Name: Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae askuslarının mikromanipülasyonla diseksiyonunu ve maya genetik analizinde diploid zigot seçimini. Bu yöntem, meyotik hücre manipülasyonu ve genotip belirleme için kritik teknikleri gösterir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarın laboratuvarda çalışma Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri, Yenilikçilik, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi ve Concordia Üniversitesi Kanada Vakfı tarafından finanse edilmektedir.

Diploid suşları İnşaatı Çiftleşme tarafından diploitler üretimi için protokol <ol><li> Ilk suşları YPD, ya da seçici besiyeri gerekirse, tek koloniler halinde dışarı vurdu olmalıdır. Iki haploid suşları, tam tersi çiftleşme tipi (yani Mata ve MATα) olmalıdır. </li><li> , Kısır bir aşılama döngü kullanarak iki haploid suşların biri bir koloni küçük bir bölümünü seçin. Yeni bir YPD plaka çizgi döngü bir kez plaka üzerinde düz bir çizgi üzerinde. Plakanın alt tarafında bir ok ile bir çizgi yönünde işaretleyin. </li><li> Aynı YPD plaka ikinci suşu için bu işlemi tekrarlayın. Bu kez ilk koloni dik çizgi, ilk çizgi ikinci kapısı. Ikinci bir çizgi yönünde Mark ve ikinci çizgi ilk haçlar alan unutmayın. Bu alan diploitler nerede üretilecek olacaktır. </li><li> 30 ° C gecede YPD plaka inkübe edin. </li><li> Replica plaka seçici ortama YPD plaka seçici yeni kurulan diploitler büyüme izin verecektir. </li><li> Tek koloniler oluşturmak için aynı seçici besiyeri üzerine tek bir koloni, eğer mümkünse, ya da diploid çizgi ve çizginin küçük bir bölümünü seçin. </li></ol> Asci Sporlanma ve sindirim Protokol <ol><li> Yukarıdaki plaka tek koloniler seçin ve (1cm x 1cm) sporlanma (DPT) plakaları yamaları küçük yapmak ve biçime girdiklerinde için 3-7 gün süreyle 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Sporlanma ışık mikroskobu altında her yama hücreleri bakarak kontrol edilebilir. Su 5-10 ul bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin hücreleri, damlacık bir lamel üstüne yerleştirin ve asci varlığı bakın. Asci kolayca bulunmayan Eğer inkübatör geri koymak. </li><li> Yamalar etkili sporlanma varsa, dörtlü suyu 100μL ile 15 mL steril konik tüp hazırlar. </li><li> 3mm aşılama steril bir döngü (hücre döngü ¼ kapsamalıdır) ve dörtlü suyu yerine bu sporlanma yama hücreleri seçin. Yavaşça girdap hücreleri çözümü ile döngü ve karıştırın düşmek için izin döngü. </li><li> 4-10mins (zymolyase ve gerginlik, konsantrasyon ve aktivite bağlı olarak) tetrad suyu (zymolyase içeren) bırakın. Ascospores çevreleyen hücre duvarı sindirim sağlar. </li><li> YPD bir plaka üzerinde inokulum bölgenin alt ve üst işaretleyin. </li><li> İsteğe bağlı. Reaksiyon buz gibi steril dH 2 O 1 ml ekleyerek kesilebilir Hücrelerin 5mins yerleşmek için izin ver. Süpernatantı çıkar 1mL sonra elle hafifçe karıştırın ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Sindirilir hücrelerinin 5μL 5. adımı atın ve yavaşça yerine önceden işaretlenmiş YPD plaka inokulum bölgede bir hat düşer. </li><li> Steril bir 3mm aşılama döngü ancak agar ile temas yaparken çok nazik bir çizgi damla 1-3 kez yaymak için kullanın. </li><li> (Adım 7 atlanırsa, bu dış hücre duvarı sindirim azalır ya da durdurmak olacak) agar içine absorbe sıvı izin verin. Diseksiyon mikroskobu geçin. </li></ol> Aşçı, diseksiyonu Protokol Şarkıcı MSM Sistemi 200 mikromanipülasyon mikroskop için açıklanan aşağıdaki protokol olduğunu unutmayın. Bu protokol bir Zeiss mikromanipülatör MR gibi manuel mikromanipülatör kullanıyorsanız küçük modifikasyonlar ile takip edilebilir. <ol><li> Plaka alanının yarısı hücreleri içeren ve yarısı boş bir bölge odaklanın. Yavaş yavaş bu alanın boş bir bölgede dokunur böyle odak noktası haline iğne getirin. Bu iğne, bir önceki kullanımından hücreleri içermediğinden emin sağlayacaktır. İğne ve agar arasındaki temas, yavaş yavaş odak noktası haline gelen bir koyu siyah bir daire olarak görülür. </li><li> Pozisyon A1 matris gidin ve tekrar agar delici bir işareti yapmak. Bu mikroskop tamamlanmadan önce alınırsa plaka yönünü belirlemek yardımcı olmaktır. </li><li> Arama