Hazırlanması Drosophila Embriyolar
13 Mart 2009
Drosophila embriyolar canlı görüntüleme analizi hazırlama, basit, ucuz ve etkili bir yöntem sunulmuştur. Bizim protokol nem ve gaz değişimi sağlar ve Drosophila embriyo sıkıştırmak değil. Bu yöntem, GFP tabanlı bir stereomikroskopta ya da dik bileşik mikroskop kullanarak Drosophila embriyoların canlı görüntüleme için uygundur.
Merhaba. Benim adım Bruce Reed. Kanada'nın Ontario eyaletindeki Waterloo şehrinde bulunan Waterloo Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nde yardımcı doçentim. Bugün, canlı görüntüleme analizi için yumuşak embriyolarınızı hazırlamak amacıyla geliştirdiğimiz yeni bir tekniği belgelemek için bu video arşivini oluşturuyoruz.
Drosophila embriyoları kullanılarak canlı görüntüleme analizi gerçekleştirirken sıklıkla zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleme yapıyoruz ve bu işlem birkaç saat sürebiliyor. Bu nedenle, embriyoların hem dehidrasyondan hem de hipoksiden korunduğu bir tekniğe sahip olmak önemlidir. Ayrıca, embriyonun herhangi bir sıkışmasını önleyecek bir teknik geliştirmek istiyoruz.
Montaj için, asılı damla hazırlığı adını verdiğimiz çok basit, ucuz ve etkili bir yöntem geliştirdik. Asılı damla hazırlığı, stereo mikroskopi veya herhangi bir dik bileşik mikroskop kullanılarak embriyoların canlı görüntüleme analizleri için uygundur. Bu zaman ayarlı film, asılı damla protokolü kullanılarak hazırlanan ve zaman ayarlı floresan mikroskopi ile görüntülenen GFP eksprese eden sekiz embriyoyu göstermektedir.
Bu görüntüleme dizisi, dört saatten fazla geçen süreyi temsil etmektedir. Hareketin başlaması, bu embriyoların canlı durumda olduğunu göstermektedir. Şimdi size, Asılı damla protokolünün nasıl uygulanacağına dair detaylı ve adım adım bir açıklama sunacağız.
Embriyolar standart üzüm suyu, yumurta veya plakalardan toplanır. Fly max scientific equipment firmasından alınan otomatik bir dsof FLA yumurta toplayıcısı kullanılarak, önceden belirlenmiş bir gelişim aşamasındaki embriyoların senkronize şekilde toplanması sağlanır. Embriyoların el ile dekore edilmesine hazırlık amacıyla, bir lam üzerine çift taraflı yapışkan bant bir parçası yapıştırılır ve bandın koruyucu arka kısmı çıkarılır.
Sarkan damla protokolü, beş milimetre kalınlığında polikarbonat plastik levhadan yapılmış özel bir hazne gerektirir. Levha, bir mikroskop lamı boyutlarında kesilir ve bir rotor ile üç milimetre derinliğinde bir oyuk oluşturulur. Canlı görüntüleme haznesinin nemlendirmesi, haznedeki kuyucuğa sığacak şekilde kesilen ve distile su ile ıslatılan bir parça doku kullanılarak gerçekleştirilir.
Halo Karbon yağı, gaz geçirgen ve optik olarak şeffaf olduğu için canlı görüntüleme koordinasyonlu drosophila embriyoları için idealdir. Halo karbon yağı seri 700 ve seri 56'nın bir bir oranında karıştırılması, Drosophila embriyolarıyla çalışmaya uygun bir viskozite sağlar. Embriyolar, kuyumcu pensi veya çok ince bir boya fırçası kullanılarak üzüm suyu agar plakalarından toplanabilir.
Embriyolar birbirine ve pens uçlarına yapışır. Kolayca kümeler halinde, embriyo kümeleri şeklinde toplanırlar. Penseye tutunurlar.
Uçlar, daha önce hazırlanmış dekorasyon lamı üzerindeki bandın yapışkan yüzeyine nazikçe indirilir. Embriyolar stereo mikroskop altında izlenirken, forsepsin yan tarafıyla onlara hafifçe dokunulur veya sıvazlanır. İç vilin membranını yırtmadan koronayı açmanız gerekir.
Bu işlem sabit bir el, sabır ve biraz pratik gerektirir. Dış korona yırtıldıktan sonra, deklorine edilmiş embriyo forsepe yapışma eğilimindedir. Deklorine edilmiş embriyonun bandın yapışkan yüzeyine temas etmemesine dikkat edin.
