Name: Protein Ubikitinasyon Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Öğrenin, hücre kültürlerinde ve in vitro ortamda protein ubikitinasyonunu tespit etme yöntemlerini. Bu protokoller, ubiquitin ligazları ve hastalık mekanizmaları üzerine araştırmalar için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rejeneratif Tıp hibe RS1-00331-1 için California Institute ve RL1-00.682-1 (Z Zhang); Amerikan Parkinson Bu çalışma NIH hibe RO1 DC006497, RO1 NS057289 ve PO1 ES016738 (Z. Zhang) tarafından desteklenmiştir. Hastalığı Derneği (Z. Zhang ve YS Choo) ve Michael J. Fox Parkinson Araştırma Vakfı (Z. Zhang).

Kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon Tespiti <ol><li> Protein ve ilgi (epitopu etiketli sürümü) ubikuitin ifade plazmid Transfect kültür hücreleri. </li><li> Tam hücre lizis tamponu (% 2 SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) 2mm sodyum orthovanadate, 50 mM sodyum florür, ve proteaz inhibitörleri ile. </li><li> Plaka başına 100 ul hücre lizis tamponu (6 cm çanak) olan hücreler Lyse. Daha büyük bir çanak kullanılırsa, buna göre ses seviyesini ayarlayın. Swirl çanak lizis tamponu dikkatle yetiştirilen hücreler, tüm alanı kapsayacak. </li><li> Bir hücre kazıyıcı ile hücreleri toplamak ve hücre lizatları 1,5 ml Eppendorf tüp içine aktarmak. Tüp 10 dakika kaynatın hemen sıcak bir tabağa yerleştirin. </li><li> Kesme sonication cihaz ile hücreleri. </li><li> 900ul seyreltme tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA,% 1 Triton) ekleyin. Rotasyon ile 30-60 dakika boyunca, 4 ° C&#39;de örnek inkübe edin. </li><li> 30 dakika 20.000 xg&#39;de seyreltilmiş örnekleri Spin. Meydana gelen supernatant, yeni bir Eppendorf tüpüne aktarın. Pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun. </li><li> Protein konsantrasyonu ölçün. </li><li> Protein A-veya G-agaroz boncuk-konjuge antikor (% 50 bulamaç) uyumlu bir tampon hedef proteinine karşı hazırlayın. P-200 pipet ucu dar ucu ve reçine 14-20 ul immunoprecipitation için hazırlanan hücre lizatları 500-1,500 mg aktarmak. Transfeksiyon verimliliği yüksek olan hücreler için, 500 mg yeterli olacaktır. Transfeksiyon verimliliği düşük olan hücreler için daha fazla proteine ​​ihtiyaç olabilir. </li><li> 4 ° C gecede rotasyon ile hücre lizat-boncuk karışımı inkübe edin. </li><li> 5 dakika için 5000 xg&#39;de boncuk aşağı spin. Süpernatant aspire. Reçine yıkama tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA,% 1 NP-40) iki kez yıkayın. </li><li> Son bir kez 30 saniye süreyle 20.000 xg&#39;de boncuk Spin. Artık yıkama tampon aspire ve 2X SDS yükleme tamponu ile reçine kaynatın. </li><li> SDS-PAGE jel üzerine örnekler, analiz immunoblotting için yükleyin. </li><li> Ubikuitin ve hedef protein antikorlar algılar. Immunoblotting için, genellikle ilk ubikuitin algılar. Membran protein çöktürülmüş algılamak için kullanılan olacak. </li></ol> In vitro ubikuitinasyon tahlil yoluyla hedef protein ubikuitinasyon Tespiti <ol><li> 5X ubikuitinasyon tampon (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25 mM MgCl2, 2.5 mM DTT, 10 mM ATP) olun. 6 ay, -20 ° C&#39;de küçük alikotları saklayın. Bazı protokoller de, ATP rejenerasyon 1,2 tampona kreatin fosfat ve kreatin kinaz ekleyin . </li><li> Her reaksiyon için, aşağıdaki maddeleri içeren bir karışım hazırlayın: <table border="1"><tbody><tr><td> Ul 8 </td><td> 5X ubikuitinasyon tamponu </td></tr><tr><td> 250 ng </td><td> ubikuitinasyon E1 </td></tr><tr><td> 500 ng </td><td> ubikuitinasyon E2 </td></tr><tr><td> 0.5 mg </td><td> ubikuitin </td></tr><tr><td> 0.5 mg </td><td> ilgi protein </td></tr><tr><td></td><td> 40 ul toplam hacim su </td></tr></tbody></table> Kontrol grubu olarak benzer reaksiyonlar, E1, E2, ya da ubikuitin yokluğunda hazırlar. </li><li> 1 saat veya daha uzun süre için 37 ° C karışımı inkübe edin. </li><li> SDS-PAGE örnek tampon ekleyerek reaksiyon durdurun ve örnek 10 dakika kaynatın. </li><li> SDS-PAGE jel üzerine örnekler, analiz immunoblotting için yükleyin. </li><li> Ubikuitin ve hedef protein antikorlar algılar. </li></ol>

