Name: Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Öğrenin, TIRF mikroskopisi kullanarak goldfish retina bipolar hücrelerinde tek sinaptik vezikül ekzositozunu ve trafiklenmesini görselleştirme yöntemini. Bu teknik sinaptik iletim mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Grant EY 14990 tarafından desteklenen oldu.

Bölüm 1: Diseksiyon ve Bipolar Hücre İzolasyonu <ol><li> Tablo 2&#39;de listelenen çözümler hazırlayın; zilleri &#39;pH (harici) çözümleri NaOH ile 7.4&#39; e ayarlanmış olmalı ve iç çözüm pH 7.2 CsOH ile ayarlanabilir olmalıdır. Iç çözüm alüminyum folyo ile ışıktan korumak ve tutmak 4 ° C kullanana kadar; </li><li> Diseksiyon önce en az 30 dakika için bir Japon balığı Karanlık uyum; </li><li> (Sigma, St Louis, MO tip V hiyalüronidaz düşük Ca 2 + ringer, 1100 adet / ml) ve L-sistein (0.5 mg / ml, 10 ml hayvan koyu adapte ederken, 5 ml hiyalüronidaz hazırlamak düşük Ca 2 + ringer) çözümleri ve papain tartmak (liyofilize toz, 40 adet / ml, 5 ml sindirim çözüm Sigma, St Louis, MO); </li><li> Cerrahi makas ile hızlı dekapitasyon goldfish Euthanize ve # 11 neşter bıçağı ile beyin ve omurilik yok; </li><li> # 7 kavisli Dumont forseps yardımı ile ekstra oküler kaslar yok ve iris makası ile optik sinir kesme gözleri çıkarın; </li><li> Filtre kağıdı ve delinme skleral limbus # 11 neşter bıçak ucu ile bir parça bir göz ampul; </li><li> Delinmiş bütün içinde vannas makas bir çift bıçak tanıtmak ve hemen tüm anterior segment kesebilirsiniz; </li><li> Kalan optik fincan filtre kağıdı küçük bir parça koyun ve kağıt vitreus mizah ile emmek için bazı baskı; </li><li> Ona bağlı retina ile filtre kağıdı kaldırın ve bir par vannas makas ile optik sinir kesmek; </li><li> # 7 Dumont cımbız yardımı ile filtre kağıdı retina kapalı hiyalüronidaz çözüm ve soyulma ile 35 mm plastik kültür çanak retina içeren filtre kağıdı yerleştirin; </li><li> Retinanın bir endüstriyel karbon çelik tek ağızlı bıçak yarısı 4-6 parçalar halinde kesin ve 20 dakika boyunca hiyalüronidaz bir çözüm bekletin; </li><li> Yürürlüğe girmesi hiyalüronidaz için beklerken, L-sistein çözüm papain 5 ml ekleyin ve sıvı şeffaf hale gelinceye kadar (yaklaşık 5-10 dakika) oturup izin; </li><li> Düşük Ca 2 + Ringer 3x retinanın adet yıkayın ve bunları 30-35 dakika papain çözüm bekletin; </li><li> Düşük Ca 2 + Ringer 3x retinanın adet yıkayın ve kullanana kadar saklayabilirsiniz 4 ° C düşük Ca 2 içeren 35 mm plastik kültür çanak + Ringer; </li><li> Hücreleri ayırmak, düşük Ca 2 + Ringer 500 ml içeren bir mikrosantrifüj tüp içinde retinanın bir parça koydu ve yavaş yavaş hava kabarcığı üretmek için dikkatli bir şekilde, bir bardak disosiasyon pipet ile yukarı ve aşağı pipetleme retina çiğnemek . Bunsen beki ile bir bardak Pasteur pipeti ucu ısınma ve anatomik forseps yardımı ile hafif bükme Disosiyasyon pipetler fabrikasyon; </li><li> Plate izole hücreler retina süspansiyon, daha önce 2 mL düşük Ca 2 + ringer ile dolu bir ev yapımı kayıt odasına bir damla ekleyerek. Odanın ortasında dairesel bir bütün ile 35 mm plastik kültür çanağı ve bir silikon elastomer (Sylgard 184 altına yapıştırılmış 1.78 refraktif indeks cam (PlanOptik Almanya) dairesel bir lamel alt yarısında oluşur; Dow Corning Midland). </li></ol> Bölüm 2: Bipolar Hücre Yükleme ve Out yıkayın Sinaptik veziküllerin TIRF görüntüleme en iyi şekilde, çok yüksek bir NA nesnel ve duyarlı bir kamera, objektif bir tip TIRFM mikroskop kullanılarak gerçekleştirilir. Deneyler için, bir EMCCD (Cascade 512B, Roper Bilimsel, Tucson, AZ) ile 1.65 NA objektif (Apo x100 O HR, NA 1.65, Olympus, Japonya) kullanmayı tercih. Çok yüksek NA objektif kullanımı, yüksek kırılma cam lamelleri ve daldırma sıvısı (kükürt ile di-iodomethane) kullanımını zorunlu kılmaktadır. Koşullar altında, yaklaşık 50 nm sabit bir uzunluk ile uyarma ışık katlanarak çürüyen bir alanda sınırlıdır. <ol><li> Mikroskop objektif yüksek kırılma indisi sıvı (M serisi, refraktif indeksi = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) bir damla ekleyin; </li><li> Mikroskop objektif üstüne dikkatlice kayıt odasına yerleştirin ve dikkatli bir şekilde toprak elektrot ve odasına superfusion çıkış borusu monte; </li><li> Kamara, hücreleri lavabo ve alt uymak için izin mikroskopta 10-20 dakika oturup; </li><li> Bu arada, 1mm Trolox ® ((±)- 6-hidroksi-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-karboksilik asit 5 ml hazırlamak; Sigma, St Louis, MO), yüksek K + ringer çözüm . Eriyene kadar sonikasyon; </li><li> Düşük Ca 2 + ringer 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St Louis, MO): ADVASEP-7 yıkama solüsyonu 15 mL hazırlayın. ADVASEP-7 kullanımı isteğe bağlıdır ve istenirse atlanabilir unutmayın; </li><li> Superfusion li Temizleeşya ve eklemek ADVASEP-7 yıkama solüsyonu, düşük Ca 2 + ringer ve kontrolü zil sesi superfusion sistemi; </li><li> Ince duvarlı borosilikat cam (TEFE, Sarasota, FL Kwik-Fil ® TW150-3) pipetler yükleme çekin. Puffer pipet dirençler 1.5-2.5 M aralığı; </li><li> Çözümleri; FM1-43 ® (Invitrogen, Carlsbad, CA - (4 (dibutylamino) styryl) piridinium dibromür, &quot;özel paketleme&quot; N-(3-triethylammoniumpropyl) -4) hazırlayın. Birincisi, bir flakon FM1-43 (100 mg) ® 160 mcL distile su ekleyerek 1 mM stok olun. Bu stok, bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Sonra FM1-43 5 mcL eklemek ® 1 ml yüksek K + ringer + 1mm Trolox ®. Çözüm alüminyum folyo ile ışıktan koruyun ve 4 tutmak ° C kullanana kadar; </li><li> Mikroskop parlak bir alan ışığı açın ve sağlam bipolar hücreleri aramak. Biraz nöronlar odasının altına sıkıca bağlı olduğundan emin olmak için dokunun mikroskop; </li><li> Superfusion kalem yakın ilgi hücreye yerleştirin ve sürekli düşük Ca 2 + ringer hazırlık serpmek; </li><li> Odanın lambalarını kapatın ve kırmızı uzun geçiren filtre (yani RG630; Schott, Almanya) FM boya uyarma en aza indirmek için optik yol; </li><li> 10 mcL FM boya çözüm ile doldurun mikromanipülatör bir yükleme pipet pipet montajı ve basınç olmadan, yüklemek istediğiniz bipolar hücre aynı odak düzlemli kadar hazırlanması üzerine pipet düşük. En az iki elektrot tutucu olduğundan emin olun: FM boya için kullanılan bir başka hücre içi bir çözüm kontamine olabilir yama sıkma için kullanılır, ya da değildir; </li><li> Akson terminalinden yaklaşık 10 mikron mesafe kirpi açılış Pozisyon, superfusion sistemi kapatın ve 10 saniye boyunca boya çözüm pipet basınç çevirerek puff; </li><li> 30 saniye bekleyin, pipet hareket ettirmeden, basınç kapatın ve; </li><li> Superfusion çevirin ve 5 dakika ADVASEP-7 çözüm odasının banyo. Bu arada, banyo kirpi pipet kaldırmak; </li><li> 5 dakika sonra, düşük Ca 2 + ringer geçmek ve 25-30 dakika süreyle odasının serpmek aşırı boya atılmasına izin verir. </li></ol> Bölüm 3: Patch Sıkma ve TIRFM Görüntüleme <ol><li> Hazırlık yıkama, kalın duvarlı borosilikat cam (Sutter Instrument Company, Novato, CA B150-86-10) yama pipetler çekin. Patch pipet dirençleri 8-10 M aralığı; </li><li> Yıkayın tamamlandıktan sonra, akson terminaline görüş alanının merkezinde yer; </li><li> Mikromanipülatör monte iç çözüm 7μL bir yama pipet ile doldurun, hava kabarcıkları, mont, erimiş diş balmumu (Kerr Corporation, Orange, CA Sabit Wax) ile pipet kurtulmak için pipet dokunun; </li><li> Pipet basınç açın ve pipet hazırlanması üzerine yavaş yavaş daha düşük. Amplifikatör pipet direnci ve doğru pipet uzaklıklar ilgili amplifikatör kontrolleri ile kapasitans ve kontrol edin; </li><li> Ringer kontrol superfusion geçin. Pipet ve hücre arasında bir gigaseal oluşturmak için, hücre gövdesi karşı elektrot ucu hafifçe dokunun ve hafifçe elektrot negatif basınç uygularken pipet basınç kapatmak; </li><li> Kapatılmış olsa da, amplifikatör &quot;tam hücreli&quot; modunu seçin ve potansiyeli -60 mV tutan hücre ayarlamak; </li><li> Tüm akson terminali kapsayan görüntüleme yazılımı ile ilgi bir bölge seçin, parlak bir alan ışığı kapatın ve kısaca (30 ms) 488 