S. cerevisiae "adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem
2 Mart 2009
GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.
Bu prosedür, önce bir hücre satırı büyüterek ve ardından diziyi yeni bir plaka üzerine sabitleyerek bir CP bir GFP dizisinin hazırlanmasıyla başlar. Aynı zamanda, DMA'nın yeni bir kopyasını hazırlayın. Daha sonra ACP bir GFP dizisini DMA ile eşleştiriyoruz ve daha sonra sporülasyon ortamında sporlanan diploidleri seçiyoruz.
Beş gün sonra, Miyotik döller, üzerinde sadece MAT A haplos'un büyüyeceği LRK ortamında çimlenir. İki ek seçim turu sayesinde, hem ACP'yi, hem de GFP'yi taşıyan haplo hücrelerini ve teneke kutu misininde nakavt edilmiş bir geni geri kazanıyoruz. Son olarak, tek tek suşları doğrudan plakadan seçebilir ve konfokal mikroskopi ile mitokondri morfolojisini gözlemleyebiliriz.
Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Yaşam Bilimleri Enstitüsü Hücre ve Gelişim Biyolojisi Bölümü'nden Hukuk Laboratuvarı'ndan Chap T. Merhaba, ben Jesse Chao, aynı zamanda Loan Lab'den. Bugün size, robotik bir sistem kullanarak mayada çeşitli mutant arka planlara GFP belirteçleri dahil etmek veya GFP belirteçleri için yüksek verimli bir yöntem göstereceğiz.
Bu prosedürü laboratuvarımızda D, endoplazmik retikulum ve mitokondri gibi organellerin morfolojisini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokol için iki farklı maya türü kullanıyoruz.
Bir CP bir GFP, plazmid PKT 1 28 kullanılarak bir PCR aracılı homolog rekombinasyon tarafından üretilen, ACP olanın bir C terminali GFP etiketlemesine sahip bir suştur. Gerinim arka planı BY 7 0 4 3'tür. Ayrıca, esansiyel olmayan genlerin yaklaşık 5.000 delesyon mutantından oluşan bir dizi olan DMA suşu veya delesyon mutant dizisini de kullanıyoruz.
Bu esansiyel olmayan genlerin tümü G dört 18'de nakavt edildi. Dizinin gerinim arka planı BY 47 41'dir. Başlamak için, bir tıslama plakasına beş mililitre gece boyunca ACP bir GFP kültürü dökerek ACP'nin bir GFP hücresi Alan'ını büyütün.
Plakanın bir alevle veya biyolojik bir davlumbazda yeterince kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra, plakayı gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, A CP bir GFP suşunu plaka başına 1.536 koloniye dizmek için bir robot kullanın.
Aynı zamanda, YPDG dört adet 18 plakaya replika sabitleyerek DMA'nın yeni bir kopyasını hazırlayın. Daha sonra, suşlar büyüdükten sonra plakaları gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Kolonileri YPD plakaları üzerine replika sabitleyerek ve üst üste bindirerek DMA ile A CP bir GFP suşu yaptı, plakaları gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyon replika plakasından sonra, SD altındaki koloniler, konuşlandırılmış hücreleri seçmek için G dört 18 plakayı tıslar, plakaları gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe eder. Sporülasyon ve çimlenmeye başlamak için ilk çoğaltma plakası, bir sonraki adımda sporülasyonun verimliliğini artırmak için diploidleri YPDG dört 18 plakasına yerleştirir. Bir günlük replika plaka için 30 santigrat derecede inkübe edildikten sonra, diploidler, miyotik sporların oluşumunu indüklemek için azaltılmış seviyelerde karbon ve nitrojen kaynakları içeren gelişmiş Sporülasyon ortamına yerleştirilir.
Daha sonra, plakaları en az beş gün boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kolonileri LRK ortamına kopyalayarak miyotik bir döl olan matı çimlendirin. Bu ortam, sporlardan tabloid hücrelerinin çimlenmesini indükleyecek, hem GFP alelini hem de tek mutant aleli taşıyan hücreleri seçmek için plakaları iki gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edecektir.
Matt A hücreleri, gen delesyonunu taşıyan haplo hücrelerini seçen lade G dört 18 ortamı altında replika kaplanır ve bu plakaları gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe eder. Bir sonraki replika plakası olan mat, tek mutantların büyümesi için seçmek üzere L-H-R-K-G dört 18 ortam üzerine miyotik bir döl. Bu aynı zamanda ACP'yi de barındırır: bir GFP, gece boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırılır.
Plakalar daha sonra üç aya kadar dört santigrat derecede saklanabilir. Bir CP bir GFP'yi doğrudan plakadan eksprese eden istenen mutantları görselleştirmek için, istenen kolonileri plakalardan seçerek başlayın. Hücreleri 30 santigrat derecede büyütün ve YPD veya SD tıslama ortamını erken kayıt aşamasına getirin.