<ol><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2C+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li>
<li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li>
<li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF5%2C+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li>
<li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu sunumda, öncelikle, kültürlü memeli hücrelerinde ilgi bir protein ubikuitin bir değişiklik olup olmadığını saptamak izin adımları nitelendirdi. Non-kovalent etkileşen proteinler üzerinde ilgi protein, özellikle ubikuitinasyon tespit etmek için, hücre parçalama, immunoprecipitation ve 1,3 yıkama için sıkı bir durum kullanılır. Bu nedenle, anti-ubikuitin immün böyle sert bir durumda hedef protein immunoprecipitation tarafından tespit Ubikitinasyon, hedef proteine ​​özgü olması muhtemeldir. Deneysel işlemleri...

protein ubikitinasyon tespiti

Detection of Protein Ubiquitination

Ubikitinasyon proteinleri hedef polipeptid ubikuitin, kovalent bağlanma, üç enzimlerin kümesi tarafından yürütülen bir anahtar posttranslasyonel modifikasyonu. Ubikuitin-aktive edici enzim E1, ubikuitin-conjugating enzim E2 ve ubikuitin ligaz E3 içerir. E1 ve E2, E3 ubikuitin ligaz ekran substrat özgüllüğü aksine. Öte yandan, çok sayıda deubiquitylating enzimler polyubiquitinated proteinler işleme rolleri vardır. Ubikitinasyon protein istikrar, hücresel yerleşimi ve biyolojik aktivite değişikliği neden olabilir. Ubikuitinasyon / deubiquitination yolu veya değişmiş ubikuitin sistem işlev alan genlerin mutasyonlar, kanser, nörodejenerasyon ve metabolik bozukluklar gibi çeşitli türleri olarak çok farklı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Hedef proteinlerin değişmiş veya normal ubikuitinasyon tespiti, bu hastalıkların patogenezi daha iyi anlaşılmasını sağlamak. Burada, kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon tespit protokolleri tarif<em&gt; In vivo</em&gt; Ve test tüpleri<em&gt; In vitro</em&gt;. Bu protokoller sumolyation ve neddylation gibi diğer ubikuitin gibi küçük molekül değişikliği algılamak için de yararlıdır.

Ubikitinasyon üç enzimlerin kümesi tarafından yürütülen bir anahtar posttranslasyonel modifikasyonu. Bu değişiklik ilgili genler Mutasyonlar birçok farklı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Burada, kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon tespit protokolleri tarif<em&gt; In vivo</em&gt; Ve test tüpleri<em&gt; In vitro</em&gt;.

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Polipeptit ubiquitinin hedef proteinlere kovalent olarak bağlanması olan ubiquitinizasyon, bir dizi ... tarafından gerçekleştirilen temel bir translasyon sonrası modifikasyondur.