nm lazer terminal açığa TIRF görüntüleme için doğru bir odak düzlemli bulmak; </li><li> Pipet biraz negatif basınç uygularken amplifikatör &quot;zap&quot; komutunu kullanarak hücre içine break; </li><li> Sinaptik veziküllerin hücre kapasitans ve seri direnç, doğru ve daha sonra ise ilgi gerilim protokolü uygulamak görüntüleme hareketi. Bu gerilim protokol kamera kare hızı ile senkronize olması için bu aşamada önemlidir. Bizim durumumuzda, her bir kare 30 ms uzun, voltaj değişiklikleri meydana gelen bu değeri (yani, her 300 ms veya 10 kare) katları; </li><li> Kurtarma için izin denemeleri arasında en az 40 saniye bekleyin; </li><li> 561 nm lazer açarken sinaptik şeritler konumunu kontrol etmek, fotoğraf çekmek. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: deney düzeneği. 488 nm lazer (mavi) amacı, arka odak düzlemi çevre odaklı ve cam sulu ortamda arayüzü ulaştığında toplam iç yansıma uğrar. Yansıyan ışın tarafından üretilen elektromanyetik alan Bott yakın sinaptik veziküller içine yüklenen fluorofor heyecanlandıran(yeşil) floresan cam odasının om. Floresan ışık, daha sonra gözlemci göz (tasvir) veya CCD kamera yönlendirilir. Patch-sıkma görüntülü hücrelerinin membran potansiyeli aynı anda kontrol edilir. Bu yaklaşım, gelen sinyalleri (membran voltaj) ve nöronal çıkışı (ekzositoz) arasındaki ilişki çalışma sağlar. <img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: Tipik bir sonuç. Sol: izole bir Japon balığı bipolar hücre parlak alan görüntü. Üst sağ: bipolar hücre akson terminaline sinaptik veziküllerin TIRF görüntü FM 1-43 yüklü ® ve 488 nm lazer (FM boya) ile görüntülenmiş. Sağ alt: 561 nm lazer ile yama hücre ve görüntüleme akson terminaline sonra aynı terminal görüntüsü. Synaptic şeritler rodamin tabanlı RIBEYE bağlayıcı peptid (Rpep_rhod) tarafından etiketlenir. Tablo 1: Belirli Reaktifler ve Ekipmanları. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Tip </td><td> Üretici </td><td> Katalog </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> - </td><td> Hava Tablo </td><td> Newport Corporation&#39;ın </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> IX70 </td><td> Ters Mikroskop </td><td> Olympus </td><td> - </td><td> Tungsten lamba ve parlak bir alan için TIRF lateral açılış portu ile donatılan </td></tr><tr><td> TH4-100 </td><td> Lamba Güç Kaynağı </td><td> Olympus </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> FF498_581-DI01 </td><td> Dikroik Filtre </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> NF01-405_488_568 </td><td> Emisyon Filtre </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Apo x100 O İK </td><td> Nesnel </td><td> Olympus </td><td> - </td><td> NA 1.65 </td></tr><tr><td> RG630 </td><td> Kırmızı Cam Filtresi </td><td> Schott </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 488 nm Lazer </td><td> Tutarlı </td><td> - </td><td> Minimum güç kullanımı </td></tr><tr><td> - </td><td> Panjur </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D1 </td><td> Deklanşör Sürücü </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 561 nm Lazer </td><td> Melles Griot </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Panjur </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D3 </td><td> Deklanşör Sürücü </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Perfüzyon basıncı Kiti </td><td> Superfusion Sistemi </td><td> Bilimsel otomatikleştirin </td><td> 09-04 </td><td> - </td></tr><tr><td> Perfüzyon Kalem </td><td> Superfusion Sistemi </td><td> Bilimsel otomatikleştirin </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Valvelink 8 </td><td> Superfusion Sistemi Kontrolörü </td><td> Bilimsel otomatikleştirin </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Cascade 512B </td><td> EM CCD Kamera </td><td> Roper Bilimsel </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Metamorph 7.1 </td><td> Görüntüleme Yazılımı </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> EPC-9 </td><td> Yama