Name: Beyin Bankacılık: Araştırma Örneklerinin En iyi şekilde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Öğrenin beyin örneklerini kriyostat kesimi için hazırlama ve sistematik örnekleme yöntemlerini. Bu protokol nörobilim araştırmalarında önyargısız stereolojik analiz için biyolojik materyalin korunmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Ikiel Ptito onun devam eden teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.

Bölüm 1: Ön-işleme doku <ol><li> Doku paraformaldehid, glutaraldehid, ya da formalin ile perfüze edilmelidir. Bu, genellikle diğer organlarda hasat için kullanılan standart transcardial perfüzyon yoluyla elde edilebilir. Bu çalışmada bu konuda derin sodyum pentobarbital (25 mg / kg, iv), aşırı dozda ötenazi ketamin hidroklorür (10 mg / kg, im), sedasyon ve tamamen exsanguinated kadar 0.1 M PBS ile transcardially perfüze. Bu 5 dakika (~ 1 litre) PBS içinde% 4 paraformaldehid çözümü ile takip edilmektedir. </li><li> Beyin stereotaxically, bloke kafatası çıkarılır, tartılır ve hacmi 2 tespit edilmelidir. Daha sonra doku fosfat tampon% 30 sakaroz nihai bir konsantrasyon ile kademeli sakaroz çözümleri cryoprotected olmalıdır. Daha sonra doku blokları isopentane -65 ° C&#39;de dondurulmuş ve -80 saklanan ° C dilim için hazır olana kadar. </li></ol> Bölüm 2: Sistematik Örnekleme <ol><li> Sistematik örnekleme kesit için önce uygun bir plan dayanmaktadır. Rostral-kaudal ve dorsal-ventral kapsam hem de ilgi tüm bölgeyi iyi tanımlanmış olmalıdır. Kullanım türlerinin stereotaksik atlas, ilgi bölgeyi tanımlamak için ve ilgi bölgenin uzunluğunu belirlemek için yararlı olacaktır. Bir kez faiz bölgenin uzunluğu, örnekleme aralığı kurmak için gerekli belirlenir. Örneğin, stereotaksik atlas koronal planda kesit ilgi, bölgenin tüm postero-kaudal ölçüde uzunluğu yaklaşık 3mm olup olmadığını belirlemek. Daha sonra, 50μm bölümüne Kriyostat ayarlamak için bu oran az ilgi bölgenin rostral-kaudal ölçüde kapsayan 60 bölümden olacak karar verin. Tipik bir tarafsız stereolojik çalışma için sistematik olarak örneklenmiş 6-10 bölümleri güvenilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. Bu örnekte 10 bölüm, 1 / 6 bölümden bir örnekleme aralığı postero-kaudal ölçüde sonucu eşit yayılıyor. </li></ol> Bölüm 3: beyin bankası oluşturulması <ol><li> Bölümde örnekleme frekansı tespit edildikten sonra, bir sonraki adıma lekeleri hemen yapılacaktır hangi belirlemektir. Örneğin, cresyl menekşe ile boyanarak eğer bir slayt 1 / 6 bölümler yakalayacaktır. Bu seri, 1 olacak. Size istediğiniz belki birkaç potansiyel antikorları var biliyorsanız çalışır, ama ya birincil leke sağlar ya da sadece immünohistokimya gerçekleştirmek için zaman yok, sipariş bölümden kalan 5 serisi yerde verileri görmek istiyorum. kuyuları antijen korumayı içeren (% 1 polivinil pirolidon, o.1M PBS içinde% 50 etilen glikol, Ph 7.4) içine dilimlenmiş. Aşağıdaki tablo, 1 slayt ve 1 tabak (standart 48-iyi plaka) bir beyin bankası (Tablo 1) bir parçası olarak bölümden oluşan