moduna geçer. Bir asci bulun. Tercihen hücreler yayılmış alanlarda asci seçin. Hücre kümeleri alanlardan kaçının. Bir asci dört ascospores hala birbirlerine bağlı olmalıdır. İki ascospores diğer ikisine göre biraz daha büyük olabilir. Bir ascospore gevşek ve ascospores geri kalanına bağlı değil asci toplama kaçının. </li><li> Iğne ile bir TSKB&#39;ler Pick up. Yavaş yavaş plaka iğne kadar getirmek. microneedle gölgesi görülüyor, çizgi TSKB&#39;ler bu kadar duyulabilir. Siyah bir daire (iğne ucu) anahat görüldüğü kadar yine iğne yaklaşım. Bu daire ile tetrad dokunun ve sonra çabucak iğneyi çekin. Bir TSKB&#39;ler dört ascospores iğne uyulması ve herhangi bir ek hücreleri bu TSKB&#39;ler parçası değildir microneedle toplandı emin olun. </li><li> Microneedle uzak plakadan çekin ve matris (ilk TSKB için, gidin gidinkonumu A1). TSKB&#39;ler taşındı her pozisyonu dikkat edin. Microneedle plaka dokunmadan ve dört ascospores microneedle gelene kadar çekerek TSKB&#39;ler aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Nazik iğne kol veya YPD plaka tutan platform dokunarak bu adımı çok kullanışlıdır. </li><li> 3-5 adımları ve matris üzerine üst üste pozisyonlar yer asci aşağı asci, istenilen sayıda seçilmiş kadar tekrarlayın. </li><li> Her TSKB&#39;ler geri dönün ve platform ya da her ikisinin kombinasyonu hafifçe dokunarak, iğne ile alay tarafından ayrı dört hücre kırmak. Kadar her TSKB&#39;ler her ascospore dört satır ayrılmış matris yeni bir konuma geride bırakarak hücre seçin. </li><li> 30 ° C büyüme paterni gözlemlemek için birkaç gün için bir kuluçka YPD plaka koyun. </li><li> Replica plaka disseke hücrelerin seçici besiyeri gerekirse. </li></ol> Zigot Taşınması Protokol <ol><li> Tek koloniler elde etmek için uygun bir ortam üzerinde ters çiftleşme tipleri ile iki haploit suşları dışarı Streak. </li><li> Mate bu iki uzamanın yukarıda açıklandığı gibi ve 4 ila 6 saat (ya da gerekirse bir gecede) büyümesine izin. </li><li> Zigot bir ışık mikroskobu altında olup olmadığını kontrol edin. Zigot ya veya bir tomurcuk olmadan dambıl şekilli hücreler olarak görünecektir. </li><li> 3mm aşılama döngü (hücre döngü ¼ kapsamalıdır) hücreleri Pick up ve steril dH 2 O 100μL yavaşça yerine </li><li> YPD bir plaka üzerinde inokulum bölgenin alt ve üst işaretleyin. </li><li> 5μL alın ve yavaşça yerine önceden işaretlenmiş YPD plaka inokulum bölgede bir hat düşer. </li><li> 3mm bir aşılama döngü ancak agar ile temas yaparken çok nazik bir çizgi damla yaymak için kullanın. </li><li> Agar içine sıvı emmesine izin verin. Diseksiyon mikroskobu geçin. </li><li> Plaka alanının yarısı hücreleri içeren ve yarısı boş bir bölge odaklanın. Yavaş yavaş bu alanın boş bir bölgede dokunur böyle odak noktası haline iğne getirin. Bu iğne, bir önceki kullanımından hücreleri içermediğinden emin sağlayacaktır. İğne ve agar arasındaki temas, yavaş yavaş odak noktası haline gelen bir koyu siyah bir daire olarak görülür. </li><li> Pozisyon A1 matris gidin ve tekrar agar delici bir işareti yapmak. Bu mikroskop tamamlanmadan önce alınırsa plaka yönünü belirlemek yardımcı olmaktır. </li><li> Arama moduna geçer. Zigot bulun. </li><li> Iğne ile bir zigot Pick up. </li><li> Place matris üzerine tek tek zigot. </li><li> Zigot birkaç gün büyümesine izin verin. </li><li> Uygun seçici besiyeri üzerine Replica plaka zigot. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> Şekil 1: zıt eşleşme türleri iki haploid suşlarının çiftleşme diploid gerginlik üretir. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> Şekil 2: (A), ısıya duyarlı bir suş (leu2 auxotrophy) ve vahşi bir tür zorlanma (LEU2) arasında bir çiftleşme thre sonuç ile YPD plaka . Sindirilmiş hücreleri iki siyah çizgiler arasında kalın bir büyüme görülür soldaki inokulum bölgede yayılır. Disseke edilmiş Asci eşit sağ tarafta matris aralıklı büyür. (B) (A) plaka bir SD-Leucine terk tabağa çoğaltılır. LEU2 belirteç için geçerli bir ascospore disseke gösteren 02:02 büyüme unutmayın. (C) (A) plaka YPD bir tabağa çoğaltılır ve 37 ° C&#39;de inkübe edildi Daha bir ascospore disseke olduğunu doğrular 02:02 büyüme unutmayın.