Kelepçe Amplifikatör </td><td> Heka Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Nabız </td><td> Amplifikatör Yazılım </td><td> Heka Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MP-285 </td><td> Mikromanipülatör </td><td> Sutter Enstrüman </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Elektrod tutucu </td><td> Heka Elektronik </td><td> - </td><td> 1.5 mm cam, 2 adet için </td></tr><tr><td> Kwik-Fil ® TW150-3 </td><td> Borosilikat Kılcal Cam </td><td> TEFE </td><td> - </td><td> Filament olmadan </td></tr><tr><td> B150-86-10 </td><td> Borosilikat Kılcal Cam </td><td> Sutter Enstrüman </td><td> - </td><td> Filament ile </td></tr><tr><td> P-97 </td><td> Mikroelektrod Çektirme </td><td> Sutter Enstrüman </td><td> - </td><td> 3x3 kutusunda filament ve çevre bölmesi ile donatılmış </td></tr><tr><td> - </td><td> Basınç Vakum Hava Pompası </td><td> Thomas Bilimsel </td><td> 7893B05 </td><td> Pipetler için oda ve aşırı basınç sıvı kaldırmak için bir vakum yaratır. </td></tr><tr><td> MatLab R2008a </td><td> Analiz Yazılımı </td><td> MathWorks </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 353001 </td><td> 35 mm Plastik Kültür Yemekleri </td><td> Şahin </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Yüksek Kırılma Endeksli Camı </td><td> PlanOptik </td><td> - </td><td> Kırılma indisi 488 nm = 1.78 </td></tr><tr><td> M Serisi </td><td> Yüksek Refraktif İndeks Sıvı </td><td> Cargille Labs </td><td> - </td><td> Kırılma indeksi = 1.78 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Silikon Elastomer Kiti </td><td> Dow Corning </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutatyon </td><td> Tripeptide </td><td> Merck Kimyasallar </td><td></td><td> Ücretsiz RADİKAl çöpçü </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> Enzim </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td> Tip V </td></tr><tr><td> L-sistein </td><td> Amino Asit </td><td> Fluka </td><td> 30090 </td><td> Papain etkinleştirir </td></tr><tr><td> Papain </td><td> Enzim </td><td> Fluka </td><td> 76220 </td><td> From carica papaya </td></tr><tr><td> Trolox ® </td><td> Çözünen vitamin E </td><td> Sigma </td><td> 56510 </td><td> Serbest radikal temizleyicisidir </td></tr><tr><td> ADVASEP-7 </td><td> Sülfonatlı B-siklodekstrin Türev </td><td> Sigma </td><td> A3723 </td><td> FM 1-43 azaltır ® eşiğe </td></tr><tr><td> FM 1-43 ® </td><td> Floresan Boya </td><td> Invitrogen </td><td> T35356 </td><td> &quot;Özel ambalaj&quot; </td></tr><tr><td> Sabit Wax </td><td> Pipet Kaplama Agent </td><td> Kerr Corporation&#39;ın </td><td> - </td><td> Pipet kapasitans azaltır </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Bu Çalışmasında Kullanılan Fizyolojik Çözümler. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Madde </td><td> Düşük Ca 2 + Ringer </td><td> Kontrol Ringer </td><td> Yüksek K + Ringer </td><td> İç Çözüm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 mm </td><td> 120 mm </td><td> 97.5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2.5 mM </td><td> 2.5 mM </td><td> 25 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0.5 mM </td><td> 2.5 mM </td><td> 2.5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.75 mM </td><td> - </td><td> - </td><td> 0.5 mM </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutatyon </td><td> 2 mM </td><td> 2 mM </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> CH 3 STK 3 S * </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> TEACl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> ATP-Mg </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> GTP-Li </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Rpep-rhod ** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Hacim </td><td> 200 mL </td><td> 100 mL </td><td> 5 mcL </td><td> 100 mcL </td></tr></tbody></table> * Sezyum methanesulfonate. ** RIBEYE bağlayıcı peptid: rodamin + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1997,75).