Onu banttan hızlıca geri almak çok zor olabilir, deklorine edilmiş embriyoları haloya aktarın. Lamel üzerine karbon yağı damlaları ekleyin. Bunu yakınınızda tutmak iyi bir fikirdir. Pensetin ucunu halo karbon yağı damlasının yüzeyine dokundurarak işlemi gerçekleştirin.
Bir sonraki embriyoyu klorlamadan önce, embriyonun forsepsle yağ transferine aktarıldığı, siyah bir arka plan ve eğik açıyla ayarlanmış bir fiber optik aydınlatma kaynağı kullanılarak çıplak gözle doğrulanabilir. Halokarbon yağdaki kaldırma kuvvetleri nedeniyle forsepslerin üzerindeki yağı silmek faydalıdır. Koordineli embriyolar yağ damlacığının yüzeyinde yüzer.
Asılı damla protokolünde, embriyoları yağ damlacığının tabanına iterek ve lamel kapalı camı hızlıca ters çevirerek konumlarını ve yönelimlerini kontrol edebiliriz. Lamel kapalı camı, canlı görüntüleme odasının nemlendirilmiş kuyusunun üzerine ters çeviriyoruz. Lamel kapalı cam ters çevrildiğinde, embriyolar camın alt yüzeyine yaslanacaktır.
Embriyoların dinlenme konumları bir stereo mikroskop altında kontrol edilebilir. Tatmin edici değilse, işlem tekrarlanabilir. Embriyolar istenen konuma geldiğinde, lamel bant ile canlı görüntüleme haznesine sabitlenir.
Bant üzerinde delikler açılarak hazne havalandırılır. Embriyolar artık görüntüleme için hazırdır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, Drosophila embriyolarını canlı görüntüleme analizi için hazırlamaya yönelik basit ve etkili bir yöntem sunmaktadır. Protokol, embriyoların sıkışmasını önlerken uygun nem ve gaz değişimini sağlayarak yöntemi GFP tabanlı görüntüleme için uygun hale getirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Drosophila embriyolarının canlı görüntüleme analizi genellikle zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleme kullanılarak gerçekleştirilir.
- Embriyolar, uzun süreli görüntüleme seansları sırasında dehidrasyona ve hipoksiye karşı hassastır.
- Doğru görüntüleme için embriyoların sıkıştırılmasını önleyen bir teknik esastır.
- GFP tabanlı görüntüleme, optimal sonuçlar için belirli koşullar gerektirir.
Çalışmanın Amacı
- Drosophila embriyolarınıdehidratasyondan koruyan bir yöntem geliştirmek.
- Görüntüleme sırasında yeterli gaz değişimini sağlamak.
- Canlı görüntüleme sırasında embriyoların sıkışmasını önlemek.
Kullanılan Yöntemler
- Canlı görüntüleme için Drosophila embriyolarının hazırlanması.
- Görüntüleme oturumları sırasında nem kontrolünün uygulanması.
- Görüntüleme için stereomikroskop veya dik bileşik mikroskop kullanımı.
- GFP tabanlı görüntüleme tekniklerinin uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, embriyolar için nemi ve gaz alışverişini etkili bir şekilde korur.
- Embriyolar sıkıştırılmadan kalır, bu da daha iyi görüntüleme kalitesi sağlar.
- GFP tabanlı görüntüleme, uzun süreler boyunca net sonuçlar verir.
- Teknik, araştırmacılar için basit ve maliyet açısından uygundur.
Sonuçlar
- Bu yöntem, Drosophila embriyolarının canlı görüntüleme kalitesini artırır.
- Alandaki araştırmacılar için güvenilir bir yaklaşım sunar.
- Protokol, çeşitli laboratuvar ortamlarına kolayca uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Model organizmaların canlı görüntülemesi, erken keşif aşamasında hedef doğrulaması ve fenotipik tarama için kritik öneme sahiptir. Asılı damla protokolü, uzun süreli time-lapse görüntüleme sırasında embriyo canlılığını ve veri kalitesini bozandehidrasyon, hipoksi ve mekanik sıkıştırma gibi temel sınırlamaları giderir. Drosophila embriyolarının sıkıştırılmadan, fizyolojik olarak ilgili görüntülenmesine olanak tanıyan bu yöntem, genetik ve farmakolojik müdahalelerin mekanistik risk azaltma çalışmalarını ölçeklenebilir ve maliyet etkin bir formatta destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kompresyondan kaynaklanan mekanik artefaktlar olmaksızın, doku morfogenezi ve hücre adhezyonu gibi dinamik süreçlerdeki genetik düzenlemenin incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Embriyo canlılığını dört saatten fazla koruyarak gen fonksiyonunun ve yolak dinamiklerinin boylamsal gözlemini destekler.
