Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

Floresan benek mikroskopisi, canlı hücrelerdeki çeşitli hücre iskeleti proteinlerinin dinamiklerini incelemek için kullanılır. Doğru şekilde uygulandığında, hücre iskeleti proteinlerinin hızının ve devir kinetiğinin kantitatif ölçümleri yapılabilir. Bu prosedüre, canlı hücrelere küçük bir hacimde floresan işaretli aktin mikroenjeksiyonu yaparak başlıyoruz.

Ardından, fotobezme etkilerini azaltmak için görüntüleme haznesini kurarız. İlk olarak, hücre lameline destek olacak mikro lamelin her iki yanına iki parça çift taraflı bant yerleştirilir. Sonra, görüntüleme besiyeri, açık yarıklardan birinin yakınına damlatılarak hazneye pipetlenir.

Son olarak, tüm dört kenar parafilm ile mühürlenir. Merhaba, ben James Lim; Scripps Research Institute Hücre Biyolojisi Bölümü'nde Galden'ın Deucer laboratuvarındayım. Bugün size floresan benek mikroskopisi üzerine bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü, göç eden epitelyal hücrelerdeki Aktin Dinamiklerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. İyi floresan benekli mikroskopi videoları elde etmenin temel bileşeni, aktinin seçtiğiniz bir florofor ile uygun şekilde etiketlenmesidir; aktin yüzeyindeki açık lizin kalıntılarını hedefleyen Alexa ve X rodine cin, bir middle Esther türevleri olan floroforların kullanılmasını öneriyoruz.

Beneklerin uzun süreli saklama öncesinde parlak ve belirgin görünmesini sağlamak için, işaretleme oranının aktin monomeri başına 0,3 ile 0,7 boya arasında yüksek olması önemlidir. İşaretlenmiş Aktin çözeltisini, 4 °C'de 20 dakika boyunca 75.000 ile 80.000 ×g'de santrifüj ederek berraklaştırın. İşaretlenmiş Aktin, G tampon çözeltisi içerisinde -80 °C'de saklanmalıdır.

Çözünmeyen agregatlara yol açabilen tekrarlı dondurma-çözme döngülerinden kaçınmak için iki mikrolitrelik alikotlar hazırlayın. Floroforların fotobeyazlamasını önlemek için, işaretli aktin çözeltisini uzun süre doğrudan ışığa maruz bırakmayın ve uzun süreli saklama için opak mikrosantrifüj tüpleri kullanın. Mikroenjeksiyon için hücreleri asitle yıkanmış kare cam lameller üzerine yerleştirin.

Lamel üzerine standart substrat kaplaması uygulanabilir ve bu işlem mikroenjeksiyonu etkilemeyecektir. Mikroenjeksiyona uygun hücreleri seçmek için, aktin hazırlanırken hücreleri 37 °C'de muhafaza edin. FSM için bu kriterleri göz önünde bulundurun.

Hücreler büyük olmalı, çapları 50 µm'den fazla olmalı, plakalara ekildiğinde düz bir şekilde yayılmalı ve substratlara doğal olarak yapışmalıdır. Ayrıca, hücre sitoplazmasının kapladığı alanın çekirdeğinden daha geniş olması da faydalıdır. Uygun bazı hücre hatları arasında PTK1, semender akciğer hücreleri ve AIA nöronları yer almaktadır.

Bu gösterimde, PTK 1 epitel hücrelerine enjeksiyon yapacağız. Mikroenjeksiyon iğnelerinin doğru seçimi, uç açıklığının boyutuna bağlıdır. Genellikle delik boyutları 0,5 mikrometreden üç mikrometreye kadar değişebilir.

0,5 ile 1 mikrometre arasında optimal bir açıklık boyutu öneriyoruz. Aktin enjeksiyonu için mikroenjeksiyon iğneleri satın alınabilir veya hazırlanabilir. Yeni başlayanlar için ticari bir iğne çekici mevcutsa, enjeksiyon prosedürüne başlamadan önce elinizde 10 ila 20 adet çekilmiş iğne bulundurmanızı öneririz.