<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

Işık mesafe ile katlanarak düşer bu yana 2); objektif tip TIRF mikroskopi avantajları 1), böylece ışık-odak en aza indirmek amacı, odak düzlemi içinde dar bir bölgeye uyarma ışık kısıtlayarak mükemmel optik kesit sağladığı floresan yoğunluğunda bir değişiklik olarak, dikey yönde hareket izlenebilir; 3) yüksek sayısal açıklık hedefi 1,5 ile verimli bir ışık toplama . Bu tekniğin en önemli dezavantajı, elektron mikroskobu ile ultra ince bölümüne eşdeğerdir hücre yüzeyi, 100 ve mil içinde gerçekleşen görüntüleme olaylarla sı...

retina bipolar hücreler tirf mikroskopi görüntüleme ekzositoz

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu, cam gibi yüksek bir kırılma indisi maddeye yakın floresan moleküllerin seçici görüntüleme, hücre zarı meydana gelen olayların çalışma sağlayan bir tekniktir<sup&gt; 1</sup&gt;. Bu makalede, biz goldfish retina izole retinal bipolar hücreleri sinaptik veziküller görüntü ekzositoz için bu tekniği uygulamak. Bu nöronların, bu tür büyük akson terminallerinin nedeniyle çalışma için çok uygun. Bipolar hücreler sıkma aynı anda yama, presinaptik gerilim ve sinaptik salınımı arasındaki ilişkiyi araştırmak için mümkün<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Bipolar hücre terminalleri içinde Sinaptik veziküller (FM 1-43 ®) floresan boya ile yüklenen şişirme yüksek K içeren boya ve bir zil çözümü<sup&gt; +</sup&gt; Sinaptik terminaller üzerine konsantrasyon. Bu hücreler depolarizes ve glutamaterjik veziküller içine endositoz ve buna bağlı olarak boya alımını uyarır. Yaklaşık 30 dakika uzaklıkta aşırı boya yıkadıktan sonra, hücreler, yama kelepçeli ve 488 nm lazer ile aynı anda görüntülü olmak için hazırız. Yama pipet çözüm, sinaptik şerit protein RIBEYE seçici bağlar rodamin tabanlı peptid içeren<sup&gt; 4</sup&gt; Terminalleri 561 nm lazer ile görüntülü ve böylece özellikle şeritler etiketleme. Bu aktif olan bölgelerin kesin lokalizasyonu ve ekstra sinaptik olayları sinaptik ayrılmasını sağlar.

Bu video, etiket ve görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi kullanılarak goldfish retina bipolar hücreleri tek sinaptik vezikül ekzositoz ve ticareti nasıl göstermek.

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi, seçici ... yoluyla hücre membranında meydana gelen olayların incelenmesine olanak tanıyan bir tekniktir.