bir örnekleme planı sağlar. <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="Tablo 1" /> Tablo 1: Burada bölümde örnekleme frekansı 1 / 6 &#39;dır. İlk bölüm cresyl menekşe boyama için bir slayt yerleştirilir ve önümüzdeki 5 bölümden korumak antijeni yerleştirilir. Bölüm 7 numaralı slaytta yakalanır ve bölümleri 9-12 korumak antijen konur. Bu döngü, faiz veya doku blok bölgedeki ince ayrıntısına kadar kesitli kadar tekrarlanır. </li><li> Bir sonraki adım ince ayrıntısına kadar bölüm doku blok. Mandren, orta gömme küçük bir miktar yerleştirin ve donmasına izin. Mandreni mikrotom baş koyun ve düz bir yüzeye sahip dondurulmuş orta yeterince traş. Kriyostat içinde mikrotom baş ve düz bir yerde mandreni çıkarın. Mandren, orta gömme dökün ve sıkıca mandreni üzerine yatay olarak yerleştirilmiş stereotaxically kesilmiş tarafı ile beyin blok yerleştirin. Yavaş ve tamamen montaj orta beyin gömün. Mikrotom baş ve bölüm bölüm örnekleme frekansı için önceden belirlenmiş parametreler kullanılarak beynin mandreni yerleştirin. </li><li> Doku blok ince ayrıntısına kadar kesitli ve bölümleri kuyular içine yerleştirildikten sonra, kapak ile plaka kapağı ile kapağı sarmak parafilm, ve -20 ° C derin dondurucuya yerleştirin. Toplam sayısı, her bir dizi bölümü örnekleme aralığı, her bir hayvan için dizi sayısı için alınan bölümden giriş yapın. Bu günlük, gelecekte immünohistokimya beyin banka bölümlerin sonradan giderilmesi takip etmek için önemli olacaktır. </li></ol> Bölüm 4: Temsilcilik Sonuçları: Sistematik örnekleme bu şekilde son 3 yıldır laboratuvarda standart bir uygulama olmuştur. Sinyal bozulması olmadan (Şekil 1) dilimlenmiş sonra malzeme üzerinde üç yıl muhafaza antijen kayıtlı olan başarılı performans immünohistokimya büyük bir anlaşma yaptık. Ayrıca, beynimizin banka bir parçası olarak biz yaklaşık 20.000 insan olmayan sistematik bölümleri oturum açmışprimat beyin, bizim uzun vadeli araştırma planlarının parçası olarak (Şekil 2). <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> 1. Bu insan dışı primat oksipital kutuplu bir bölümü Şekil katmanı VI ve interstisyel beyaz cevher nöronlar hem gösteren Neun immunohistokimyasal. Bu özel bölümde, 2 yıllık bir süre için -20 ° C&#39;de muhafaza antijen depolandı. Ölçek çubuğu = 100μm. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 vervet beyin bankası, 30 yılı aşkın maymunlardan yaklaşık 20.000 sistematik bölümden oluşur.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Sistematik örnekleme, araştırma malzemesi en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmış ucuz bir yöntem. Bu örnekleme stratejisinin bölge genelinde sistematik örnekleme gerektirir tarafsız stereology kurallarına uyacak şekilde tasarlanmıştır. Bu, her dizi için bölümlerin sırasını muhafaza olduğunu kritik öneme sahiptir. Laboratuarımızda başarıyla hamster ve insan dışı primat beyin bölümlerde her iki banka için bu yöntemi kullanmıştır. Şimdiye kadar, yaklaşık 20.000 vervet maymun (Chlorocebus aethiops sabeus) beynin b...