Bir sonraki adım, işaretlenmiş acton'u buz gibi soğuk enjeksiyon tamponu ile seyreltmektir. Tüm çalışma çözeltilerini buz üzerinde tutun. İğneye yüklenen acton'un final konsantrasyonu olan ideal enjeksiyon konsantrasyonu, µL başına 0.5 ile 1 µg arasındadır.

D'nin aktin monomer yüküne oranının %40'lık etiketleme oranına dayandığı varsayılarak, 0,5 ila 1 µL seyreltilmiş aktin çözeltisi yükleyin. Aktin çözeltisini bir mikro şırınga iğnesi kullanarak dikkatlice dağıtın. Kabarcık oluşmamasına özen gösterin.

Hava kabarcıkları varsa, kabarcığın etrafındaki fazla sıvılar çekilerek kolayca giderilebilir. Acton solüsyonunun tamamen iğne ucunda olduğundan emin olun. İğnenin kapiler kısmı boyunca hiçbir yerde fazla solüsyon bulunmamalıdır, çünkü bu durum enjeksiyon akışını bozabilir.

Doldurulmuş iğne, mikroenjeksiyon için enjeksiyon tutucusuna takılmaya hazırdır. Hücrelerinizi inkübatörden çıkarın ve lameli mikroskop tablasına yerleştirin. Mikroenjeksiyon prosedürüne başlamak için doldurulmuş iğneyi mikroskoba götürün.

İğnenin ucuna temas etmemeye dikkat ederek iğneyi enjektör tutucusuna dikkatlice takın. Tutucuyu, iğnenin mikroskop tablasının tabanıyla 35 ila 50 derecelik bir açı yapacak şekilde konumlandırın. İğnenin ucunu, besiyeri yüzeyini hafifçe geçene kadar indirin.

Hücreleriniz şimdi iğne ucunu, objektifin merkezinin tam üzerine gelecek şekilde konumlandırır. İğne ucu objektifle hizalandığında, okülerden parlak bir hale görmelisiniz. Bu, iğne ucunun bittiği yerdir.

İğneyi yavaşça yanlara doğru hareket ettirmek, halenin yerini daha iyi belirlemeye yardımcı olabilir. Gezinme sırasında iğne ucunun hücrelerinizin oldukça üzerinde olduğundan emin olun. İğne ucunun kırılmasını önlemek için, hücreleriniz net bir şekilde görünene kadar mikroskobun Z.Focus ayarını yapın.

Ardından, hale kademeli olarak daralıp sonunda iğne ucunda birleşene kadar odağı kontrol ederek iğne ucunu yavaşça indirin. Ayrıca, doğrusal gölgeler oluşturacak olan iğne şaftını da arayabilirsiniz. İğnenin indirilmesi, iğne şaftını kademeli olarak belirginleştirecektir.

Kontrastı artırmak için faz halkasında küçük ayarlamalar yapılması gerekebilir; iğnenin ucu ve hücreleriniz artık net bir şekilde görünür olmalıdır. Enjeksiyon yapılacak hücreler seçilirken, serbest kenarları iğne ucuna bakacak şekilde konumlandırılmalıdır. Bu, çekirdeğin bulunduğu en kalın noktadan ön kenarın en ince noktasına kadar olan hücre eğiminin, iğne ucuna paralel seyretmek yerine doğrudan iğne ucuyla karşılaşmasını sağlayacaktır.

İğne basıncını 0.3 ile 0.8 PSI arasına ayarlayın. Uygulanan sabit basınç, aktin solüsyonunun düzenli bir akışla ilerlemesini sağlayacaktır. Enjekte edilecek hücreye karar verdiğinizde, iğneyi uç kısmı hücrenin çekirdeğinin yanına gelecek şekilde konumlandırın; iğnenin ucuna baskı uygulanana kadar iğneyi yavaşça indirin ve konumunu yeniden ayarlayın.