Bu prosedür, gözün arka kısmındaki sinir dokusu olan yetişkin japon balıklarının nöral retinasının diseksiyonu ile başlar. Retinalar, hücreleri ayrıştırmak için 35 dakika boyunca enzimatik bir solüsyonda bekletilir, durulanır ve alevle pürüzsüzleştirilmiş bir cam pipetle tritübe edilir. Hücreler daha sonra yüksek kırılma indeksli cam lameller üzerine ekilir ve plastik doku kültürü kaplarına yerleştirilir.İzole bipolar hücreler, yükleme terminallerinin belirgin morfolojileri aracılığıyla tanımlanır. Bu hücrelere FM 1 43 içeren bir solüsyonla 10 saniye boyunca püskürtme yapılır ve boya yıkanmadan önce 30 saniye beklenir. 30 dakikalık bir yıkamanın ardından hücrelere patch-clamp uygulanır ve TIRF mikroskopisi ile görüntüleme yapılır.Merhaba, ben Yale Üniversitesi Tıp Fakültesi Hücresel ve Moleküler Fizyoloji Bölümü'ndeki ZEC Laboratuvarı'ndan Christina Jovi. Bugün size, TURF mikroskopisi kullanarak canlı retinal bipolar hücrelerde ekzositozu incelemek için uygulanan bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, sinaptik salınım mekanizmalarını araştırmak için kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Başlamak için, diseksiyon öncesinde bir japon balığını en az 30 dakika boyunca karanlığa adapte edin. Dekapitasyon ve göz çıkarımının ardından, bir göz küresini bir filtre kağıdı parçası üzerine yerleştirin ve skleral limbusu delmek için 11 numara bistüri ucunu kullanın. Delinen deliğin içine doğru.Tüm ön segmenti kesip çıkarmak için bir çift bonna makası kullanın. Ardından, geride kalan optik kubbenin üzerine küçük bir filtre kağıdı parçası yerleştirin ve üzerine biraz baskı uygulayın. Vitreus humorini emdirmek için, retina ile birlikte filtre kağıdını kaldırın ve bir çift VNA makası kullanarak optik siniri kesin.Retina içeren filtre kağıdını, yüksek hialuron solüsyonu bulunan 35 milimetrelik plastik kültür kabına yerleştirin ve retinayı filtre kağıdından ayırmak için 7 numara Dumont pens kullanın. Ardından, endüstriyel karbon çelik tek kenarlı bir bıçağın yarısını kullanarak retinayı dört ila altı parçaya bölün ve hialuronidazın etkisini göstermesini beklerken parçaları hialuronidaz solüsyonunda 20 dakika bekletin. Hialuronidazın etkisini göstermesi beklenirken, papaine beş mililitre L-sistein solüsyonu ekleyin ve sıvı şeffaf hale gelene kadar yaklaşık 5 ila 10 dakika bekletin. Retina parçalarını düşük kalsiyumlu Ringer solüsyonu ile üç kez yıkayın ve papain solüsyonunda 30 ila 35 dakika bekletin.Papain çözeltisi içinde 35 dakika inkübasyondan sonra, retinal parçaları üç kez yıkayın. Parçaları düşük kalsiyumlu Ringer çözeltisi içeren 35 milimetrelik plastik bir kültür kabına aktarın ve hücrelerin dissosiyasyonuna başlayana kadar kabı 12 ila 14 °C'de saklayın.İlk olarak, bir cam PEs veya pipetin ucunu bek ve pürmüz kullanarak ısıtın ve ardından anatomik pens yardımıyla ucu hafifçe bükerek bir disosiyasyon pipeti hazırlayın. Bir retina parçasını, düşük kalsiyumlu ringer çözeltisi içeren bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve hazırlanan disosiyasyon pipeti ile dikkatlice yukarı-aşağı pipetleyerek retinayı yavaşça parçalayın. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, retinal süspansiyondan bir damlayı düşük kalsiyumlu ringer çözeltisi ile doldurulmuş ev yapımı bir kayıt haznesine ekleyerek izole edilen hücreleri yerleştirin.Hazne, ortasında dairesel bir delik bulunan 35 milimetrelik plastik kültür kabının alt yarısından ve tabana yapıştırılmış 1,78 kırılma indeksli camdan yapılmış dairesel bir lamelden oluşur. Diseksiyon ve bipolar hücre izolasyonu tamamlandıktan sonra, bipolar hücre yükleme ve yıkama işlemine başlamaya hazırız. Bu deneyde, çok yüksek sayısal açıklığa sahip bir objektif ve hassas bir kamera ile donatılmış objektif tipi toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanılması en uygunudur.Bu videoda, 1,65 sayısal açıklıklı bir objektif ve elektron çoğaltıcılı şarj bağlı aygıt (EMCCD) kullanacağız. Başlamak için, mikroskop objektifine yüksek kırılma indeksli sıvıdan bir damla ekleyin. Kayıt haznesini mikroskop objektifinin üzerine yerleştirin.Topraklama elektrodunu ve süperfüzyon çıkış