Name: Nöron ve Glia Geliştirme Çalışmaları Rat Beyin Agrega Kültürler hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-30T23:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Öğrenin, fare embriyonik beyin agregaları hazırlayarak nöron ve glia hücrelerinin gelişimini incelemeyi. Bu yöntem, çok potansiyelli öncü hücrelerin farklılaşmasını gözlemlemek için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada, Texas A &amp; M Üniversitesi&#39;nde start-up fonları tarafından finanse edildi

Diseksiyonu önce hazırlanması Cerrahi aletleri: otoklav ile tüm diseksiyon makas ve forseps sterilize Lamel temizleme: <ol><li> En az 24 saat süreyle% 33 HCl 1L çim beher tüm lamelleri (çapı 24-plaka 15mm) Soak </li><li> Kalan tüm HCl kaldırmak için arada bir sallayarak 10 dakika akan su ile yıkayın </li><li> Millipore su ile durulayın. </li><li> Suyu boşaltın </li><li> % 95-98 etanol içinde lamelleri Soak </li><li> Düz bir plaka ve hava temiz bir doku Transfer lamelleri kuru lamelleri </li><li> Alüminyum folyo ile kaplayın ve otoklav, lamelleri bir cam behere aktarın Not: lameller bu aşamada saklanabilir </li><li> Kültür plakaları tek tek lamel yerleştirin. Kaplama için hazır </li></ol> Lamel kaplama: <ol><li> PBS ve filtre sterilize (0.22 mikron) ile 100 x poli-D-lisin (PDL, -20 ° C&#39;de hacimde olarak saklanır PBS içinde% 0.5 sığır serum albumin, 10 mg / ml) stok sulandırınız </li><li> 1 x 37 2 saat PDL çözüm (~ 0.15 ml / cm 2) ° C bir kuluçka makinesi ile Coat lamelleri </li><li> PDL çözüm çıkarın ve tamamen steril GKD 2 O ve kuru lamelleri ile 3 kere yıkayın </li></ol> Not: lamelleri / plakaları her diseksiyon için yeterli Coat. PDL kaplı lamelleri 4 birkaç hafta saklanabilir ° C Medya ve çözümler Diseksiyon orta (DM): 10 mM HEPES (Invitrogan 15630) ile desteklenebilir (HBSS, Invitrogen 14175) steril buz Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (w / o Ca 2 +, Mg 2 +) kullanın. Toplam kültür ortamı,% 2 B27, 1 x Sato, 0.5 mM sodyum piruvat, 0.75mm GlutaMAX, 60μg/ml N-asetil sistein, 5 mg / ml: DMEM/NBB27 orta DMEM / Neurobasal (vol 01:01 hacim) içerir insülin, 10nm d-Biotin ve% 1 penisilin / streptomisin. 100 ml toplam kültür ortamı yapmak için, 50 ml DMEM (w / o piruvat / glutamin, Invitrogen 11960), 50 ml Neurobasal orta (Invitrogan 211.034), 375 ul GlutaMax (100 x 35.050 Invitrogen), 5.5 mg sodyum piruvat karışımı (Sigma P2256), 2 ml B27 (Invitrogan 17504), 6.3 mg N-asetilsistein (Sigma A8199), Sato hisse senedinin 1 ml d-Biotin stok (4000 x hisse senedi, 40, 25 ul (100 x stok, aşağıya bakınız) PBS içinde mcM alikotları -20 ° C. Sigma B4639), insülin 100 ul (1000 x stok, -20 alikotları gibi saklanan 0.01N HCl 5 mg / ml ° C, Sigma 16.634) ve 1 ml penisilin olarak depolanır. / streptomisin (100 x stok, Invitrogen 15140), filtre sterilize ve 4 saklamak ° C Sato 100 x stok