<ol><li>Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).</li>
</ol>

Maya diseksiyonu istenilen işaretleri ile yeni türler seçmek için yararlı bir araçtır. Dört ascospores teorik büyüme modelini belirlerken vejetatif hücre genotipi bakmak önemlidir. Bir plazmid varsa bu ascospore (ler) plazmid almak ve manipüle olan suşları ile ilgili tahmin ve sonuçları etkileyecek etkileyecek gibi, tek, düşük veya yüksek kopya ise, bilmeniz gerekir. Bazı suşlarının diğerlerine göre daha kısa bir süre içinde birçok ascospores üreten iyi biçime girdiklerinde yapabilirsiniz. D...

<table><tbody><tr><td>Singer MSM System 200</td><td>Mikroskop</td><td>Singer Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>SOR508</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Reaktif</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493</td><td></td></tr><tr><td>Maya ekstresi</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>PEP 403</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoz</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Maya nitrojen bazı</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>YNB406</td><td></td></tr><tr><td>Bio-tripton</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum asetat</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>POA 301</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003</td><td></td></tr><tr><td>Adenin sülfat</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>ADS201</td><td></td></tr><tr><td>L-urasil</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>URA 241</td><td></td></tr><tr><td>L-triptofan</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP 100</td><td></td></tr><tr><td>L-histidin</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>HIS 200</td><td></td></tr><tr><td>L-arginin</td><td>Reaktif</td><td>Amresco</td><td>0877-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-metiyonin</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>MET 222</td><td></td></tr><tr><td>L-tirozin</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>TYR 333</td><td></td></tr><tr><td>L-izolösin</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>ISO 910</td><td></td></tr><tr><td>L-valin</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>VAL 201</td><td></td></tr><tr><td>L-lizin</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>LYS 101</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanin</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>PHA 302</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamik asit</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU 202</td><td></td></tr><tr><td>L-treonin</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>THR002</td><td></td></tr><tr><td>L-lösin</td><td>Reaktif</td><td>BioShop Canada</td><td>LEU 222</td><td></td></tr></tbody></table>

diseksiyonu saccharomyces cerevisiae asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Maya, son derece uysal bir model sistem birçok farklı hücresel süreçleri incelemek için kullanılır. Ortak bir laboratuvar suşu<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Haploit ya da diploid devlet var. Iki haploids allel birleştirmek için yeteneği ve genom değişiklikler tanıtmak için yeteneği asci üretim ve diseksiyon gerektirir. Asci haploid hücrelerin üretimi diploid gerginlik üretmek için uyumlu çiftleşme tipleri ile iki maya haploid suşları çiftleşme ile başlar. Bu katı besiyeri veya sıvı ya yollarından bir dizi yapılabilir. Haploid suşlarının ya göre seçici büyüme teşvik orta diploitler seçmek için avantajlıdır. Asci, dört haploit kızı hücreleri diploid mayotik üreme kaynaklanan bir paket oluşturmak için besin fakir orta biçime girdiklerinde diploitler sonra izin verilir. Vejetatif hücreleri ve asci karışımı daha sonra asci ascospores çevreleyen zar kese sindirmek için enzim zymolyase ile tedavi edilir. Diseksiyon mikroskobu altında, tek bir bireyin asci pick up ve dört ascopores ayrı ve yerlerini değiştirebilirsiniz bir microneedle mikromanipülasyon kullanma. Disseke asci birkaç gün büyüdü ve uygun seçici ortama çoğaltma kaplama faiz belirteçler veya allel için test edilmektedir.