borusunu dikkatlice hazneye monte edin. Hücrelerin dibe çökmesi ve yapışması için hazneyi mikroskop üzerinde 10 ila 20 dakika bekletin. Ardından, süperfüzyon hatlarını temizleyin ve yıkama solüsyonu ekleyin.Süperfüzyon sistemine düşük kalsiyumlu ringer çözeltisi ve kontrol ringer çözeltisini ekleyin. Mikroskobun parlak alan ışığını açın ve sağlam bipolar hücreleri arayın. Nöronların haznenin tabanına sıkıca tutunduğundan emin olmak için mikroskoba hafifçe vurun.Süperfüzyon kalemini sağlam bir hücreye yakın konumlandırın ve preparatı düşük kalsiyumlu ringer çözeltisi ile sürekli olarak perfüze edin. Şimdi odadaki ışıkları kapatın ve floresan boyanın eksitasyonunu minimize etmek için optik yola kırmızı uzun geçiren filtre ekleyin. Bir yükleme pipetini 10 µL floresan boya çözeltisi ile doldurun.Mikromanipülatöre monte edin ve ardından, seçilen bipolar hücre ile aynı odak düzlemine gelene kadar aşırı basınç seçeneğini kullanmadan preparat üzerine indirin. Püfleme açıklığını akson terminalinden yaklaşık 10 µm mesafeye konumlandırın. Süperfüzyon sistemini kapatın ve pipet aşırı basıncını açarak boya çözeltisini 10 saniye boyunca püfleyin.Şimdi aşırı basıncı kapatın ve pipeti hareket ettirmeden 30 saniye bekleyin, ardından süperfüzyon sistemini açın ve hazneyi beş dakika boyunca yıkama çözeltisiyle yıkayın. Bu sırada, tampon pipeti banyodan çıkarın.Beş dakika sonra, SUPERFUSION sistemini düşük kalsiyumlu ringer çözeltisine geçirin ve fazla boyanın uzaklaştırılmasına izin vermek için 25 ila 30 dakika boyunca perfüzyon uygulayın. Bipolar hücre yüklemesi ve yıkama işlemi tamamlandığında, patch clamp ve T-I-R-F-M görüntülemeye başlayabiliriz. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, patch pipetinizin boya ile kontamine olmasını önlemek için elektrot tutucularını değiştirin.Akson terminalini görüş alanının merkezine yerleştirin. Bir patch pipetini yedi µL iç çözelti ile doldurun. Hava kabarcıklarını gidermek için pipete hafifçe vurun.Erimiş dental vaksla kaplayın ve ardından mikro manipülatöre monte edin. Pipet üzerindeki basıncı açın ve pipeti preparatın üzerine yavaşça indirin. Pipet direncini kontrol edin ve gerekirse gerekli düzeltmeleri yapın.Ardından, süperfüzyon sistemi kontrol ringer çözeltisine ayarlanmışken, elektrot ucunu hücre gövdesine hafifçe değdirerek pipet ile hücre arasında bir giga sızdırmazlık (giga seal) oluşturun. Pipet üzerindeki aşırı basınç kapalıyken, sızdırmazlık sağlandığında elektroda nazikçe negatif basınç uygulayın. Amplifikatörde tüm hücre (whole cell) modunu seçin ve hücre tutma potansiyelini negatif 60 millivolt olarak ayarlayın.Şimdi, tüm akson terminalini kapsayan bir ilgi alanını seçmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Parlak alan ışığını kapatın ve terminali kısa süreliğine 488 nanometre lazerine maruz bırakın. TIRF görüntüleme için doğru odak düzlemini bulun.Ardından, pipete hafif negatif basınç uygularken amplifikatörün zap komutunu kullanarak hücreyi kırın; hücre kapasitansını ve seri direnci düzeltin. Daha sonra, sinaptik veziküllerin hareketini görüntüleyerek voltaj protokolünü uygulayın. Toparlanmaya izin vermek için denemeler arasında en az 40 saniye bekleyin.İlk olarak, aydınlık alan mikroskobunda bir bipolar hücre seçiyoruz. Ardından yakınlaştırarak akson terminalini floresan boya ile dolduruyoruz. 30 dakikalık yıkama işleminin ardından, doldurulmuş terminal ile floresan glutamaterjik veziküllerin hareketi mikroskopi altında görüntüleyebilir.Burada, 561 nanometre lazer ile görüntülendiğinde sinaptik şeritlerin konumunu görmemize olanak tanıyan bir rib eye bağlayıcı peptidi patch pipet aracılığıyla tanıtıyoruz. Ardından hücreleri depolarize ediyoruz ve 488 nanometre lazer ile vezikül hareketlerini görüntülüyoruz. Size retinal bipolar hücrelerin nasıl ayrıştırılacağını, plakaya yerleştirileceğini ve floresan boya ile yükleneceğini, ayrıca bu nöronlara nasıl patch-clamp uygulanacağını ve eş zamanlı olarak tüf mikroskobu ile nasıl görüntüleneceğini göstermiş olduk.Bu prosedürü uygularken hücreleri lazere çok fazla maruz bırakmamak önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