solüsyonu: 40 ml stok yapmak için: karışımı 40 ml, 400, 400 mg BSA (Sigma A9647), mg apo-transferrin (Sigma T2252) 10 ul (25 mg / ml etanol, progesteron gibi saklanan Neurobasal alikotları -20 ° C. Sigma P8783), 64 mg putrescine (Sigma P7505) ve sodyum selenit (30 mcM PBS alikotları olarak depolanan -20 ° C, Sigma S5261) 40 ul. -20 ° C&#39;de hacimde Sato stok solüsyonu ve mağaza sterilize filtreleme Nöron kaplama orta (PM): Neurobasal Orta,% 2 B27, 2mm Glutamin (100x stok, -20 ° C, Invitrogen 25030 saklanır alikotları), 25μM glutamik asit (100 hisse senedi, -20 ° C&#39;de saklanır alikotları) ve% 1 penisilin / streptomisin. Nöron kültür ortamı (CM): Neurobasal Orta,% 2 B27, 2mm Glutamin (100x stok, -20 ° C&#39;de saklanır alikotları) ve% 1 penisilin / streptomisin. 5-FDU stok: Neurobasal orta 1mm 100x stok, 5-floro-2&#39;-dezoksiuridin (Sigma F0503) and1mM üridin (Sigma U3003). Filtre -20 ° C&#39;de sterilize ve alikot olarak depolanır Papain sindirim çözüm (diseksiyon önce taze olun): <ol><li> 4ml DM 3.2 mg L-Sistein (Sigma C-7352) çözülür </li><li> 37 1N NaOH (pH test şeritleri testi) ve su banyosu yer yaklaşık 7.4 pH ayarlama ° C Not: (aşağıya bakın) doku sindirim hemen önce bir sonraki adım gerçekleştirin. </li><li> 20 ünite / ml nihai konsantrasyonu papain </li><li> (0.22mm) sterilize Filtresi ve su banyosunda 37 ° ° C </li></ol> Tripsin inhibitörü çözüm (diseksiyon önce taze olun): <ol><li> 20ml DM 0.2 g tripsin inhibitörü (Sigma T7295) çözülür </li><li> PH kontrol edin ve 1 N NaOH ile ~ 7.4 pH ayarı </li><li> Sterilize Filtresi ve su banyosunda 37 ° ° C </li></ol> Beyin Diseksiyon Kurulum: <ul><li> Steril forseps ve makas </li><li> % 70 etanol </li><li> Temizlik kağıt mendil ve diapbankta er pedi </li><li> Bankta rahim ve fetus için buz DM 10cm Petri kapları </li><li> Diseksiyon mikroskobu Buz platformu </li><li> DM ile buz üzerinde 2-3 6cm yemekleri </li><li> 37 ° C su banyosunda sıcak PM </li></ul><ol><li> Hamile bir Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış bir prosedüre göre Sprague-Dawley sıçan (E16) ve İletişim Komitesi (IACUC) Euthanize </li><li> Karın bölgesi bebek bezi ped ve Spay alkol sıçan Lay </li><li> V şeklinde kesi sadece cilt kesim yapmak için karın cilt ve bir makas tutmak için cımbız kullanın </li><li> Yayıldı dışında cilt ve kas tabakası ile kesmek için başka bir steril cımbız ve makas kullanın </li><li> Embriyo keseler zincir Özü ve 10cm çanak içine buz DM içeren bir transfer </li><li> Mikrodiseksiyon makas kullanarak dikkatli bir şekilde her bir embriyo kesesi ve beyinden gelen her embriyo kaldırmak ve bir buz platformu DM temiz bir 10cm çanak içine beyinleri serbest </li><li> Laminer kaput ve bir diseksiyon mikroskobu altında, orta beyin / arka beyin bölümleri kaldırmak ve meninksler kaldırmak için ince forseps kullanımı, ve bir buz paketi