- Öngörücü Değer: Stres kaynaklı fenotiplerden doğan yanlış pozitifleri azaltarak, hedef doğrulama analizlerindeki güvenilirliği artırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Çevresel değişkenliği en aza indiren, GFP tabanlı canlı görüntüleme için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir platform sağlar.
- Operasyonel Değer: Yüksek kapasiteli adaptasyona uygun, düşük maliyetli ve erişilebilir malzemeler (halokarbon yağı, polikarbonat hazne, bant) kullanır.
- Deney Hazırlığı: Pozisyonel stabiliteyi korumak için embriyoların yağdaki kaldırma kuvvetinden yararlanarak, zaman ayarlı (time-lapse) görüntülemede kaymayı azaltır ve sinyal tutarlılığını artırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: İnsan hastalık modelleriyle ilgili korunmuş gelişimsel süreçlerin görüntülenmesini destekleyerek türler arası ekstrapolasyonu kolaylaştırır.
- Mekanistik Risk Azaltma: Hücresel davranışların (örneğin, hücre ölümü, adhezyon) fizyolojik koşullar altında gözlemlenmesine olanak tanıyarak, sonraki preklinik modeller için öngörü güvenini artırır.
- Hastalıkla İlişkili Sistem: Hastalıkla ilişkili GFP raporlayıcıları eksprese eden Drosophila embriyoları, yolak modülasyonunu in vivo izlemek için kullanılabilir.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Asılı damla protokolü, hedef doğrulamadan öncül bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürecine uygundur; özellikle genetik olarak kodlanmış raporların dinamik ve sıkıştırılmamış görüntülenmesini gerektiren analizlar için idealdir.
- Keşif Biyolojisi: Gen susturma veya aşırı ekspresyonun embriyonik morfogenez üzerindeki etkilerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşik veya genetik durum etkilerini karşılaştırmak için gerekli olan kantitatif, zaman çözünürlüklü floresan okumaları sunar.
- Analitik: Morfometrik analiz ve fenotipik nicelik belirleme için uygun olan stabil, yüksek kaliteli hızlandırılmış çekim verileri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Drosophila'daki genetik bulguları korunmuş yolaklarla ilişkilendirerek omurgalı modeller için hedef seçimini bilgilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Protokolün basitliği ve düşük maliyeti, ekipler arasında standartlaştırılmış bir görüntüleme hazırlama yöntemi olarak yaygın şekilde benimsenmesini sağlar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Görüntüleme sırasında kompresyon artefaktlarını ortadan kaldırarak ve fizyolojik koşulları koruyarak öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış nem kontrolü, gaz değişimi ve embriyo yönetimi aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Tarama kampanyalarındaki biyolojik gürültüyü azaltarak assay hassasiyetini artırır ve hatalı pozitif oranlarını düşürür.
- Portföy Etkisi: Daha yüksek doğrulukta fenotipik veriler sağlayarak hedef doğrulamada daha güvenilir devam/dur kararları alınmasına olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Drosophila embriyosu işlemleri ve koryon giderme tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Hazne hazırlığı için halokarbon yağlara ve temel mikrofabrikasyon araçlarına erişime bağlıdır.
- Kullanıcılar arasında embriyo yaşı, genotipi ve montaj tutarlılığının standardize edilmesini gerektirir.
- Diğer model sistemlere uyarlanması, yağ kaldırma kuvvetinin ve hazne geometrisinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlama: Halokarbon yağda yüzer durumda kalan embriyolar için en uygundur; daha yoğun veya yapışkan hücre tipleri için uygulanamaz.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:00
Title
0:15
Introduction
1:52
Step 1: Collect Embryos
2:24
Step 2: Prepare a Dechorionation Slide
2:51
Step 3: Prepare Imaging Chamber
3:32
Step 4: Place Halocarbon Oil on a Coverslip
4:05
Step 5: Picking Embryos From Plates
4:38
Step 6: Place Embryos onto Tape
5:01
Step 7: Roll Embryos to Remove the Chorion
6:15
Step 8: Transfer Embryos to Halocarbon Oil
6:47
Step 9: Push Embryos to Bottom of Oil
7:14
Step 10: Invert Coverslip on Live Imaging Chamber
7:38
Step 11: Secure Coverslip with Tape