Maya hücreleri Mikromanipülasyon diploid zigot seçmek için mayotik genetik analiz için gerekli. Bu micromanipulations diseksiyon mikroskobu microneedle kullanılarak yürütülmektedir. Microneedle, hücreleri taşınmaya kullanılır ve otomasyon çeşitli derecelerde mevcuttur mikromanipülatör tarafından kontrol edilir.

Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

Maya, birçok farklı hücresel süreci incelemek için kullanılan, çalışmaya oldukça uygun bir model sistemdir. Yaygın laboratuvar suşu Saccharomyces cerevisiae ...

Bu prosedür, genetik olarak farklı iki haid maya hücresinin çiftleştirilmesiyle başlar. Diploidler, yalnızca diploidlerin büyümesine izin veren bir ortama replika ekimi yapılarak seçilir. Ardından diploidler, askus oluşumu için sporülasyon plaklarına aktarılır.Asci, haploitler plaka üzerinde belirlenmiş bir konuma yerleştirilecek şekilde disseke edilir. Oluşan haploitler görünür bir koloni boyutuna ulaştığında, tekil hücrelerin genotipini belirlemek için plaka seçili besiyerine replike edilir. Merhaba, ben Adrian Morris.Ben Audrey Mahe. Montreal'deki Concordia Üniversitesi'nden Dr. Michael Satcher'ın laboratuvarından geliyoruz. Bugün size, genellikle ra olarak adlandırılan maya hücrelerinin diseksiyon prosedürünü göstereceğiz.Yeni genotiplere sahip haplo D suşlarını eğitmek ve iki mutasyonun bir arada etkilerini incelemek için laboratuvarımızdaki bu prosedürü kullanın. Öyleyse başlayalım. Diploid bir suş oluşturmak için, zıt çiftleşme tiplerine sahip iki haplo suş çiftleştirilir. Haplo suşlar öncelikle, bizim durumumuzda uygun medya olan YPD üzerine ekilir; tekil koloniler üretmek için steril bir ekim özesi kullanarak, iki haplo suştan birinin kolonisinden küçük bir kısım alınır ve yeni bir YPD plakasına çizgi ekim yapılır.Plaka boyunca düz bir hat oluşturduktan sonra, çizginin yönünü plakanın altına bir okla işaretleyin. Ardından, aynı YPD plakasındaki diğer haplo suşundan küçük bir koloni parçası alın. Koloniyi ilk suşa dik olacak şekilde ekerek, ikinci çizginin yönünü belirterek ilk çizgiyle ikinciyi kesinleştirin.Ve ikinci çizginin birinciyi kestiği bölgeyi not edin. Diploidlerin üretileceği yer burası olacaktır.YPD plakasını 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Gece boyunca süren inkübasyonun ardından, yeni oluşan diploidlerin büyümesine seçici olarak izin verecek olan seçici besiyerine YPD plakasından replika plakalama yapın. Plakayı 30 °C'de gece boyunca inkübe edin.Diploidler plaka üzerinde büyüdüğünde, mümkünse tek bir koloni seçin veya diploid çizgisinin küçük bir kısmını tek koloniler oluşturmak için aynı seçici ortama yeniden çizin. Diploid suş elde edildikten sonra, tekli koloniler seçin ve sporülasyon plakalarına küçük yamalar yapın. Sporülasyon gerçekleşmesi için 30 degrees Celsius'ta üç ila yedi gün inkübe edin.Sporülasyonu kontrol etmek için, her bir yamadaki hücreleri ışık mikroskobu altında inceleyin. Hücreleri, 5 ila 10 µL su içeren bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin.Damlacığın üzerine bir lamel yerleştirin ve askus varlığını kontrol edin. Eğer askus yoksa veya kolayca bulunamadıysa, plakayı inkübatöre yerleştirin. Yamalardan birinde etkili sporülasyon gerçekleşmişse, 100 µL tetra suyu içeren steril 15 mL'lik konik bir tüp hazırlayın.Bu sporülasyon yamasından steril üç milimetrelik bir ekim özesi ile hücreler alın ve tetrad suyuna yerleştirin. Hücrelerin özeden