DM yeni bir 6cm çanak temizlenmiş korteks / hipokampus transfer Not: Bu aşamada, doku, enzim sindirim için hazırdır . </li><li> Make papain ve tripsin inhibitörü çözüm ve sterilize </li><li> Korteks gelen DM aşırı / hippocampi çıkarın </li><li> Hazırlanan papain sindirim çözüm 4ml ekleyin </li><li> Tam olarak 5 dakika 50ml tüp tüm içerik aktarma ve bir su banyosunda 37 Falcon tüp yeri ° C </li><li> Papain çözüm pipet yardımıyla çıkarın </li><li> 2-3 dk 5ml tripsin inhibitörü çözüm, girdap tüp ve su banyosunda 37 ° ° C </li><li> Tripsin inhibitörü çözümü çıkarın </li><li> Adım 13 ve 14 üç kez tekrarlayın </li><li> 20ml sıcak PM Ekle </li><li> Tüm kümeleri ortadan kalkana kadar (~ 20-30 kez) Karışım </li><li> 7dk için 100xg santrifüjleyin </li><li> 10ml PM pelletini tekrar santrifüj tarafından iki kez yıkayın </li><li> Düzenli nöron kültürlere veya toplu kültürler için NBB27/DMEM 10ml PM pelletini tekrar </li><li> 70μm bir hücre eleklerden hücrelerin Pass </li><li> Canlı hücre sayımı </li><li> Hücreleri normal nöron kültürler için aşağıda açıklanan veya levha olarak toplam kültürler geçin Not: Bu aşamada, yüksek oranda zenginleştirilmiş nöron kültürler deney amacına bağlı olarak yoğunluğu 200-640 hücre / mm 2, PDL kaplama plakalar üzerine ayrışmış hücreleri kaplama ile elde edilebilir. Hücreleri (~ 2-4h) bağlı sonra, sıcak PM orta yerine. 4 gün uzun süre, kültür varsa, sıcak CM ile orta yarısı değiştirin. 5-FDU (son konsantrasyon 10 mcM) nöronal kültürlerin, mitoz inhibitörü yüksek derecede saflaştırılmış için (DIV2 3 sırasında yani), non-nöronal hücre proliferasyonunu inhibe etmek DIV2 eklendi olabilir. 2 gün boyunca CM kurtarma sonra hücreler darbe tam bir orta değişikliğinin ardından başka bir 2 gün (DIV 6-7) 5-FDU ile yeniden tedavi edilir. Bundan sonra, taze, sıcak CM, her 3-4 günde bir orta yarısı değiştirin. 4 hafta kadar Nöronlar geçerli değildir. </li></ol> Agregalar hazırlık ve kaplama <ol><li> 2x10 6 hücre / ml yoğunlukta 1x Sato, 10 ng CNTF ve 10μM forskolin NBB27/DMEM orta ayrışmış hücreleri içeren Askıya Alma </li><li> Kaplanmamış 6-plaka her kuyuya hücre süspansiyonu 2ml transfer </li><li> 3 gece Kültür. Her gün, hafifçe bir kez P1000 Pipetman kullanarak hücrelerin tekrar süspansiyon Not: Hücreler, agrega (Şekil 1) oluşturmaya başlar . </li><li> Toplam kaplama bir gün önce, mont plaka / Matrigel ile lamelleri: <ul><li> Stok Matrigel buz soğuk DMEM ile 01:20 (düşük büyüme faktörü, BD Biosciences 354.230) sulandırınız Not: Matrigel alikotları üretici protokol başına hazırlıklı olmalıdır. Tüm ipuçları, Eppendorf tüpleri ve stok hacimde yapmak için çözümler Matrigel polimerizasyonu önlemek için soğuk olmalıdır. Matrigel alikotları -80 ° C 4 ° C&#39;de muhafaza ve çözdürülen </li><li> 37 ° C inkübatör geceleme seyreltilmiş Matrigel çözüm 300μl/well Coat önceden PDL kaplı