Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Bu prosedür, zebra balığı embriyolarındaki gen ekspresyon modellerinin yüksek çözünürlükte belirlenmesine olanak tanır; antisense bir ribo prob, tamamlayıcı hedef mRNA ile hibridize edilir. Etiketli ribo prob, bir peroksidaz enzimine konjuge edilmiş bir antikor tarafından tanınır; embriyolara aramid konjuge fluoro four eklenir ve peroksidaz, IDE'yi yüksek derecede reaktif bir bileşiğe dönüştürür. Bu durum, fluoro four'un stabil bir şekilde çökelmesine yol açar; bağlanmamış IDE yıkanarak uzaklaştırılır ve böylece mRNA dağılımının ayrıntılı hücre altı paterni ortaya çıkarılır.

İkinci bir genin ekspresyonu, belirgin şekilde işaretlenmiş bir prob ve farklı bir floresan boya kullanılarak gözlemlenebilir ve bu sayede ekspresyonun detaylı karşılaştırması yapılabilir. Merhaba, ben Yale Üniversitesi Moleküler, Hücresel ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü'ndeki Scott Holly laboratuvarından Tim Brent. Bugün size, zebra balığı embriyolarının tüm mount yüksek çözünürlüklü çift floresan in situ hibridizasyonu için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü zebrafish segmentasyonunu incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. İşleme, soğukta paraformaldehit ile gece boyunca fikse edilmiş embriyolarla başlayın.

Bu fiksasyon için yeni çözdürülmüş paraformaldehit stok solüsyonunun kullanılması, başarılı boyama için kritik öneme sahiptir. Fiksasyon solüsyonunu uzaklaştırın ve embriyoları oda sıcaklığında, her seferinde beş dakika olacak şekilde iki kez PBS ile yıkayın. Ardından, embriyoların korionunu uzaklaştırın.

Embriyolar cam çukur plakalarına yerleştirilir. Bundan sonra, saatçi pensi kullanarak koriyonu sıyırın. Embriyoları transfer etmek için ateşle cilalanmış cam pastoral pipet kullanın.

Aksi takdirde, embriyolar standart polipropilen uçlara yapışacaktır. Deklorine edilmiş embriyolar, artan metanol konsantrasyonlarından oluşan bir dizi yıkama işlemiyle aktarılır. Son yıkama %100 metanol ile yapılır.

Son olarak, embriyolar taze metanol içerisine yerleştirilir ve gece boyunca -20 °C'de saklanır. Ertesi gün, embriyoları azalan metanol konsantrasyonlarından oluşan bir dizi yıkama işleminden ve iki adet beş dakikalık PBST tampon yıkamasından geçirin. Ardından, embriyoları paraformaldehit ile 20 dakika boyunca sabitleyin.

Kısa fiksasyonu, beşer dakikalık iki PBST yıkaması ile sonlandırın. Artık embriyoları permeabilize etmeye hazırız. Fikslenmiş embriyolar, protein ACE K ile inkübe edilerek geçirgen hale getirilir. Mikro santrifüj tüpünün yan yatırıldığından emin olun.

Sindirime işleminin süresi embriyonun yaşına bağlıdır. Örneğin, somatojenesis evresindeki embriyolar üç ila dört dakika boyunca inkübe edilir. PBST ile kısaca durulayın ve bir kez beş dakika boyunca PBST ile yıkayın.

Embriyoları paraformaldehit ile sabitleyin. Son olarak embriyoları PBST ile beşer dakika süreyle iki kez yıkayın. Embriyolar artık RNA probları ile hibridizasyon için hazırdır.

Embriyoları sabitleyip geçirgen hale getirdiğimize göre, 65 °C'de beş dakikalık bir high minus inkübasyonu ile hibridizasyon sürecini başlatıyoruz. Kullanmadan önce HIIN çözeltisini önceden ısıtmayı unutmayın. Ardından, embriyoları bir saat boyunca high plus içinde inkübe edin.

Tekrar, hyaluronidase plus çözeltisini önceden ısıtmayı unutmayın. Şimdi, embriyoların tamamen daldırıldığından emin olarak, hyaluronidase plus çözeltisinin çoğunu uzaklaştırın ancak 50 µL bırakın. Her bir probdan bir µL ekleyin ve tüpü nazikçe flickleyerek karıştırın.

Tüpleri şu andan itibaren alüminyum folyo ile kapatın. Floresein ışığa duyarlı olduğundan ve 65 °C'de gece boyunca inkübasyon yapıldığından, hibridizasyon tamamlanmıştır. Şimdi fazla probları uzaktıralım.

Boyamayı iyileştirmek için deterjan elimine edilir. Ancak, deterjan yokluğunda embriyoların yapışkan hale geldiğine dikkat edin. Her seferinde 30 dakika olacak şekilde, %50 formamid içeren 2 XSSC çözeltisi ile iki kez yıkayın.

Bir kez ve ardından 15 dakika boyunca iki kez XSSC çözeltisi ile yıkayın. Son olarak, her seferinde 30 dakika olacak şekilde iki kez 0.2X SSC ile yıkayın. Ardından, her bir probu görselleştireceğiz.

Şimdi hibridize olmuş probların tespitine başlayabiliriz. Flüoresein probu, dig oksijen probuna göre daha az kararlı ve daha zayıf olduğu için önce onu tespit edin. İlk olarak, oda sıcaklığında bir saat boyunca maleik asit tamponu içinde 500 µL %2'lik bloklama reaktifi ile bloklama yapın.

Ardından, bloklama çözeltisi içerisinde 1/500 dilüsyonda peroksidaz konjuge anti-floresein antikoru ekleyin. Dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Mikro santrifüj tüpünü yan yatırdığınızdan emin olun.