düşmesini ve solüsyonla karışmasını sağlamak için öze ile hafifçe döndürme işlemi yapın. Hücreleri tetrad suyunda dört ila 10 dakika bekletin.Bu işlem, ASCO sporlarını çevreleyen hücre duvarının sindirilmesini sağlar. Askusların diseksiyonu için bir plaka hazırlamak üzere, bir YPD plakasındaki inokülasyon bölgesinin üst ve alt kısımlarını işaretleyin. Hücreler yeterince sindirildiğinde, sindirilmiş hücrelerden 5 µL alın ve steril 3 mm'lik bir ekim halkasıyla, önceden işaretlenmiş YPD plakasının inokülasyon bölgesine damlalar halinde nazikçe bir hat şeklinde yerleştirin.Siviyi, burguca çok hafifçe temas ederek, bir ila üç kez aynı hizada nazikçe yayın. Sıvının burguca emilmesini bekleyin. Artık askusların diseksiyonuna başlamaya hazırsınız.Askuların diseksiyonuna başlamak için, diseksiyon plakasını singer MSM system 200 mikromanipülasyon mikroskobunun altına yerleştirin. Plakanın, görüş alanının yarısının hücreler içerdiği ve diğer yarısının boş olduğu bir bölgesine odaklanın. İğneyi, alanın boş olan bölgesine değecek şekilde yavaşça odağa getirin.İğnenin agarla teması, yavaşça netleşen koyu siyah bir daire şeklinde görülür. İğne agara temas ettikten sonra, iğneyi hafifçe geri çekerek iğnenin agara değdiği alana herhangi bir hücre birikmediğinden emin olun. Bu işlem, iğnenin önceki kullanımlardan kalan hücreler içermediğini garanti eder.A1 konumundaki matrise gidin ve burguyu batırarak bir işaret koyun. Bu işlem, plakanın yönünü belirlemeye yardımcı olmak içindir. Eğer çıkarılırsa, diseksiyon tamamlanmadan önceye dönülmüş olur.Arama moduna geçin. Bir askus bulun. Bir askustan gelen dört ASCUS sporu hâlâ birbirine bağlı olmalıdır.İki ASCUS sporu diğer ikisinden biraz daha büyük olabilir. Bir ASCA sporunun gevşek olduğu ve diğer ASCA sporlarına bağlı olmadığı askusları seçmekten kaçının. Bir askusu almak için iğneyi yavaşça plağa yaklaştırın.Mikroiğnenin gölgesi göründüğünde, onu toplanacak ascus ile hizalayın. Siyah bir daire taslağı görünene kadar iğneyi hareket ettirin. Bu daire ile tetrada dokunun ve ardından iğneyi hızla geri çekin.Bir askus içindeki tüm dört askus sporunun iğneye yapıştığından ve mikroiğne ile bu askusun parçası olmayan ek hücrelerin alınmadığından emin olun. Askus mikroiğne ile alındıktan sonra, mikroiğneyi plakadan uzağa çekin ve matrise geçin. İlk askus için a1 konumuna gidin.Mikro iğne ile plakaya dokunup dört ascus sporu da mikro iğneden ayrılana kadar geri çekerek ascusları yerleştirin. Bu aşamada, iğne koluna veya YPD plakasını tutan platforma nazikçe vurmak genellikle faydalıdır.İstenen sayıda askus elde edilene kadar, matris üzerindeki ardışık pozisyonlarda askusları belirlemeye, seçmeye ve yerleştirmeye devam edin. Bir askusun yeniden yerleştirildiği her pozisyonu kaydedin. İstenen sayıda askus seçildiğinde, her bir askusa geri dönün ve iğne ile hafifçe ayırarak, platforma nazikçe vurarak veya her iki yöntemi birlikte kullanarak dört hücreyi birbirinden ayırın.Bir tanesini bırakarak hücreleri alın. Kalanları transfer edin. E'yi matriste yeni bir konuma yerleştirin ve her bir sorgu tamamlanana kadar işlemi tekrarlayın.Her bir askustaki APO, dörderli sıralar halinde ayrılır. Askuslar üzerindeki bir disseksiyon işlemi tamamlanır. Büyüme modelini gözlemlemek için YPD plağını birkaç gün boyunca 30 °C'deki bir inkübatöre yerleştirin.Diseke edilen askuslar büyüdüğünde, bunları selektif ortama replika platlama yöntemiyle