lamelleri </li><li> Sıcak PBS ile yıkayın, daha sonra ılık steril GKD 2 O tabak yıkama ve inkübatör plakaları bırakın. </li></ul></li><li> 3 gün toplam oluşumundan sonra hafifçe 50 ml Falcon tüp içine 200μm örgü ile süspansiyon tekrar hücreleri tekrar süspansiyon ve elek. Agrega ağırlık (~ 3-5sn) tarafından tüp altına yerleşmek için izin verin </li><li> Dikkatle süpernatant kaldırmak </li><li> Orta ekle, yavaşça agrega tekrar süspansiyon haline getirin ve onları tekrar yerleşmek. Ölü hücreleri tek tek hücreler ve enkaz kaldırmak için bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. Süpernatantı hala olmayan toplu hücreler ve debri içeren olup olmadığını kontrol etmek için mikroskop kullanın.s </li><li> Yavaşça aynı NBB27/DMEM orta agrega (Şekil 1) tekrar süspansiyon ve agrega saymak </li><li> 25-30 etrafında aggreggats/50ul agrega yoğunluğunu ayarlayın </li><li> Toplam süspansiyon kaplama için 2ml Eppendorf tüplerine transferi alikotları (500-1000μl) Not: agrega tüplerin dibine çökmemesi için bu yana, toplam süspansiyon çoklu tüpler kaplama yapmak çok önemlidir. Sık sık benzer her lamel kaplama agrega sayısı sağlamak için, kaplanmış lamelleri veya kültür plakalar üzerine onları ekim önce hafifçe agrega tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Inkübatör Matrigel kaplı lamelleri içeren kültür plakasına çıkartın. Her kuyudan çözüm çıkarın lamelleri sıcak PBS ve GKD 2 O ile yıkayın ve ardından da kuru kısaca . Toplam tohumlama için artık hazır. </li><li> Bir tüp, onlara tohumlama önce eşit bir şekilde dağıtılacaktır izin agrega süspansiyon içeren tersine çevirin. Her lamel merkezi haline toplam süspansiyon 50μl yerleştirin ve hafifçe agrega lamel eşit takmak için izin başka bir rahatsızlık olmaksızın inkübatör plaka koymak Not: agrega yoğunluğu çok önemlidir. Eğer agrega numaralı seribaşı birbirine çok yakın ya da ekim yoğunluğu yüksek ise, onlar büyüdükçe birlikte birleştirme eğilimi gösterirler. </li><li> Her iyi 4-6 saat sonra ya da erken ertesi sabah ek DMEM/NBB27medium (500 ul) </li><li> Toplam kültürü korumak için her 3-4 günde bir, yarım orta değiştirmek. Orta değiştirdiğinizde, agrega bozmaya dikkatli olmalı ve bu kuyunun yan duvar boyunca orta ekleyerek hafifçe yapılır. Not: Birkaç saat plakasına bağlı agrega sonra, agrega neurite akıbet görülebilir. Aksonlar ilk iki hafta içinde hızla büyümeye ve agrega (Şekil 2) arasında bol bağlantıları oluşturur. Glial atalarıdır agregaların radyal göç ve astrositler ve olgun oligodendrosit içine zamanla ayırt. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 yıkandıktan sonra farklı gün ve agrega agrega oluşturan hücreler Faz kontrastlı görüntüler. <img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> 2 ve 12 gün Matrigel kaplı lamelleri numaralı seribaşı sonra toplu bir kültür Şekil 2. Faz kontrastlı görüntüler.