Ardından, tyrom sinyal amplifikasyon sistemini kullanarak deteksiyona başlayın; TSA TYROM IDE bir florofora konjuge edilmiştir. Antikor üzerindeki yaban turpu peroksidaz, TY IDE'yi yüksek derecede reaktif bir ara ürüne dönüştürür. Reaktif TY IDE, antikora yakın konumdaki kalıntılarla kovalent bir bağ oluşturarak floroforun lokalize birikimiyle sonuçlanır.

Oda sıcaklığında, bir x maleik asit tamponu ile dört kez 20 dakikalık yıkama ile başlayın ve ardından iki kez PBS ile yıkayın. Floresein TY IDE, saklama amacıyla önceden DMSO içinde çözülmüştür. Bu TSA substratını kısa süreliğine santrifüj ederek çöktürün.

Ardından, TSA substratını amplifikasyon dilüsyon tamponu ile 1/50 oranında seyreltin. Çözeltiyi embriyolara ekleyin ve 45 dakika boyunca inkübe edin. Mikro santrifüj tüpünü yan yatırın.

Bu inkübasyon adımı sırasında, embriyoları artan metanol konsantrasyonlarından oluşan bir dizi 10 dakikalık yıkama işleminden geçirin. Son yıkama, %100 Metanol ile 10 dakika boyunca yapılır; ardından antikor üzerindeki peroksidazı inaktive etmek için %1 hidrojen peroksit çözeltisi içinde 30 dakika inkübe edin. Aksi takdirde, bu durum dig oksijenin tespitini engelleyebilir.

Embriyolar, azalan metanol konsantrasyonuna sahip bir dizi yıkama ve iki adet 10 dakikalık PBS tamponu yıkaması aracılığıyla prob transferine tabi tutulur. Bu işlem, tüm metanolün uzaklaştırılmasını sağlar. Digoxigen ve probun antikor etiketlemesi, önceki antikorda olduğu gibi bloklama ile başlar.

Ardından, anti dig oksijen antikorunu 1:1000 dilüsyonda ekleyin. Mikro santrifüj tüpünü yan yatırın ve soğukta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün oda sıcaklığında maleik asit tamponu ile yıkayın.

Ardından, PBS ile quickpin kullanarak SCI five tyrom substratını yıkayın. Bunu 1:50 oranında seyreltin ve embriyolara ekleyin. Tüpü yan yatırarak 45 dakika boyunca inkübe edin.

Son olarak, üç kez PBST ile yıkayın. Prop iyodür ile yapılan son boyama adımı çekirdekleri işaretler. İşleme, iki XSSC içerisinde iki kez beşer dakikalık yıkama ile başlayın.

Ardından, 37 derecede 30 dakika boyunca RNA'lar ile işlem yapın. Oda sıcaklığında iki XSSC ile altı kez yıkayın ve şimdi propidyum iyodür çözeltisini ekleyip sekiz dakika boyunca boyayın. İki XSSC ile altı kez yıkayın.

Embriyoları 20 dakika boyunca paraformaldehit ile sabitleyin. Son olarak, PBST ile beşer dakikalık iki yıkama işlemi gerçekleştirin. Embriyoların görüntüleme için monte edilmesi, %25 ve %50 gliserolde onar dakikalık iki inkübasyon ile başlar.

Ardından, örnekleri %75 gliserole yerleştirin ve dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Bu gece boyu süren şeffaflaştırma adımı, embriyoların diseksiyonunu kolaylaştırır. Son olarak, embriyoların diseksiyonunu gerçekleştirerek yumurtayı uzaklaştırın.

Arka plan floresansını azaltmak için embriyoları bir mikroskop lamı üzerine düz bir şekilde monte edin ve mikroskop altında inceleyin. Bu görüntüler, 10 somit aşamasındaki bir zebra balığı embriyosunun posterior ucundan alınan tek bir konfokal kesiti göstermektedir. Kırmızı boyama, digoksin ile işaretlenmiş bir prob ve TSA siyano-florojen reaktifi ile tespit edilen delta C mRNA'sını göstermektedir.

Yeşil boyama, floresein işaretli bir prob ile tespit edilen her bir mRNA'yı temsil etmektedir. Ve TSA floresein reaktifi; propidyum iyodür ile boyanmış çekirdekler ise çift boyamalı bir embriyoda mavi renkte görünmektedir.

Belirgin veya örtüşen ekspresyon bölgeleri kesin bir şekilde belirlenebilir. Bu prosedür, HER-1 boyamasının bu yakın çekim görünümlerinde görüldüğü üzere, mRNA'nın hücre altı lokalizasyonunu ortaya çıkarır. Genin aktif transkripsiyonu, çekirdekteki boyama noktalarıyla gösterilir.

Diğer hücreler mRNA'nın sitoplazmik lokalizasyonunu sergiler. Çift boyanmış embriyoda, her iki geni veya genlerden herhangi birini transkribe eden hücreler görülebilir.

Ayrı olarak, zebra balığı embriyolarında tüm mount yüksek çözünürlüklü çift floresan in situ hibridizasyonun nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, floresan in situ hibridizasyonda iyi sonuç verecek, temiz ve güçlü sinyal veren probları belirlemek için öncelikle standart alkalin fosfataz aracılı boyama yöntemini kullanarak problarımızı test ettiğimizi hatırlamak önemlidir.

Propidyum iyodür boyaması yerine beta katenin immünolokalizasyonunu da başarıyla kullandık. Bu varyasyonu uyguladığımızda, hibridizasyon reaksiyonlarını 65 derece santigrat yerine 55 derece santigratda gerçekleştiriyoruz. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.