<table><tbody><tr><td>Etilen glikol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>Polivinil pirolidon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Scientific Gömme Ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

beyin bankacılık: araştırma Örneklerinin en iyi şekilde

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Hakkında tarafsız stereology, doğru ve etkili bir şekilde belirli bir ilgi alanında toplam nöron sayısı (ya da diğer hücre tipi) tahmin etmek için bir yöntemdir<sup&gt; 1</sup&gt;. Bu hedefe ulaşmak için tüm yapıyı kapsayan 6-10 sistematik bölümden probed olmalıdır. Tipik olarak bu, önemli bir miktarda işlenmemiş malzeme yaprağı 1 / 5 bölüm işleme içerir. Malzeme maksimize etmek için, uzun vadeli bir depolama araştırma planının parçası olarak sabit doku korumak için ucuz bir yöntem öneriyoruz. Doku istenen leke veya antikor, alternatif bölümler için dilimlenmiş ve işlenmiş olarak sistematik ileride işlenmek üzere -20 ° C&#39;de muhafaza antijen konulmalıdır. 24-kuyucuğu kullanma, bölümler gelecek alımı için yerleştirilebilir. Bu yöntemi kullanarak, doku saklanır ve yıl boyunca immünohistokimya için işlenmiş olabilir.

Beyin bankacılık ve biyolojik materyalin sistematik örnekleme tarafsız stereology temelini sağlar ve olası veri her numune elde edilen en üst düzeye çıkarır.

Beyin Bankacılık: Araştırma Örneklerinin En iyi şekilde

Tarafsız stereoloji, belirli bir ilgi alanındaki toplam nöron sayısını (veya diğer hücre tiplerini) doğru ve verimli bir şekilde tahmin etmek için kullanılan bir yöntemdir1. ...

Bu prosedüre başlamak için, beyin bloğu kriyostat için hazırlanmalı ve kesit örnekleme sıklığı belirlenmelidir. Ardından, antijen koruyucu ve lamlar hazırlanmalıdır. Beyin bloğu, kriyostat içindeki mandrene yerleştirilmelidir.Beyin, önceden belirlenmiş bir kalınlıkta mandren kesitine güvenli bir şekilde gömüldükten sonra, birinci seri bir lama, sonraki seriler ise antijen koruyucu ile önceden doldurulmuş kuyucuklara yerleştirilecek şekilde sistematik kesitler alınmalıdır. Blok tükendiğinde, plakayı beyin bankanızın bir parçası olarak -20 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin. Merhaba, ben Montreal Üniversitesi Optometri Okulu'ndaki Görsel Nörobilimler Laboratuvarı'ndan Dr. Mark Burke.Merhaba, ben de Montreal Üniversitesi Optometri Okulu'ndaki Görsel Nörobilimler Laboratuvarı'ndan Dr. Shahin Zur. Merhaba, ben Montreal Üniversitesi Optometri Okulu Görsel Nörobilim Laboratuvarı direktörü Dr. Mo Petto. Bugün size, beyin dokularının antijen koruyucuda sistematik olarak bankalanması işlemine yönelik bir prosedürü göstereceğiz.Araştırma materyalini maksimize etmek ve tarafsız bir değerlendirme gerçekleştirmek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokol, fikse edilmiş, stereotaktik olarak bir santimetre kalınlığında dilimler halinde bloklanmış ve dondurulmuş beyin dokusunun nasıl sistematik olarak örnekleneceğini açıklamaktadır.Bu önceki adımları ayrıntılı olarak görmek için, insan dışı primat beyninin stereotaksik uzayda diseksiyonunu inceleyen güncel JoVE makalemize başvurun. Sistematik örneklemedeki ilk adım; örnekleme şemanızı oluşturmak, dokunuzu nasıl keseceğinize, bu kesitleri serilere veya örneklere nasıl ayıracağınıza ve bu örnekleri nasıl düzenleyip takip edeceğinize karar vermektir. İlk olarak, gerektiğinde stereotaksik bir atlasa danışın.