<ol><li>Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain+aggregating+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain aggregating cell cultures.</a> Neuroscience. 3, 565-56 (1978).</li>
<li>Chen, Y. ing <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protocols. 2, 1044-10 (2007).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60, 555-55 (2008).</li>
<li>Svenningsen, A. F., Shan, W. ei-S. ong, Colman, D. avidR., Pedraza, L. iliana <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+culturing+embryonic+neuron-glial+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid method for culturing embryonic neuron-glial cell cocultures.</a> Journal of Neuroscience Research. 72, 565-56 (2003).</li>
</ol>

Erken çalışmalar sinaps oluşumu ve dönme-aracılı serbest dalgalı agrega kültürler 1 olgun miyelin bildirdi. Burada açıklanan MSS agrega kültür sistemi, hücre gelişimi, göç ve in vitro farklılaşma analizi kolaylaştırmak için geleneksel 2B kültürlerin rahatlığı ile üç boyutlu agrega multipotent progenitör hücrelerin serum serbest büyüme birleştirir sistemi, sinir habercisi değiştirilebilir ve kullanılabilir hücre araştırma ve soruşturma nöron glia etkileşimleri. Örneğin, oligodendrosit atalarıdır gibi ...

nöron ve glia geliştirme Çalışmaları rat beyin agrega kültürler hazırlanması

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Bir in vitro sistemde, merkezi sinir sistemi olgun nöronlar ve glia (MSS) içine atalarıdır özetlediği geliştirme ve farklılaşma AXO glial etkileşimleri, özellikleri ve multipotent atalarıdır farklılaşma ve oligodendroglial ilerlemesini araştırmak Nörobilimadamları için güçlü bir platform sağlayacak hücresel ve moleküler düzeyde soy hücreleri. Biz burada, serum serbest bir ortamda 3-4 hafta kadar devam edebilir ve nöron glia etkileşim ve MSS miyelinasyonun incelemek için bir model olarak laboratuvarda kullanılan embriyonik sıçan forebrains MSS agrega kültür sistemi açıklanmaktadır. Bu video klibi, E16 sıçan beyin bu MSS agrega kültürleri izole ve büyümek nasıl göstereceğiz. Ayrıca, aynı beyin diseksiyonu, zenginleştirilmiş düzenli ayrışmış nöronal kültürlerin kolayca elde edilebilir ve çeşitli çalışmalar için kullanılan merkezi sinir sistemi nöron veya diğer hücreleri ile birlikte kültürler için kullanılır.

Embriyonik fare beyin agrega kültür sistemi için protokolleri açıklanmıştır. Agrega multipotent atalarıdır geliştirmek ve nöronlar, astrositler ve oligodendrosit içine ayırt edebilirsiniz.

Nöron ve Glia Geliştirme Çalışmaları Rat Beyin Agrega Kültürler hazırlanması

Merkezi sinir sisteminde (MSS) progenitörlerin olgun nöronlara ve glialara gelişimi ve farklılaşmasını yeniden canlandıran in vitro bir sistem...

