Nöron ve Glia Geliştirme Çalışmaları Rat Beyin Agrega Kültürler hazırlanması

CNS nöroprogenitörlerinin gelişerek olgun nöronlara ve glialara farklılaştığı bir kültürleme sistemini tanıtıyoruz. Prosedür, E 16 sıçan fetüslerinden dört beynin izole edilmesi ve bunların papain ile sindirilmesiyle başlar. Dokular tek hücre süspansiyonuna getirilir, filtrelenir, sayılır ve altılı bir plakete dağıtılır.

Agregat oluşumuna izin vermek için kuyucuk plakasındaki hücreler, iki ila üç gün boyunca günde bir kez nazikçe resüspande edilir. Ardından agregatlar toplanır, 200 µm'lik bir elekten geçirilir ve küçük kümeler ile hücre döküntüleri yıkama yoluyla uzaklaştırılır. Son olarak, agregatlar sayılır ve matrigel kaplı lameller üzerine ekilir.

Merhaba, ben Texas A and M Üniversitesi Veteriner Entegre Biyobilimler Bölümü'ndeki Dr. John L laboratuvarından Coto. Bugün size beyin agregat kültürleri için bir prosedür göstereceğiz. Endosit soyunu, hücre gelişimini ve hücresel etkileşimleri incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz.

Haydi başlayalım. Başlamadan önce, sterilize edilmiş aletleri, %70 etanolü, üzerinde çalışmak için bir emici pedi ve buz üzerinde diseksiyon ortamı içeren 10 santimetrelik petri kaplarını tezgahta hazır bulundurun.

Çeker ocakta, buz platformuna sahip bir diseksiyon mikroskobu ve yine buz üzerinde bulunan diseksiyon ortamı içeren birkaç adet 10 santimetrelik kap hazırlayın. Son olarak, kullanacağınız solüsyonları hazırlayın ve ekim ortamını bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın. Bu protokole, bir Sprague Dawley sıçanından embriyonik 16. gün E 16 embriyolarını toplayarak başlayın.

Öncelikle, kurumunuzun hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylanmış bir prosedüre uygun olarak gebe bir dişiyi ötenaziyle uyutun. Ötanazi uygulanmış sıçanı bir bebek bezi pedine yerleştirin ve temizlemek için karnına alkol püskürtün. Ardından, abdominal deriyi cımbızla sıkıştırın ve diğer elinizle makas kullanarak sadece deriyi kesin; deriyi iki yana ayırın ve kas tabakasını kesmek için başka bir steril cımbız ve makas seti kullanın.

Ardından, uterusu çıkarın ve buz gibi soğuk diseksiyon ortamı içeren 10 santimetrelik bir kaba aktarın. Bir sonraki aşama, mikrodiseksiyon makasları kullanılarak çeker ocak içinde gerçekleştirilir. Her bir embriyoyu uterustan dikkatlice çıkarın.

Şimdi toplama ve başlangıç vaktidir. Embriyonik beyinlerle çalışın. Her embriyodan beyni çıkarın ve serbest kalan beyinleri, buz platformu üzerindeki 10 santimetrelik temiz bir diseksiyon ortamı kabına yerleştirin. Beyinlerin diseksiyonunu diseksiyon mikroskobu altında tamamlayın.

Orta beyin ve arka beyin bölümlerini çıkarın. Meninksleri çıkarmak için ince uçlu pens kullanın ve ön beyinden geri kalan kısmı diseksiyon medyumu içeren 50 mililitrelik bir falcon tüpüne aktarın. Artık doku bir sonraki adım için hazırdır.

Hücrelerin enzimatik sindirim yoluyla ayrıştırılması. Sindirime başlamadan hemen önce, taze propana ve tripsin inhibitörü filtre çözeltileri hazırlayın. Bunları sterilize edin ve bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.

Diseke edilen beyinlerden fazla medyumu uzaklaştırın. Ardından, 50 mililitrelik tüpünüze hazırlanan protein sindirim çözeltisinden dört mililitre ekleyin. Tüpü, tam beş dakika boyunca 37 °C sıcaklığındaki bir su banyosunda inkübe edin.

Süre dolduğunda, propan çözeltisini uzaklaştırmak için bir pipet kullanın. Ardından, beş mililitre taze hazırlanmış tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin ve tüpü iki ila üç dakika daha 37 °C su banyosuna geri yerleştirin. Süre dolduğunda, tripsin inhibitörü çözeltisini uzaklaştırın.

Tripsin inhibitör çözeltisi ile inkübasyonu üç kez daha tekrarlayın. Tripsin inhibitör çözeltisini son kez uzaklaştırdıktan sonra, tüpünüze 20 mililitre ısıtılmış ekim ortamı pm ekleyin.

Şimdi hücreleri pipetle karıştırma ve yıkama zamanıdır. Tüm kümeler kaybolana kadar hücreleri 10 mililitrelik bir pipetle yaklaşık 20 ila 30 kez pipetleyerek karıştırın. Ardından yedi dakika boyunca 100 g'de santrifüjleyin.