Son olarak, bu konfokal görüntüde GFP filtre seti ile konfokal mikroskopi kullanılarak bir mutant görselleştirin, mitokondri morfolojisini incelemek için ACP bir GFP markörü ile bir mutant ve bir vahşi tip, konfokal mikroskopi ile görselleştirildi. Bu özel mutant, bozulmuş mitokondriyal fenotip sergiler ve bu nedenle daha fazla araştırma için iyi bir adaydır. Robotik bir sistem kullanarak bir multiklonal markörü, bir CP bir GFP'yi delesyon mutant dizisine nasıl verimli bir şekilde dahil edeceğinizi göstermiş olmalıyız.
Bu prosedürü yaparken, ortamı taze hale getirmek ve yerin kuruması için yeterli zamana sahip olmasını sağlamak önemlidir. Çok nemli yoğuşma varsa, yoğuşma birikecek ve kirlenme olasılığını artıracaktır. Ayrıca, bu protokol için kritik öneme sahip oldukları için tüm seçim ortamlarının doğru şekilde yapıldığını iki kez kontrol etmelisiniz.
Bu prosedür, diğer işaretleyici türleri için de kullanılabilir. Örneğin, er'i görselleştirmek için rutin olarak işaretleyici hava 11 ve GSP'yi kullanırız. İşte bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, mayada bulunan yaklaşık 5.000 esansiyel olmayan gene organel-GFP markerlerini dahil etmek için bir yöntem sunmaktadır ve bu, organel morfolojisini görselleştirme sürecini basitleştirmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar organel yapısını etkileyen mutasyonları verimli bir şekilde tarayabilirler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Genetik
Arka Plan
- GFP-füzyon proteinleri, hücresel yapıları görselleştirmek için gerekli araçlardır.
- Geleneksel mutasyon taraması yöntemleri emek gerektirir.
- Maya, genetik çalışmalar için bir model organizma olarak kullanılır.
- Konfokal mikroskopi, organellerin detaylı görüntülemesini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Organel markerlerini eşzamanlı olarak dahil etmek için bir yöntem geliştirmek.
- Organel morfolojisini etkileyen mutasyonların taranmasını kolaylaştırmak.
- Mayada genetik çalışmaların verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kültürlenmiş hücrelerden bir CP one GFP dizisi hazırlanması.
- GFP dizisinin DMA ile eşleştirilmesi ve diploidlerin seçilmesi.
- Diploidlerin belirli ortamlarda sporülasyonu.
- Konfokal mikroskopi kullanılarak mitokondriyal morfolojinin gözlemlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Organel-GFP markerlerinin maya genlerine başarılı bir şekilde dahil edilmesi.
- İstenilen genetik modifikasyonlara sahip haploid hücrelerin verimli bir şekilde elde edilmesi.
- Konfokal mikroskopi kullanılarak organel morfolojisinin görselleştirilmesi.
- Genetik mutasyonları taramakta kullanılan sürecin basitleştirilmesi.
Sonuçlar
- Yöntem, genetik taraması için gereken zamanı önemli ölçüde azaltmaktadır.
- Organel fonksiyonunu incelemek için sağlam bir çerçeve sunmaktadır.
- Bu yaklaşım, mayadaki çeşitli genetik çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This high-throughput yeast organelle morphology method enables systematic interrogation of gene function in organelle biogenesis, supporting target validation in early discovery. By integrating robotic array handling with dual-marker selection, it delivers scalable, reproducible phenotypic data for mechanistic de-risking of genetic hits. The approach accelerates pathway mapping and prioritization of targets affecting mitochondrial or ER function in preclinical programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables genome-wide assessment of gene deletions on mitochondrial morphology to validate targets involved in organelle inheritance.
- Operational Value: Uses robotic pinning to process 4,672 mutants efficiently, reducing manual labor and increasing throughput.
- Predictive Value: Identifies genetic modifiers of organelle structure to de-risk targets early in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable organelle morphology readouts via confocal microscopy for assay standardization.
- Operational Value: Produces homozygous deletion strains with integrated GFP markers, ensuring consistent reporter expression across the array.
- Assay Readiness: Delivers arrayed haploid mutants ready for compound screening or genetic interaction mapping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links yeast organelle phenotypes to conserved pathways relevant to human disease models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies gene function in organelle biogenesis to support target selection for preclinical validation.
- Pathway Elucidation: Maps genetic networks governing mitochondrial dynamics to inform mechanism-based compound screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification by providing organelle morphology data that informs target confidence and pathway relevance before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in organelle formation through systematic morphological profiling.
- Screening: Enables reproducible, array-based organelle imaging for high-content screening of genetic or chemical perturbations.
- Analytics: Delivers imaging-based phenotypic readouts that allow comparison of mutant conditions to wild-type controls.
- Translational Research: Connects yeast organelle defects to conserved cellular processes with potential relevance to preclinical disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for organelle-wide phenotypic screening across multiple GFP-tagged markers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by linking genotype to organelle phenotype at scale.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized robotic handling and dual-selection workflow.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel evaluation of thousands of genetic backgrounds.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted target prioritization based on organelle morphology phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, mating, sporulation, and fluorescent microscopy.
- Depends on robotic pinning systems and controlled incubation environments for array handling.
- Necessitates standardized media preparation and selection protocols to avoid contamination and ensure mutant recovery.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different organelle markers (e.g., ER vs. mitochondria).
- Limited to non-essential gene backgrounds; essential genes require alternative approaches such as conditional alleles or CRISPRi.