CNS nöroprogenitörlerinin gelişerek olgun nöronlara ve glialara farklılaştığı bir kültürleme sistemini tanıtıyoruz. Prosedür, E 16 sıçan fetüslerinden dört beynin izole edilmesi ve bunların papain ile sindirilmesiyle başlar. Dokular tek hücre süspansiyonuna getirilir, filtrelenir, sayılır ve altılı bir plakete dağıtılır.Agregat oluşumuna izin vermek için kuyucuk plakasındaki hücreler, iki ila üç gün boyunca günde bir kez nazikçe resüspande edilir. Ardından agregatlar toplanır, 200 µm'lik bir elekten geçirilir ve küçük kümeler ile hücre döküntüleri yıkama yoluyla uzaklaştırılır. Son olarak, agregatlar sayılır ve matrigel kaplı lameller üzerine ekilir.Merhaba, ben Texas A and M Üniversitesi Veteriner Entegre Biyobilimler Bölümü'ndeki Dr. John L laboratuvarından Coto. Bugün size beyin agregat kültürleri için bir prosedür göstereceğiz. Endosit soyunu, hücre gelişimini ve hücresel etkileşimleri incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz.Haydi başlayalım. Başlamadan önce, sterilize edilmiş aletleri, %70 etanolü, üzerinde çalışmak için bir emici pedi ve buz üzerinde diseksiyon ortamı içeren 10 santimetrelik petri kaplarını tezgahta hazır bulundurun.Çeker ocakta, buz platformuna sahip bir diseksiyon mikroskobu ve yine buz üzerinde bulunan diseksiyon ortamı içeren birkaç adet 10 santimetrelik kap hazırlayın. Son olarak, kullanacağınız solüsyonları hazırlayın ve ekim ortamını bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın. Bu protokole, bir Sprague Dawley sıçanından embriyonik 16. gün E 16 embriyolarını toplayarak başlayın.Öncelikle, kurumunuzun hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylanmış bir prosedüre uygun olarak gebe bir dişiyi ötenaziyle uyutun. Ötanazi uygulanmış sıçanı bir bebek bezi pedine yerleştirin ve temizlemek için karnına alkol püskürtün. Ardından, abdominal deriyi cımbızla sıkıştırın ve diğer elinizle makas kullanarak sadece deriyi kesin; deriyi iki yana ayırın ve kas tabakasını kesmek için başka bir steril cımbız ve makas seti kullanın.Ardından, uterusu çıkarın ve buz gibi soğuk diseksiyon ortamı içeren 10 santimetrelik bir kaba aktarın. Bir sonraki aşama, mikrodiseksiyon makasları kullanılarak çeker ocak içinde gerçekleştirilir. Her bir embriyoyu uterustan dikkatlice çıkarın.Şimdi toplama ve başlangıç vaktidir. Embriyonik beyinlerle çalışın. Her embriyodan beyni çıkarın ve serbest kalan beyinleri, buz platformu üzerindeki 10 santimetrelik temiz bir diseksiyon ortamı kabına yerleştirin. Beyinlerin diseksiyonunu diseksiyon mikroskobu altında tamamlayın.Orta beyin ve arka beyin bölümlerini çıkarın. Meninksleri çıkarmak için ince uçlu pens kullanın ve ön beyinden geri kalan kısmı diseksiyon medyumu içeren 50 mililitrelik bir falcon tüpüne aktarın. Artık doku bir sonraki adım için hazırdır.Hücrelerin enzimatik sindirim yoluyla ayrıştırılması. Sindirime başlamadan hemen önce, taze propana ve tripsin inhibitörü filtre çözeltileri hazırlayın. Bunları sterilize edin ve bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.Diseke edilen beyinlerden fazla medyumu uzaklaştırın. Ardından, 50 mililitrelik tüpünüze hazırlanan protein sindirim çözeltisinden dört mililitre ekleyin. Tüpü, tam beş dakika boyunca 37 °C sıcaklığındaki bir su banyosunda inkübe edin.Süre dolduğunda, propan çözeltisini uzaklaştırmak için bir pipet kullanın. Ardından, beş mililitre taze hazırlanmış tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin ve tüpü iki ila üç dakika daha 37 °C su banyosuna geri yerleştirin. Süre dolduğunda, tripsin inhibitörü çözeltisini uzaklaştırın.Tripsin inhibitör çözeltisi ile inkübasyonu üç kez daha tekrarlayın. Tripsin inhibitör çözeltisini son kez uzaklaştırdıktan sonra, tüpünüze 20 mililitre ısıtılmış ekim ortamı pm ekleyin.