Merhaba, ben Birmingham Tıbbi Araştırmalar Enstitüsü'ndeki Jo laboratuvarından Chu. Bugün sizlere protein nükleasyonu nasıl tespit edilir konusundaki bir prosedürü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda parkin veya UBI üç ligazlarını ve bunların substratlarını incelemek için kullanıyoruz.Haydi başlayalım. Bu protokole başlamak için, hücreleri hem hedef proteini hem de epitop etiketli bir ubiquitin versiyonunu eksprese eden plazmidlerle transfekte edin. Hücrelerin yaklaşık 40 saat boyunca büyümesine izin verin, ardından hücreleri liz etmek için laboratuvar tezgahına geçin, sıvı besiyerini aspire edin ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.Altı santimetrelik plaka başına %2 SDS içeren 100 µL hücre lizis tamponu ekleyerek hücreleri lizleyin. Tamponun hücreleri tamamen kaplaması için her plakayı dairesel hareketlerle sallayın. Ardından, liz hale gelmiş hücreleri toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve hücreleri 1,5 mL'lik bir ependorf tüpüne aktarın.Tüpü hemen bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve proteinleri daha fazla denatüre etmek ve çözmek için liz edilen hücreleri 10 dakika boyunca kaynatın. Kaynatma işleminden sonra, hücreleri ve DNA'larını parçalamak için bir sonikasyon cihazı kullanın. Bu adım, hücre lizatlarının viskozitesini azaltır.Sonikasyondan sonra, 900 µL seyreltme tamponu ekleyin ve örnekleri 4 °C'de 30 ila 60 dakika boyunca rotasyonda bırakın. İnkübasyonun ardından, çözünür proteinleri elde etmek için seyreltilmiş örnekleri 4 °C'de 20,000 G'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, pelete zarar vermemeye dikkat ederek süpernatantı yeni bir ependorf tüpüne aktarın.Son olarak, süpernatanttaki protein konsantrasyonunu, burada kullandığımız modifiye Lowry analizi gibi bir yöntemle ölçün. Artık, hedef proteininizi süpernatanttaki diğer proteinlerden ayırmak için immünopresipitasyon kullanmaya hazırsınız. İmmünopresipitasyondaki ilk adım, hedef proteininize karşı antikorlarla konjuge edilmiş boncukları hazırlamaktır.Ticari olarak mevcut antikor konjuge boncukları kullanabilir veya çapraz bağlayıcılar kullanarak kendi immobilize antikorunuzu hazırlayabilirsiniz. Burada yaptığımız gibi, amino çöktürme reaksiyonunu kurmak için %50'lik bir süspansiyon hazırlamak amacıyla immobilize antikoru uyumlu bir tampon çözelti içinde hazırlayın. Bir P 200 pipet ucunun dar ucunu kesin ve 14 ila 20 µL reçineyi, 500 ila 1500 µg hazırlanmış hücre lizatına aktarın.Kullandığınız hücre lizatı miktarını, hücrelerinizin transfeksiyona karşı duyarlılığına göre ayarlayın. Hücre lizatı boncuk karışımını dört derece Celsius'ta gece boyunca döndürmeye bırakın. Bu süre zarfında, boncuk konjuge antikor hedef proteininize spesifik olarak bağlanacaktır.Ertesi gün, proteininizi çöktürmek için boncukları 4 °C'de, 5.000 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Proteinler artık boncuklara bağlanmış olduğundan, süpernatantı aspire edin ve boncukları 5.000 G'de beş dakika santrifüjleyerek yüksek tuzlu yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. 4 °C'de, boncukları son kez 20.000 G'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin ve kalıntı yıkama tamponunu aspire edin.İlgi duyduğunuz proteini saflaştırdığınıza göre, proteini bir SDS-PAGE jeline yükleme zamanı gelmiştir. Öncelikle, proteinleri denatüre etmek ve onlara negatif yük kazandırmak için boncuk reçinesini iki kat SDS yükleme tamponu ile kaynatın. Hazırladığınız örnekleri bir SDS-PAGE jeline yükleyin.Laboratuvarınızın western blotting protokolünü kullanarak proteinleri bir membrana transfer edin. Ardından, blotu ubiquitin veya hedef proteine karşı antikorlarla inkübe edin ve ubiquitinelemiş proteinleri görselleştirmek için membranı film üzerinde geliştirin. Kültür hücrelerinde protein ubiquitination işleminin nasıl tespit edileceğini göstermiş olduk.Aynı deney, bir test tüpü içerisinde in vitro olarak da gerçekleştirilebilir. Bu reaksiyonun toplam hacmi 40 µL'dir ve bir PCR tüpünde yapılabilir. Her bir reaksiyonu şu şekilde hazırlayın.İlk olarak, TP ve indirgeyici ajan DIO three etol, DTT içeren beş kat UBIQUITINATION tamponu ekleyin. Ardından, E one ve E two ubikitinasyon enzimlerini ekleyin. Substratları, ubikitin ve hedef proteini ekleyin.Kontroller için toplam reaksiyon hacmini su ile 40 µL'ye tamamlayın. Ubikuitin E1, E2 veya hedef proteinin yokluğunda benzer reaksiyonlar hazırlayın. Karışımı 37 °C'de bir saat veya daha uzun süre inkübe edin.SDS-PAGE örnek tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun. Örneği 10 dakika boyunca kaynatın. Örnekleri bir SDS-PAGE jeline yükleyin ve in vivo deney için yaptığınız gibi immünoblotlama analizine geçin.İşte bu protokolün örnek bir sonucu. Parkinson. Burada ilgilenilen protein, Parkinson hastalığı ile ilişkili bir proteindir. Dördüncü şerit ise ubikitine edilmiş parini göstermektedir.Modifiyesiz parin molekül ağırlığının üzerinde görülen tipik güçlü yayılmalar veya basamaklar, çeşitli deneysel koşulları karşılaştırmak için gösterilmiştir; ayrıca her bir koşulda modifiyesiz hedef proteinin, parinin ve ubiquitinin hücresel ekspresyon seviyeleri de dikkate alınmalıdır. Bu, in vitro parin ubiquitination örneğidir; afinite ile saflaştırılmış parin, rekombinant E1, E2 ve biotin etiketli ubiquitin varlığında in vitro ubiquitination için analiz edilmiştir. Biotinilize ubiquitine sahip parin, streptavidin HRP ile tespit edilmiştir. Ubiquitine bağlanmış Parin, modifiyesiz parinin molekül ağırlığının üzerinde basamaklar şeklinde görünür; birinci, ikinci ve dördüncü şeritler sırasıyla ubiquitin, E1 ve E2 içermeyen kontrollerdir.Kültür hücrelerinde yeni aşı proteininin nasıl tespit edileceğini gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, hücre lizatını yüksek derecede deterjanlı bir koşulda hazırlamanın ve mobilize edilmiş antikorları eklemeden önce hücre lizatını seyreltmenin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneyinizde başarılar dileriz.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, karmaşık bir peptit karışımından kalan di-glisin peptitleri içeren ubikitinile peptitlerin ekstrakte edilmesi ve saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Sunulan yöntem, proteindeki orijinal ubikitinasyon bölgelerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Ubikitinillenmiş Peptitlerin İmmünoaffinite Temelli Ekstraksiyonu: Ubikitin Etiketli Peptitleri Saflaştırılmış Peptit Fraksiyonlarından Seçici Olarak Ekstrakte Etmek İçin Bir Teknik

