S. cerevisiae "adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Bu prosedür, öncelikle bir hücre hattının büyütülüp ardından dizinin taze bir plakaya aktarılmasıyla bir CP one GFP dizisinin hazırlanmasıyla başlar. Aynı zamanda, taze bir DMA kopyası hazırlayın. Ardından, ACP one GFP dizisini DMA ile çiftleştirin ve diploidleri seçin; bu diploidler daha sonra sporülasyon ortamında sporüle edilir.

Beş gün sonra, Myotic progenileri, sadece MAT A haplo hücrelerinin büyüyebileceği LRK besiyerinde çimlendirilir. İki ek seleksiyon turu aracılığıyla, hem ACP one GFP taşıyan hem de kanmycine karşı geni nakavt edilmiş haplo hücreleri geri kazanılır. Son olarak, bireysel suşlar doğrudan plakadan seçilebilir ve konfokal mikroskopi ile mitokondri morfolojisi gözlemlenebilir.

Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Yaşam Bilimleri Enstitüsü'ndeki Hücre ve Gelişim Biyolojisi Bölümü'nden Law Lab'den Chap T. Merhaba, ben de yine Loan Lab'den Jesse Chao. Bugün sizlere, robotik bir sistem kullanarak mayadaki çeşitli mutant arka planlara GFP markerlarının entegre edilmesi için yüksek verimli bir yöntemi göstereceğiz.

Laboratuvarımızda D, endoplazmik retikulum ve mitokondri gibi organellerin morfolojisini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokol için iki farklı maya suşu kullanıyoruz.

CP one GFP, PKT 1 28 plazmidi kullanılarak PCR aracılı homolog rekombinasyon ile oluşturulan ve ACP one'ın C terminaline GFP etiketlemesi yapılmış bir suştur. Suş arka planı BY 7 0 4 3'tür. Ayrıca, temel olmayan genlerin yaklaşık 5.000 delesyon mutantından oluşan bir dizi olan DMA suşu veya delesyon mutant dizisini de kullanıyoruz.

Bu temel olmayan genlerin tamamı G four 18 üzerinde nakavt edildi. Dizinin suş arka planı BY 47 41'dir. ACP one GFP hücrelerinin büyümesini başlatmak için, beş mililitre gece boyu büyütülmüş ACP one GFP kültürünü bir hiss plakasına dökün.

Plakanın bir alev veya biyolojik güvenlik kabini yardımıyla yeterince kurumasını sağlayın. Kuruduktan sonra, plakayı gece boyunca 30 °C'de inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bir robot kullanarak A CP one GFP suşunu plaka başına 1.536 koloni olacak şekilde dizin.

Aynı zamanda, replica pinning yöntemiyle DMA'nın taze bir kopyasını dört adet YPDG plakasına hazırlayın. Ardından, suşlar büyüdükten sonra plakaları 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. DMA'yı replica pinning ile ve kolonileri YPD plakalarına overlay ederek tek bir GFP suşu oluşturun, plakaları 30 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Replika plak inkübasyonundan sonra, seçilmiş hücreleri belirlemek amacıyla kolonileri SD hiss G dört 18 plaklarına aktarın ve plakları 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Sporülasyon ve çimlenmeyi başlatmak için, bir sonraki adımda sporülasyon verimliliğini artırmak amacıyla diploidleri önce YPDG dört 18 plaklarına replika plak yöntemiyle aktarın. 30 °C'de bir gün inkübe ettikten sonra, mayotik spor oluşumunu tetiklemek için karbon ve azot kaynağı seviyeleri düşürülmüş olan geliştirilmiş sporülasyon ortamına diploidleri replika plak yöntemiyle aktarın.

Ardından, plakaları minimum beş gün boyunca 25 °C'de inkübe edin. İnkübasyon sonrası, kolonileri LRK besiyerine replika plakalama yöntemiyle aktararak mayotik progenye ait matı çimlendirin. Bu besiyeri, sporlardan tabloid hücrelerin çimlenmesini uyaracaktır; hem GFP alelini hem de tek mutant aleli taşıyan hücreleri seçmek için plakaları iki gün boyunca 30 °C'de inkübe edin.

Matt A hücreleri, gen delesyonu taşıyan haplo hücreleri seçmek için lade G four 18 besiyeri kullanılarak replika plaka yöntemine tabi tutulur; bu plakaları 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ardından, ACP one GFP'ye de sahip olan tekli mutantların büyümesini seçmek için mat a miyotik progenilerini L-H-R-K-G four 18 besiyerine replika plaka yöntemiyle aktarın ve 30 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Plakalar daha sonra 4 °C'de üç aya kadar saklanabilir. CP one GFP eksprese eden istenen mutantları doğrudan plaka üzerinden görselleştirmek için, öncelikle plakalardan istenen kolonileri seçerek başlayın. Hücreleri 30 °C'de YPD veya SD hiss ortamında erken log fazına kadar büyütün.

Son olarak, mutandları konfokal mikroskopi ile görselleştirin; bu konfokal görüntüdeki GFP filtre seti ile mitokondri morfolojisini incelemek amacıyla bir mutant ve ACP bir GFP işaretçisine sahip bir yabanı tip konfokal mikroskopi ile görselleştirilmiştir. Bu spesifik mutant, bozulmuş mitokondriyal fenotip sergilemektedir ve bu nedenle daha ileri araştırmalar için uygun bir adaydır. Robotik bir sistem kullanarak, multiklonal bir işaretçi olan CP bir GFP'nin delesyon mutant dizisine nasıl verimli bir şekilde dahil edileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedür uygulanırken, besiyerlerinin taze olarak hazırlanması ve plakaların kuruması için yeterli sürenin tanınması önemlidir. Ortam çok nemli olursa kondansasyon oluşur ve bu da kontaminasyon riskini artırır. Ayrıca, bu protokol için kritik öneme sahip olduklarından, tüm seleksiyon besiyerlerinin doğru şekilde hazırlandığından emin olmalısınız.

Bu prosedür diğer marker türleri için de kullanılabilir. Örneğin, er'i görüntülemek için rutin olarak air 11 ve GSP markerlarını kullanıyoruz. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.