imaging-exocytosis-in-retinal-bipolar-cells-with-tirf-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada elektrofizyoloji ve Ca2 + görüntüleme için uygun agar-gömülü retina dilim hazırlanması için bir protokol. Bu yöntem, tek presinaptik sinir uçları doğrudan patch-klemp kayıtları kullanarak retina mikrodevreler şerit-tip sinaps bir çalışma sağlar.

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Kaynak: Daniele, F., et. al SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde Nörotransmitter Vezikül Dinamiklerini Değerlendirmek için TIRFM ve pH'a duyarlı GFP probları: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi. J. Vis. Uzm. (2015). Bu video, florofor etiketli sinaptik vezikülleri görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak insan nöroblastom hücrelerinin görüntülenmesini göstermektedir. Hücreler ilk olarak epifloresan modunda odaklanır. Daha sonra, zarın yakınındaki floroforları...

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Kullanılarak Hücre Görüntüleme

Kaynak: Winkle, C. C., et al. Akson dallanması ve nöronal morfogenez sırasında plazma zarı iletiminin rolünü tanımlamak için birleşik metodolojilerin kullanılması. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, kortikal nöronlardaki ekzositik olayları görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobunu göstermektedir. pH'a duyarlı bir yeşil floresan protein (GFP) markörü, vezikül füzyonu üzerine floresan yapar ve zaman atlamalı görüntülemede membran-proksimal ekzositozu yakalayan seçici TIRF...

Ekzositik olayların görselleştirilmesi için toplam iç yansıma floresan mikroskobu 

Polarizasyon tabanlı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (pTIRFM) hücre zarı dinamiklerinin gerçek zamanlı algılama sağlar. Bu makalede, düzenlenmiş Ekzositoz sırasında zar yeniden çalışma için pTIRFM uygulanmasını tarif etmektedir. Teknik doğrudan veya dolaylı membran şekil değişiklikleri içeren hücre biyolojisi diğer işlemler için genellenebilir.

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

Klatrin aracılı endositoz, hızlı ve oldukça dinamik bir süreç, sinyal reseptörleri de dahil olmak üzere birçok proteini içselleştirir. Burada açıklanan protokol, bireysel endositik olayların kinetiğini doğrudan görselleştirir. Bu, endositik makinenin çekirdek üyelerinin birbirleriyle nasıl koordine olduğunu ve protein yükünün bu süreci nasıl etkilediğini anlamak için gereklidir.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Burada biz ayrıntılı olarak düzenlenmiş ekzositozu canlı hücre görüntüleme için bir yöntem. Bu yöntem lysosome ilgili organelleri içinde birikir, FITC-dextran muhabir olarak kullanır. Bu basit yöntem aynı zamanda genetik olarak işlemek zor olan hücrelerdeki düzenlenmiş ekzositozu farklı modları arasında ayrım sağlar.

Düzenlenmiş ekzositozu için muhabir olarak FITC dextran görüntüleme

İn vivo görüntüleme, sağlık ve hastalıkta biyoloji çalışmaları için güçlü bir araçtır. Bu protokol, standart iki foton mikroskobu ile fare retinasının transpupiller görüntülemesini tanımlar. Ayrıca, retinanın birden fazla hücresel kohortunu floresan olarak etiketlemek için farklı in vivoimaging yöntemleri göstermektedir.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

Bu çalışma, fotoreseptör hücre gövdelerinin çıkarılmasının daha hızlı antikor difüzyonu ve immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve elektrofizyoloji deneyleri için iç retinal nöronlara gelişmiş yama pipet erişimi sağladığı alternatif bir düz montajlı retina preparatı sunmaktadır.

Omurgalı Retinasında İç Nükleer Tabaka Nöronlarını İncelemek için Geliştirilmiş Bir Düz Montaj Preparatı Olarak Bölünmüş Retina

Bu makale, retinadaki postsinaptik nokta ve mikroglia hareketliliğini görselleştirme ve nicelleştirme yöntemini spinning disk konfokal mikroskopisi kullanarak göstermektedir.

Hasta Sare Retinasında Mikroglia Dinamikleri ve Sinapslarla Etkileşimlerin Canlı Görüntülemesi ve Karakterizasyonu

Öğrenin, TIRF mikroskopisi kullanarak goldfish retina bipolar hücrelerinde tek sinaptik vezikül ekzositozunu ve trafiklenmesini görselleştirme yöntemini. Bu teknik sinaptik iletim mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Daha fazla video keşfet