İlgilendiğiniz bölgeyi rostral, caudal ve dorsal ventral boyutlarda net bir şekilde tanımlayın ve kesit düzleminizi seçin. Ardından, kesitlerinizin kalınlığının ne kadar olacağına karar verin ve ilgili bölgeden kaç adet kesit alabileceğinizi hesaplayın. Örneğin, Stereotaksik atlasa göre, bölgenizin toplam rostral-caudal uzunluğunun yaklaşık üç milimetre olduğunu belirlersiniz.Ardından, kriyostatı 50 mikrometre kalınlığında kesit alacak şekilde ayarlamaya karar verirsiniz ve bu hızla, tüm bölgeyi kapsayan 60 koronal kesitiniz olacaktır. Bu noktada, örnekleme aralığınızı belirleyebilirsiniz. Tipik, yanlı olmayan bir stereolojik çalışma için, güvenilir sonuçlar elde etmek amacıyla sistematik olarak örneklenmiş altı ila 10 kesite ihtiyacınız vardır.Bu örnekte, Ros kodla genişliği boyunca eşit aralıklarla alınan 10 kesit, altı kesitte birden birine denk gelen bir örnekleme aralığı oluşturur. Bu kesit örnekleme sıklığını belirledikten sonra, hangi boyamaları yapmak istediğinize karar vermelisiniz. Boyamak istediğiniz kesitleri, dokuyu keser kesmez hemen doğrudan lamlar üzerine yerleştireceksiniz.Örneğin, Kristal Viyole ile boyama yapıyorsanız, bir lam üzerindeki altı kesitten birini alacaksınız. Bu, birinci seri olacaktır. Kalan kesitleri, gelecekteki immünohistokimya çalışmaları için antijen koruyucu içeren plaklarda saklayacaksınız.Burada gösterilen örnekleme şeması, bu doku bloğu için toplam altı seri olacak şekilde, bir beyin bankasının parçası olarak iki lam ve bir standart 24 kuyucuklu kesit plakasına dayanmaktadır. Bir sonraki adım, kriyostat mikrotomunu kullanarak doku bloğunu kapsamlı bir şekilde kesmektir. Öncelikle, dondurulmuş doku örneğinizi, mikrotom kafasına oturan ve örneğiniz için tabla görevi gören "chuck" adlı parçaya monte etmeniz gerekir.Başlangıç için, kaba küçük bir miktar gömme ortamı yerleştirin ve donmasını bekleyin. Kabı mikrotom kafasına yerleştirin ve numuneniz için düz bir yüzey oluşturacak kadar donmuş ortamı tıraşlayarak uzaklaştırın. Kabı mikrotom kafasından çıkarın ve kriyostatın içine düz bir şekilde yerleştirin.Gömme ortamını mandrenin üzerine dökün ve sabitleyin. Beyin bloğunu, kesik yüzeyi aşağı gelecek şekilde yavaşça ve tamamen mandrenin üzerine yerleştirin. Beyin parçasını gömme ortamı içerisine yerleştirin.Beynin monte edildiği mandreni, önceden belirlenmiş kesit örnekleme sıklığını kullanarak mikrotom kafa bölümüne yerleştirin. Bir lam üzerine monte edilmiş bir kesit yaptıktan sonra veya antijen koruyucu içeren plaktaki belirli bir seriye ekledikten sonra, kesitlerin sırasını korumaya çok dikkat edin. Kesitleri, daha sonra beyin bankasına geri dönüp başka bir sistematik örnek alabileceğiniz şekilde dilimleyin.Dokuyu tamamen dilimleyip kesitleri kuyucuklara yerleştirdikten sonra, plakayı kapağıyla kapatın, kapağı parafilmle sarın ve -20 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin. Her serideki toplam kesit sayısını, kesit örnekleme aralığını ve hayvan başına düşen seri sayısını kaydedin. Bu kayıt, gelecekteki deneyler için beyin bankasından kesitleri çıkarırken onları takip edebilmeniz için hayati önem taşıyacaktır.Sistematik olarak bu şekilde örnekleme yapmak laboratuvarımızda standart bir uygulama haline gelmiştir. Son üç yıldır, antijen koruyucuda üç yıl boyunca saklanan materyaller üzerinde, sinyal kaybı olmadan immunohistokimya işlemleri gerçekleştirerek büyük başarılar elde ettik. Ayrıca, beyin bankamızın bir parçası olarak, insan dışı primat beynine ait yaklaşık 20.000 sistematik kesiti kayıt altına aldık.Uzun vadeli araştırma planlarımızın bir parçası olarak, biyolojik bir örneğin nasıl sistematik olarak örnekleneceğini ve uzun vadeli araştırma planlarınızın bir parçası olarak nasıl korunacağını size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, alınan toplam seri sayısının ve seri başına düşen toplam kesit sayısının ayrıntılı bir kaydını tutmayı hatırlamak önemlidir. Ayrıca, sistematik bir örnekleme prosedürünü sürdürmek için, bir kesit kaybolursa veya hasar görürse, o kesit numarasını kayıt defterine not edin.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