İğne ucu membranı delene kadar membranı kademeli olarak aşağı indirin. İğne membranı tamamen delmişse, hücre daha parlak görünecektir. Bu değişikliği görür görmez, iğne artık hücreye temas etmeyene kadar iğneyi kaldırın.

Gerçek delme ve enjekte etme işlemi 0,5 ile iki saniye sürecektir. Doğru yapıldığında, hücre şekli değişmemiş görünecektir. Hücreler üzerindeki stresi en aza indirmek için, her mikroenjeksiyon oturumu için 20 ila 45 dakikadan fazla zaman ayırmayın.

Enjeksiyon sırasında hücrede herhangi bir değişiklik görmeyebilir ve hücrenin parlaklığının artmadığını fark edebilirsiniz. Bu durum, iğne ucunun tıkanmış olabileceğini gösterir. Eğer trans enjektörünüzde mevcutsa, temizleme (clean) düğmesine basarak bunu test edebilirsiniz.

İğne ucu açıksa, bu durum sabit basınçlı akışı önemli ölçüde artıracaktır; bu durum, dalgalanmalar ve yakınlardaki kalıntıların dağılması şeklinde görülebilir. İğne ucu kapalıysa, ya yeni bir mikroenjeksiyon iğnesi takabilir ya da iğnenin ucunu, iğne ucu cam lam üzerine bastırana kadar iğneyi nazikçe indirerek kırmayı deneyebilirsiniz. Böylece ucun en uç kısmı kırılmış olur.

Kırılma alanı, mikroenjeksiyon tamamlandığında iğnenin bir uca doğru daralmaya başladığı kısım olan iğne ucunun alanının beşte birinden fazla olmamalıdır. Herhangi bir floresan kalıntısını gidermek için kaptaki hücre besiyerini taze, önceden ısıtılmış besiyeri ile değiştirin. Besiyerini değiştirdikten sonra, görüntüleme yapmadan önce hücrelerin 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca toparlanmasına izin verin.

Bu durum, hücreler inkübatörde iyileşirken aktinin mevcut hücre iskeleti ağına entegre olmasını sağlayacaktır; bu sırada görüntüleme haznesini kurmaya başlayın. Öncelikle görüntüleme medyumunu 37 °C'lik bir su banyosunda ön ısıtmaya tabi tutun. Ardından, 15 µL'lik bir oxa erase alikotunu oda sıcaklığında çözdürün.

Besiyerine daha sonra RA eklenmesi, fotobezme etkilerini büyük ölçüde azaltacaktır. Oxa erase'in alüminyum folyoya sarılı tutulması, fotohassas bileşiğin ışıktan korunduğundan emin olmanızı sağlayacaktır. VAP sızdırmazlık malzemesini düşük sıcaklığa ayarlanmış bir ısıtıcı üzerinde önceden ısıtın; VAP'ı aşırı ısıtmayın veya yakmayın, aksi takdirde sızdırmazlık malzemesi olarak etkinliğini kaybedecektir.

Temizlemek ve küçük kalıntıları gidermek için bir mikroskop lamını saf etanol ile ıslatılmış bir Kim wipe ile silin. Başka bir mikroskop lamı gibi temiz ve düz bir yüzey kullanarak, her biri 2,5 santimetre uzunluğunda iki eşit parça çift taraflı bandı üst üste yapıştırın. Bir platform olarak, tamamen düz bir düzlem oluşturmak için hapsolmuş tüm hava kabarcıklarını bastırarak çıkarın.