aktarın. Gerekirse, bu işlem replika platlanmış hem orijinal diseksiyon plağının hem de selektif plağın gece boyunca büyütüldüğü bir plakla yapılır. Selektif plakta görülen sonuçlar skorlanmalı ve uygun haplo hücre tanımlanarak seçilmelidir.Diploidlerin selektif plaklarda tanımlanamadığı durumlarda, çiftleşme sonrası erken bir evrede kolayca tanımlanabilen ve zigot olarak adlandırılan çiftleşmiş haplolar manuel olarak seçilmelidir. Haplo hücrelerin hazırlanması ve çiftleştirilmesi prosedürü, diploidin bulunması gereken bölgenin 30 °C'de daha kısa inkübasyon sürelerinden sonra incelenmesi dışında, daha önce açıklananla aynıdır. Dört ila altı saatin iyi bir başlangıç noktası olduğunu saptadık, ancak sürenin nihai olarak ampirik olarak belirlenmesi gerekir.Işık mikroskobu altında zigotları kontrol edin; zigotlar, tomurcuklu veya tomurcuksuz, dambıl şeklinde hücreler olarak görünecektir. Üç milimetrelik bir ekim halkasıyla hücreleri alın ve nazikçe 100 µL steril suyun içine yerleştirin. Hücreler önceden işaretlenmiş bir YPD plağına aktarıldıktan sonra, agarla çok az temas ederek damlaları nazikçe bir hat şeklinde yaymak için üç milimetrelik bir ekim halkası kullanın. Sıvının agar tarafından emilmesini bekleyin.Diseksiyon mikroskobuna geçiniz. Plakanın, görüş alanının yarısının hücrelerle dolu, diğer yarısının ise boş olduğu bir bölgesine odaklanınız. İğneyi, alanın boş bölgesine değecek şekilde yavaşça odağa getiriniz.Daha önce gösterildiği gibi. İğnenin önceki bir kullanımdan kalan hücreler içermediğini kontrol edin. A1 konumundaki matrise gidin ve burguyu delerek bir işaret koyun.Plakanın yönünü belirlemeye tekrar yardımcı olmak için, arama moduna geçin ve bir zigot bulun. Zigotu iğne ile alın.Zigotları matris üzerine tek tek yerleştirin. Zigotların birkaç gün boyunca büyümesine izin verin. Diploit hücreleri sporülasyon plakalarına aktarın ve üçüncü bölümdeki gibi işleme devam edin.Zıt çiftleşme tiplerine sahip iki haplo suşun çiftleşmesi, diploid bir suş oluşturur. Bu YPD plakası, lu iki ox atrofilerine sahip sıcaklığa duyarlı bir suş ile yaban tip bir suş arasındaki çiftleşmenin sonuçlarını göstermektedir. Sindirilmiş suşlar, sol taraftaki inokülum bölgesine yayılmıştır ve burada iki siyah çizgi arasında yoğun bir büyüme görülmektedir.Diseke edilen askuslar, sağdaki matris üzerinde eşit aralıklarla büyütülmüştür. Bu YPD plakası bir SD lösin eksikliğindeki plakaya replike edildiğinde, LU iki markörü için ikiye iki büyüme görülmekte olup bu durum geçerli bir ASCO sporunun diseke edildiğini göstermektedir. Orijinal YPD plakası ayrıca başka bir YPD plakasına replike edilmiş ve 37 °C'lik daha yüksek bir sıcaklıkta inkübe edilmiştir; buradaki ikiye iki büyüme, bir ASCO sporunun diseke edildiğini daha da doğrulamaktadır.Size iki adet haid hücresi oluşturmayı ve diploidleri seçmeyi gösterdik. Biri trofik markerları kullanan, diğeri ise hücre morfolojisine dayanan iki farklı yöntem kullanılmıştır. Bu prosedürü uygularken, yeni oluşturulan haid hücrelerini, atrofik markerların öngörüldüğü gibi temsil edildiği bir tetra diseksiyonu ile seçmeyi hatırlamak çok önemlidir.Ayrıca, aşırı sindirimin veya yetersiz sindirimin önüne geçmenin önemli olduğunu hatırlamak gerekir. Aşırı sindirilmiş tetraadlar, tetraad yapısını koruyamayarak dağılırken; yetersiz sindirilmiş tetraadları ise birbirinden ayırmak güçtür. İşte bu kadar.Deneylerinizde başarılar dileriz.