Şimdi hücreleri pipetle karıştırma ve yıkama zamanıdır. Tüm kümeler kaybolana kadar hücreleri 10 mililitrelik bir pipetle yaklaşık 20 ila 30 kez pipetleyerek karıştırın. Ardından yedi dakika boyunca 100 g'de santrifüjleyin.Bu aşamada, hücreleriniz birbirinden iyice ayrılmış olmalıdır. Yedi dakika sonra, süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri yıkamak için peleti 10 mL ekim besiyerinde yeniden süspande edin.Ardından bunları tekrar santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve yıkama ile santrifüj işlemini tekrarlayın. İkinci yıkamadan sonraki adım.Peleti 10 mililitre agregat kültür ortamında yeniden süspande edin, ardından hücreleri 70 mikrometrelik bir hücre eleğinden geçirin. Son olarak, bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.Artık disosiye edilmiş beyin hücrelerinin agregatlar oluşturmasına izin vermeye hazırsınız. Sayım işleminden sonra, disosiye hücreleri mililitre başına 2 × 10⁶ hücre yoğunluğunda agregat kültür ortamında süspande edin. Hücre süspansiyonundan iki mililitreyi, kaplanmamış altı kuyucuklu bir kültür plağının her bir kuyucuğuna aktarın.Hücreleri üç gece boyunca her gün nazikçe yeniden süspande edin. P 1000 pipet kullanıldığında, hücreler agregat ekim gününde agregatlar oluşturmaya başlayacaktır. Hücreler üç gece boyunca büyüdükten sonra, hücreleri tekrar nazikçe yeniden süspande edin ve süspansiyonu 200 µm'lik bir süzgeç aracılığıyla 50 mL'lik bir falcon tüpüne aktarın.Agregatların tüpün dibine çökmesi için yaklaşık üç ila beş dakika bekleyin. Ardından süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın, besiyeri ekleyin, agregatları nazikçe yeniden süspande edin ve tekrar çökmelerini sağlayın. Bu prosedürü birkaç kez tekrarlayın.Ölü hücreleri, tekil hücreleri ve debrisleri uzaklaştırmak için, süpernatantların hâlâ agregatlaşmamış hücreler ve debrisler içerip içermediğini mikroskop altında kontrol edin. Agregatları iyice yıkadıktan sonra, onları nazikçe aynı ortamda yeniden süspande edin ve konsantrasyonlarını belirlemek için agregatları sayın. Ardından, agregat yoğunluğunu 50 µL başına yaklaşık 25 ila 30 agregat olacak şekilde ayarlayın.Şimdi örtü lamları agregatlar ile ekime hazırlama zamanıdır. Agregat süspansiyonundan 1000 µL'lik alikotları iki mililitrelik eend Dwarf tüplerine aktarın; agregatlar tüplerin dibine çökmeye eğilimli olduğundan, ekim için agregat süspansiyonundan birden fazla tüp hazırlamak kritik önem taşır. Bu adımda kullanılan örtü lamlar, 37 °C'de gece boyu inkübasyon ile bir hücre kültürü substratı olan matrigel ile kaplanmıştır.Agregat süspansiyonun alikotlarını hazırladıktan sonra, matrigel kaplı lamelleri içeren kültür plakasını inkübatörden çıkarın. Her bir kuyucuktaki solüsyonu uzaklaştırın. Lamelleri önce ılık PBS ile ardından DD H2O ile yıkayın.Şimdi, lamel üzerine agregatlar ekmek için agregat ekimi aşamasına geçilebilir. Agregatları karıştırmak ve eşit şekilde dağıtmak için agregat süspansiyon tüpünü ters çevirin. Ardından, her bir lamelin merkezine 50 µL agregat süspansiyonu yükleyin.Agregatların lam üzerine eşit şekilde tutunmasını sağlamak için, plakayı daha fazla sarsmadan nazikçe inkübatöre geri yerleştirin. Agregat yoğunluğu kritiktir; eğer agregatlar birbirine çok yakın yerleştirilirse veya yerleşim yoğunluğu yüksek olursa, ilk yerleşimden dört ila altı saat sonra büyürken birbirleriyle birleşme eğilimi gösterirler. Her kuyucuğa 500 µL kültür ortamı ekleyin.Agregat kültürünü sürdürmek için, her üç ila dört günde bir ortamın yarısını değiştirin. Ortamı değiştirirken, agregatların bozulmasını önlemek için besiyerini kuyucuğun yan duvarı boyunca ekleyin. Agregatlar lamelle yapıştıktan birkaç saat sonra, agregatlardan dışa doğru büyüme gözlemlenebilir.Aksonlar ilk iki haftada hızla büyür ve agregatlar arasında bol miktarda bağlantı kurarlar. Ggl progenitörleri agregatlardan radyal olarak göç eder ve zamanla astrositlere ve olgun oligodendrositlere farklılaşırlar. CS agregatının nasıl kültüre edileceğini size göstermiş olduk.Bu prosedür gerçekleştirilirken, kapasitenin uygun şekilde belirtilmesi ve agregatın homojen olarak incelenmesi önemlidir. İşte bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneyinizde başarılar dileriz.