Bu aşamada, hücreleriniz birbirinden iyice ayrılmış olmalıdır. Yedi dakika sonra, süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri yıkamak için peleti 10 mL ekim besiyerinde yeniden süspande edin.

Ardından bunları tekrar santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve yıkama ile santrifüj işlemini tekrarlayın. İkinci yıkamadan sonraki adım.

Peleti 10 mililitre agregat kültür ortamında yeniden süspande edin, ardından hücreleri 70 mikrometrelik bir hücre eleğinden geçirin. Son olarak, bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.

Artık disosiye edilmiş beyin hücrelerinin agregatlar oluşturmasına izin vermeye hazırsınız. Sayım işleminden sonra, disosiye hücreleri mililitre başına 2 × 10⁶ hücre yoğunluğunda agregat kültür ortamında süspande edin. Hücre süspansiyonundan iki mililitreyi, kaplanmamış altı kuyucuklu bir kültür plağının her bir kuyucuğuna aktarın.

Hücreleri üç gece boyunca her gün nazikçe yeniden süspande edin. P 1000 pipet kullanıldığında, hücreler agregat ekim gününde agregatlar oluşturmaya başlayacaktır. Hücreler üç gece boyunca büyüdükten sonra, hücreleri tekrar nazikçe yeniden süspande edin ve süspansiyonu 200 µm'lik bir süzgeç aracılığıyla 50 mL'lik bir falcon tüpüne aktarın.

Agregatların tüpün dibine çökmesi için yaklaşık üç ila beş dakika bekleyin. Ardından süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın, besiyeri ekleyin, agregatları nazikçe yeniden süspande edin ve tekrar çökmelerini sağlayın. Bu prosedürü birkaç kez tekrarlayın.

Ölü hücreleri, tekil hücreleri ve debrisleri uzaklaştırmak için, süpernatantların hâlâ agregatlaşmamış hücreler ve debrisler içerip içermediğini mikroskop altında kontrol edin. Agregatları iyice yıkadıktan sonra, onları nazikçe aynı ortamda yeniden süspande edin ve konsantrasyonlarını belirlemek için agregatları sayın. Ardından, agregat yoğunluğunu 50 µL başına yaklaşık 25 ila 30 agregat olacak şekilde ayarlayın.

Şimdi örtü lamları agregatlar ile ekime hazırlama zamanıdır. Agregat süspansiyonundan 1000 µL'lik alikotları iki mililitrelik eend Dwarf tüplerine aktarın; agregatlar tüplerin dibine çökmeye eğilimli olduğundan, ekim için agregat süspansiyonundan birden fazla tüp hazırlamak kritik önem taşır. Bu adımda kullanılan örtü lamlar, 37 °C'de gece boyu inkübasyon ile bir hücre kültürü substratı olan matrigel ile kaplanmıştır.

Agregat süspansiyonun alikotlarını hazırladıktan sonra, matrigel kaplı lamelleri içeren kültür plakasını inkübatörden çıkarın. Her bir kuyucuktaki solüsyonu uzaklaştırın. Lamelleri önce ılık PBS ile ardından DD H2O ile yıkayın.

Şimdi, lamel üzerine agregatlar ekmek için agregat ekimi aşamasına geçilebilir. Agregatları karıştırmak ve eşit şekilde dağıtmak için agregat süspansiyon tüpünü ters çevirin. Ardından, her bir lamelin merkezine 50 µL agregat süspansiyonu yükleyin.

Agregatların lam üzerine eşit şekilde tutunmasını sağlamak için, plakayı daha fazla sarsmadan nazikçe inkübatöre geri yerleştirin. Agregat yoğunluğu kritiktir; eğer agregatlar birbirine çok yakın yerleştirilirse veya yerleşim yoğunluğu yüksek olursa, ilk yerleşimden dört ila altı saat sonra büyürken birbirleriyle birleşme eğilimi gösterirler. Her kuyucuğa 500 µL kültür ortamı ekleyin.

Agregat kültürünü sürdürmek için, her üç ila dört günde bir ortamın yarısını değiştirin. Ortamı değiştirirken, agregatların bozulmasını önlemek için besiyerini kuyucuğun yan duvarı boyunca ekleyin. Agregatlar lamelle yapıştıktan birkaç saat sonra, agregatlardan dışa doğru büyüme gözlemlenebilir.

Aksonlar ilk iki haftada hızla büyür ve agregatlar arasında bol miktarda bağlantı kurarlar. Ggl progenitörleri agregatlardan radyal olarak göç eder ve zamanla astrositlere ve olgun oligodendrositlere farklılaşırlar. CS agregatının nasıl kültüre edileceğini size göstermiş olduk.

Bu prosedür gerçekleştirilirken, kapasitenin uygun şekilde belirtilmesi ve agregatın homojen olarak incelenmesi önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneyinizde başarılar dileriz.