brain-banking-making-the-most-of-your-research-specimens

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz TSSB hastalarının karakteristik nöroendokrin fonksiyonlarda kalıcı değişikliklere ve gecikmiş uzun vadeli, abartılı bir korku tepkisi, ortaya travma sonrası stres bozukluğu (TSSB) bir sıçan modelinde tarif. Hayvan modeli ve burada tarif edilen yöntemler, fakat mekanistik çevresel beyaz kan hücrelerindeki biyolojik olan hastalarda ölçülemez beyin çekirdeklerinde biyo, kutu arasında ilişki için yararlıdır.

TSSB, Nöral Hematolojik ve Davranış Bağlantılı Revealing için Hayvan Modelinde Biyobelirteçler

Video, sabit bir ölüm sonrası insan beynini simetrik olarak incelemek ve daha fazla analiz için daha küçük doku blokları hazırlamak için adım adım bir prosedürü göstermektedir.

İnsan Postmortem Beyninin Simetrik Bihemisferik Kesiti

İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar.

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Organize beyin kesme prosedürleri kesin nöropatolojik tanıları ile belirli nöropsikiyatrik olayları ilişkilendirmek için gereklidir. Beyin kesimler çeşitli klinik-akademik beklenmedik göre farklı yapılır. Bu protokol, insan beyni patolojilerinde hemisferik farklılıkların araştırılması ve mevcut ve gelecekteki biomoleküler / beyin teknikleri en üst düzeye çıkarmak için bir simetrik bihemispheric beyin kesme prosedürü anlatılmaktadır.

İnsanlardaki Sağlıklı ve Patolojik Beyin Koşulları Eğitim için Kesme Simetrik Bihemispheric Postmortem Beyin

Burada, donma ve beyin dokusu birden çok hayvanlardan tek beyin işleme için zaman kazandıran bir alternatif olarak bölüm için bir protokol mevcut. Bu immünhistokimya sırasında boyama değişkenliği azaltır ve zaman cryosectioning ve görüntüleme azaltır.

Birden çok kemirgen beyin aynı anda Cryosectioning

Bu protokol, beyin bağışı programı ve beyinlerin doğru karakterizasyonu yoluyla bireysel beyin yaşlanma yörüngelerini izlemek için bir yöntem açıklar. Beyin bağışçıları seri çok boyutlu değerlendirmeler de dahil olmak üzere uzun vadeli bir uzunlamasına çalışmada yer almaktadır. Protokol beyin işleme ve doğru bir tanı metodolojisi ayrıntılı bir açıklamasını içerir.

Abbiategrasso Beyin Bankası Toplama, İşleme ve Yaşlanma Beyinleri Karakterize için Protokol

Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar.

Downstream Analizleri için Dondurulmuş Kemirgen Beyin Bölgeleri Koleksiyonu

Biyobankalar biyomedikal araştırmalar için çok önemli kaynaklardır ve Avrupa Onkoloji Enstitüsü'ndeki Translasyonel ve Dijital Tıp Birimi için Biyobanka bu alanda bir modeldir. Burada, biyobankaların farklı insan biyolojik numunelerinin yönetimi için standart çalışma prosedürlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz.

Translasyonel Tıp için Biyobanka: Optimal Numune Yönetimi için Standart Çalışma Prosedürleri

Canlı sıçanların beyinlerinden nöral kök hücrelerin ve oligodendrosit progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir yöntem burada deneysel olarak ayrıntılı olarak sunulmaktadır. Refahlarından ödün vermeden bu hücrelerin aynı hayvanlardan birden fazla toplanmasına izin verir.

Canlı Sıçanlardan Nöral Kök Hücrelerin ve Oligodendrosit Progenitör Hücrelerin İzolasyonuna Yönelik "Beyin Sağım" Yöntemi

Bu protokol, radikal prostatektomi örneklerinden örneklerin toplanmasını kolaylaştırmak için bir yöntemi tanımlar. Amaç, örneklerden alınan doku örneklerini bir Biyobankada saklamadan önce anatomopatolojik kriterlere dayalı olarak haritalamak, karakterize etmek ve mikro-makro diseksiyon yapmaktır.

Geliştirilmiş Örnekleme Tekniği ve Histolojik Karakterizasyon ile Prostat Tümörü Biyobankacılık Güvenilirliğinin Artırılması

Modern sinirbilimler, laboratuvar kemirgenleri ve insanlar dahil olmak üzere birçok tür arasındaki farkları keşfetmelidir. Ancak büyük beyinli memeliler söz konusu olduğunda teknik zorluklar ortaya çıkar. Bu yaklaşım, çok farklı memelilerde nöronal popülasyonların türler arası varyasyonlarını ele alır ve evrimsel kalıpların ortaya çıkarılması için haritalanacak benzer sonuçlar sunar.

Farklı Memeli Beyinlerinde Nicel Hücre Sayımı Çalışmaları İçin Karşılaştırmalı Yaklaşım

Öğrenin beyin örneklerini kriyostat kesimi için hazırlama ve sistematik örnekleme yöntemlerini. Bu protokol nörobilim araştırmalarında önyargısız stereolojik analiz için biyolojik materyalin korunmasını sağlar.

Beyin Bankacılık: Araştırma Örneklerinin En iyi şekilde

Daha fazla video keşfet