preparation-rat-brain-aggregate-cultures-for-neuron-glia-development

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada kültür sıçan kortikal nöronların glial besleyici tabakasının varlığı için bir protokol sağlar. Kültürlü nöronlar polarite kurmak ve sinapslar oluşturmak ve glia elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme, hücre sağkalım deneyleri, immünhistokimya ve RNA / DNA / protein izolasyonu gibi çeşitli uygulamalarda kullanılmak üzere ayrılabilir.

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

Beynin hücresel heterojenite birincil mikroglia Yalıtımlı fizyolojik ve patolojik hem de kendi rolünü araştırmak için esastır. Bu protokol bir mekanik izolasyon ve yüksek verim ve yüksek saflıkta sağlar karışık hücre kültürü tekniği için geçerli birincil mikroglia hücreleri...

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Biz kemirgen embriyolardan hipokampal ve kortikal nöronlar yalıtmak ve kültürüne hızlı bir metodoloji tanıtılmıştır. Bu protokol bize neredeyse saf nöronal kültürlerin gerekli olduğu deneyler yapmasına imkan tanıyor.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

Bu video, glial hücrelerin üç boyutlu bir kültürünü oluşturmak için bir tekniği göstermektedir. Sıçan beyninden türetilen glial hücreler, hücre dışı matris bileşenleri içeren fotokrosçapraz bağlanabilir bir polimer matris içinde kapsüllenir. Bir büyüme ortamında inkübe edildikten sonra, glial hücreler, üç boyutlu bir kültür oluşturmak için destekleyici matris içinde çoğalır.

Sıçan Beyninden Elde Edilen Glial Hücrelerin Üç Boyutlu Bir Kültürünün Oluşturulması

Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Biz değiştirmek ve uyarıcı kortikal nöronların 12 içine insan kaynaklı pluripotent Kök Hücre (hiPSCs) arasında hızlı, tekrarlanabilir ve verimli farklılaşma anlatan bir önceden yayınlanmış protokolü uygulamak. Özellikle, modifikasyon ağ düzeyinde elektrofizyolojik özelliklerini ölçmek için, mikro-elektrot dizileri üzerinde nöronal hücre yoğunluğu ve kullanım kontrol edilmesini sağlar.

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Bu makalede, bir glial tek tabakalı üzerinde ters cam lamelleri büyüyen düşük yoğunluklu birincil hipokampal nöronlar kültürleme için protokol açıklar. nöron ve glial tabakalar parafin mumu ile ayrılır. Bu yöntem ile yetiştirilen nöronlar yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme ve işlevsel tahliller için uygundur.

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Bu yazı, embriyonik sıçan sempatik nöronların superior servikal gangliyondan izole ve kültürlenmesini açıklamaktadır. Ayrıca immünositokimyasal boyama ve kütle spektrometrik analizi için nöronal özler hazırlamak için ayrıntılı protokoller sağlar.

Morfolojik ve Proteomik Analiz için Embriyonik Superior Servikal Ganglia'dan Sıçan Sempatik Nöronlarının Culturing

Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Öğrenin, fare embriyonik beyin agregaları hazırlayarak nöron ve glia hücrelerinin gelişimini incelemeyi. Bu yöntem, çok potansiyelli öncü hücrelerin farklılaşmasını gözlemlemek için güvenilir bir model sunar.

Nöron ve Glia Geliştirme Çalışmaları Rat Beyin Agrega Kültürler hazırlanması

Daha fazla video keşfet