dissection-of-saccharomyces-cerevisiae-asci

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz invaziv ve pseudohyphal farklılaşması bir önlem olarak maya yapışma ve agar işgali için kalitatif bir testtir açıklar. Bu basit testi çeşitli mutant gibi invaziv fenotip etkileri çevresel ipuçlarını değerlendirmek ve maya farklılaşma sinyalizasyon yollar kullanılabilir.

S. cerevisiae yapışma ve Agar Invasion için Testi

Steril koşullar altında toplanması için bir prosedür Gibberella zeae ascospores gelişim süreçleri incelemek için en üst düzeyde protokol açıklamasına bilgi üretmek için filme. Bu deney, çok önemli bir yönü tam genom ekspresyon profil testleri uygulanmaktadır tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak gerekir.

Gibberella zeae Ascospore Üretim ve Tahsilat Mikroarray deneyler için.

Işık ve elektron mikroskopi için kesit maya kolonileri izin gömmek için bir yöntem. Bu protokol, bir mantar toplum içinde hücre tiplerinin organizasyon anlayışına yönelik yeni bir araç sağlayan koloniler içinde sporulated hücreleri ve pseudohyphal hücrelerin dağılımı belirliyor.

Maya Colony Gömme Yöntemi

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

Cinsel haçlar ve rekombinant döl izolasyonu, ipliksi mantar için önemli araştırma...

Cinsel Gelişim ve askopor Deşarj Fusarium graminearum</em

Biz floresan hücrelerin iç kalıplarını gözlemlemek maya topluluklar donma ve cryosectioning için bir protokol mevcut. Yöntem metanol-sabitleme dayalıdır ve bir topluluk içinde floresan proteinleri inaktive olmadan hücrelerinin mekansal dağılımını korumak için OCT-katıştırma.

Floresans Desenler incelenmesi için Maya Toplulukları Cryosectioning

Tomurcuklanan mayadan yüzeye yayılan kromozomlar için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem, daha önce Loidl ve Klein tarafından açıklanan bir yöntemden türetilmiştir. Ek olarak, yayılmış kromozomların immün boyaması için bir prosedür gösteriyoruz.

Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün

Burada taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak hassas doku örneklerinin görüntülenmesi için ayrıntılı işleme protokolleri salıyoruz. Üç farklı işleme yöntemi, yani, hexamethyl disilazana (HMDS) kimyasal kurutma, basit hava kurutma, ve kritik nokta kurutma sert yumurta kabukları hazırlamak için açıklanmıştır, erken gelişim aşamalarında embriyolar, ve mantar kültürleri sırasıyla.

Taramalı Elektron Mikroskobu için Embriyo, Yumurta Kabuğu ve Mantar Kültürünün İşlenmesi

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Bu çalışma, farklı yaşlarda farenin iç kulağından endolenfatik kesenin nasıl diseksiyon yapılacağını açıklamaktadır. Benzer bir diseksiyonun sonucu, endolenfatik kesenin genişlemesinin bir Slc26a4-null fare modelinde gösterilmiştir. Endolenfatik kese içinde eksprese edilen bir floresan raportöre sahip bir transgenik fare, endolenfatik kesesi kolayca görselleştirmek için bir model ve eğitim aracı olarak sunulmaktadır.

Farelerden Endolenfatik Kesenin Diseksiyonu

Bu protokol, mayaların ve küf Aspergillus fumigatus'un 7 gün gibi kısa bir sürede büyük toprak numunelerinden kültürlenmesi için etkili ve hızlı bir yöntemdir. Yöntemler, deneyler için gerektiğinde bir dizi inkübasyon ortamına ve sıcaklığına uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir.

Mantar Popülasyon Yapısını Araştırmak için Kültürlenebilir Maya ve Küflerin Topraklardan İzolasyonu

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae askuslarının mikromanipülasyonla diseksiyonunu ve maya genetik analizinde diploid zigot seçimini. Bu yöntem, meyotik hücre manipülasyonu ve genotip belirleme için kritik teknikleri gösterir.

Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

Daha fazla video keşfet