan bir PCR tabanlı thermocycling reaksiyon, tüm plazmid yükseltme çalışır. Reaksiyon sırasında istenilen mutasyonu taşıyan mutajenik primerler, yeni sentezlenmiş plazmid entegre edilmiştir. Bu video öğretici bir plazmid temel yerine tanıtmak için kolay ve maliyet etkin bir şekilde göstermektedir. Protokol standart reaktifleri ile çalışır ve genellikle çok pahalı ticari kitleri, bağımsız. Bu protokolü uygulamak bazı ticari kitleri kullanılarak maliyeti ne sekizde bir tepkimenin toplam maliyetini düşürebilir. Bu video da sürecinde kritik adımlar yorum ve mutajenik primerler dizayn konusunda ayrıntılı talimatlar vermek.

Tüm plazmid Site directed mutagenesis özgün bir plazmid biraz farklı varyasyonlarını oluşturmak için basit bir yoludur. Burada temel yerine plazmid kullanarak standart reaktifleri tanıtmak için kolay ve maliyet etkin bir şekilde göstermektedir.

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Tüm plazmitlerin bölgeye özgü mutasyona uğratılması, orijinal bir plazmitin hafifçe farklı varyasyonlarını oluşturmanın basit bir yoludur. Bu yöntemle klonlanmış...

Merhaba. Benim adım Mark Blo. Almanya'daki Mines Üniversitesi'nde biyoloji alanında yüksek lisans öğrencisiyim. Bugün, arkadaşım Kajo ve ben size ev yapımı bölgeye özgü nörogenezin nasıl gerçekleştirileceğini göstermek istiyoruz.Yöntem başlangıçta Ethal tarafından geliştirilmiş ve daha sonra birçok kişi tarafından adapte edilmiştir. Bu nedenle, bugün internette araştırma yaptığınızda, bazı noktalarda az veya çok farklılık gösteren pek çok farklı protokolle karşılaşabilirsiniz. Bugün size, bizim için iyi sonuç veren basit ve maliyet etkin bir yöntemi göstermek istiyoruz.Hadi başlayalım. Bu deney için termosabit proofreading DNA polimerazına ihtiyacınız var. Biz her zaman Fermentas'ın PFU polimerazını kullanıyoruz. Mantıken.Ayrıca polimeraz tamponuna, dNTP karışımına ve suya ihtiyacınız vardır. Dahası, restriksiyon enzimine, DpnI'e, kompetan e. coli hücrelerine, bir agar plakasına, bakteri kültür suyuna ve bir grup kürdana ihtiyacınız olacaktır. Bu yöntemin en temel ve kritik kısmı, mutajenik primerlerin tasarlanmasıdır.Primer çiftinizi tasarlarken göz önünde bulundurmanız gereken birkaç basit kılavuz bulunmaktadır. Primerler birbirini tamamlayıcı olmalı ve uzunlukları 25 ile 45 nükl

homemade-site-directed-mutagenesis-of-whole-plasmids

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, belirli bir hedef dizisi için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Escherichia coli, in vivo olarak yapılan bu yöntem, yeni enzimatik faaliyetleri gelişmeye fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl kullanılabileceğini göstermek.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

Kaynak: Tomás, J. M. ve diğerleri. Bakteriyel Glikosiltransferazların Bakteriyel Hareketlilikteki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretimi. J. Vis. Uzm. (2022).Bu video, E. coli'de  bir intihar plazmitinin başlatıcıya bağlı amplifikasyonunu göstermektedir.Bir antibiyotik direnç geni taşıyan plazmit, yalnızca konakçı tarafından kodlanan bir başlatıcı proteinin varlığında çoğalır. Elektroporasyon ve geri kazanım ortamında inkübasyondan sonra, karışım antibiyotik içeren agar üzerine...

Bir Bakteriyel Konakçıda İntihar Plazmidinin Amplifikasyonu

Kaynak: Lea-Smith, D.J., ve diğerleri. Model Siyanobakteriyel Türlerde İşaretli ve İşaretsiz Mutantların Üretimi. J. Vis. Uzm. (2016)Video, siyanobakterilerde antibiyotik işaretli mutantlar üretmek için bir yöntem göstermektedir. Protokol, siyanobakterilerin kültürlenmesiyle başlar, ardından yüzey pililerini koruyan santrifüjleme ve yıkama adımları gelir. Daha sonra homolog dizilerle çevrili bir antibiyotik direnç geni taşıyan bir plazmit eklenir. İnkübasyon sırasında, plazmit pili yoluyla...

Homolog Rekombinasyon Yoluyla Siyanobakterilerde Antibiyotik İşaretli Mutantların Üretilmesi

Biz yüksek verimli sıralama kullanan proteinlerin kapsamlı tek site doyma mutagenezi kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirme için bir protokol mevcut. Daha da önemlisi, bu yaklaşım kütüphane inşaatı ve sıralama multipleks dik primer çiftleri kullanır. ampisilin klinik olarak anlamlı bir doz için seçilen TEM-1 β-laktamaz kullanılarak Örnek sonuçlar verilmiştir.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Genetik kod genişleme biyolojik süreçler, protein asetilasyon dahil olmak üzere geniş bir çalışma için güçlü bir araç olarak hizmet vermektedir. Burada biz homojen oluşturmak için bu teknik yararlanma facile bir protokol proteinler, Escherichia coli hücreleri belirli sitelerdeki acetylated göstermek.

Escherichia Coli proteinler Site-Specifically oluşturmak için Facile iletişim kuralı Acetylated

Bu makalede ayrıntılı bir metodoloji fisyon mayası bir hedef gen rasgele mutagenesis için. Örnek olarak, biz bir alt birim 19S proteasome ve ekran heterochromatin istikrarsızlaştırmak mutasyonlar için kodlar rpt4 +, hedef.

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Mutagenesis site yönettiği belirli mutasyonların Deoksiribonükleik asit (DNA) tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Bu iletişim kuralı site yönettiği mutagenesis ile 2 adım nasıl açıklar ve ilgi herhangi bir DNA parçası geçerlidir yaklaşım 3 adımlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR) dayalı.

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Yeni dizi özgüllüğü olan restriksiyon endokleazları kısmen dejenere olmuş bir diziyi tanıyan enzimlerden geliştirilebilir. Burada, NlaIV enziminin dizi özgüllüğünü değiştirmek için başarıyla kullandığımız ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokolün temel bileşenleri transkripsiyon/çeviri reaksiyonunun in vitro bölümleme ve yeni dizi özellikleri ile varyantların seçimidir.

In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

Mevcut protokol, HA, S glikoproteini, ilgili hibrid tip glikanlar ve yüksek mannoz oligosakkaritlerine CV-N bağlanmasını incelemek için SPR bağlanma testleri için yeni araçları açıklamaktadır. SPR, bu glikanlara dimerik veya monomerik CV-N'yi bağlamak için KD'yi belirlemek için kullanılır.

Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Burada, NgTET enzimini kullanarak bakteriyofajlardaki DNA modifikasyonlarını azaltmak, verimli ve izsiz CRISPR-Cas mutajenezi sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, biyoteknoloji ve faj terapisindeki uygulamalar için fajların genetik mühendisliğini kolaylaştırır.

NgTET Destekli CRISPR-Cas Sistemleri ile Hassas Faj Mutajenezi

Öğrenin, plazmitlerde hedefe yönelik mutagenez için basit ve maliyet etkin bir yöntemi. Bu teknik, moleküler biyoloji araştırmalarında gen fonksiyonlarını incelemek ve protein mühendisliği yapmak için kullanılır.

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Daha fazla video keşfet