Geçerli protokol işlevsel homolog deubiquitinating enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem göstermektedir. Uzman problar kovalent enzim değiştirme ve saptama için izin verir. Bu yöntem, yeni tedavi hedefleri tespit etmek potansiyele sahiptir.

Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Ubiquitination hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve sıkıca deubiquitination tarafından koordine edilen bir post-translational modifikasyon olduğunu. Her iki reaksiyon kusurları insan patolojileri altında yatan. Biz arıtılmış bileşenleri kullanarak in vitro mayası ve deubiquitination reaksiyonu yürütmek için protokoller sunuyoruz.

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Bu yöntem, ubiquitin zincir topolojislerindeki küresel değişikliklerin değerlendirilmesini açıklar. Değerlendirme, kütle spektrometresi tabanlı hedefli proteomik yaklaşımın uygulanmasıyla gerçekleştirilir.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Memeli hücrelerinde belirli bir substratın ubikitilasyon testi ve bir E3 ubikitin-ligazının ubikitilasyon testi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. HEK293T hücre hatları protein aşırı ekspresyonu için kullanıldı, poliubikitillenmiş substrat immünopresipitasyon ile hücre lizatlarından arındırıldı ve SDS-PAGE'de çözüldü. Bu post-translasyonel modifikasyonu görselleştirmek için immünoblotlama kullanıldı.

Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi

Protokol, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı proteini kullanarak memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir yöntemi açıklar. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında hücrelerden saflaştırıldı.

Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Burada kullanılan deney, geleneksel Çin tıbbının küçük molekülleri ile protein hedefleri arasındaki etkileşimi tahmin etmek ve doğrulamak için prob teknolojileriyle birleştirilmiş bir moleküler yerleştirme yöntemini göstermektedir.

Moleküler Yerleştirme ve Deubikitinasyon Enzim Probu Teknolojisine Dayalı UCHL3 Aktivitesini İnhibe Etmek için Geleneksel Çin Tıbbı Bileşiklerinin Taranması

Ubiquitinasyon, hücre içi protein fonksiyonlarının kritik bir düzenleyicisidir. Burada, memeli hücrelerinde substrat protein ubiquitinasyon seviyelerini tespit etmek için iki hücre lizisi yöntemini tanımlıyor ve ubiquitinasyon seviyelerini analiz etme etkinliklerini karşılaştırıyoruz. HEK293T hücrede protein aşırı ekspresyonu, geçici transfeksiyonla indüklenmiş ve ubiquitinated proteinler western blot analiziyle tespit edilmiştir.

SMAD2/SMURF2 modeli kullanılarak memeli hücre lizatlarında ubiquitinasyon tespiti için karşılaştırmalı stratejiler

Öğrenin, hücre kültürlerinde ve in vitro ortamda protein ubikitinasyonunu tespit etme yöntemlerini. Bu protokoller, ubiquitin ligazları ve hastalık mekanizmaları üzerine araştırmalar için kritik öneme sahiptir.

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Daha fazla video keşfet