Ardından, bandın uzun ekseni boyunca her bir şeridin genişliği 0.5 santimetre olacak şekilde jiletle iki düz şerit kesin. Pens kullanarak, her bir şeridi mikroskobik lamın uzun kenarları boyunca, iki bant şeridi lamın merkezinde bir boşluk oluşturacak şekilde yerleştirin. Camla iyi bir sızdırmazlık sağlamak için bandın üzerine hafifçe bastırın.

Bu bant şeritleri, mikro lam ile lamel arasında ara parçalar görevi görecektir. Valfin tamamen sıvılaştığından emin olmak için kontrol edin. Bir sonraki adıma başlamadan önce, önceden ısıtılmış görüntüleme medyumunuzu alın.

Her 500 µL besiyerine 15 µL oxy rays ekleyin. Bir chem wipe'ı, üç sert kenar oluşturacak şekilde üçgen şeklinde katlayın. Bu, daha sonra lamelin silinmesi için kullanılacaktır.

Hücreleri pens yardımıyla inkübatörden çıkarın. Lamine camın bir köşesini hızlıca kaldırın. Lamine camı, hücrelerin bulunduğu yüzey yukarı bakacak ve dokuya temas etmeyecek şekilde bir kim wipe üzerine yerleştirin ve lamine camın karşılıklı iki kenarını yarı kuru bir yüzey oluşturmak için katlanmış kim wipe ile silin.

Ardından, lamellenin bir köşesini pensle tutun ve kuru yüzeyler iki bant şeridiyle hizalanacak şekilde lamelini mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Şu anda iki kenarın kapalı ve iki kenarın açık yarıklar şeklinde olduğunu fark edeceksiniz. Görüntüleme ortamı RA solüsyonundan 200 µL'yi yavaşça açıklıklardan birinin yakınına pipetleyin.

Herhangi bir hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edilmelidir. Çözelti, yeni monte edilen hazneye kılcal kuvvetlerle çekilmeli ve böylece hücreleriniz tamamen çözeltiye daldırılmalıdır. Bir pamuklu çubuk kullanarak, lamellenin dört köşesine eritilmiş vap uygulayın; böylece lameli hızlıca sabitleyip stabilize edebilirsiniz.

VAP'ın oda sıcaklığında saniyeler içinde kuruduğunu göreceksiniz. Ardından, kapalı kenarlardan başlayarak, pamuklu çubukla fırça darbesi yapar gibi ince bir VAP şeridi sürün. Aynı işlemi açık kenarlar için tekrarlayın.

Kaplama adımlarını tekrarlayarak sızdırmazlığı güçlendirin ve vap tabakasını yavaşça oluşturun. VAP, lamelin merkezini temiz bırakacak şekilde yalnızca kenarlarla sınırlandırılmalıdır. Lamelin kenarları mühürlendikten sonra, kalıntı ortamı temizlemek için DD H2O emdirilmiş bir kulak çöpü kullanarak lamelin orta kısmını nazikçe temizleyin.

Hücreleri ezmemeye dikkat edin. Bu temizleme adımını saf etanol ile tekrarlayın. Artık floresan benek görüntüleme için optimize edilmiş, tamamen kapalı bir görüntüleme haznesine sahipsiniz.

Tamamen sızdırmaz bir muhafaza kullanmak, floral fours örneklerinizin hızla fotobeyazlamasını önleyecektir. Tamamen kapalı bölmedeki hücreler artık görüntüleme için hazırdır. Cıva lambalı, epi aydınlatıcılı, uygun filtreli ve yağ daldırma objektifli bir ters geniş alan mikroskobu kullanıyoruz.

Apokromatik objektif görüntüleri, 6,7 mikron pikselli soğutmalı bir CCD kamera ve bir görüntüleme yazılımı ile yakalanır. Mikroskop tablasını 37 °C'ye kadar önceden ısıtın. Görüntüleme haznesini yerleştirin ve görüntülemeye başlamadan önce sıcaklığın stabilize olması için 10 ila 15 dakika bekleyin.

Sıcaklık stabilize olduğunda, hücrelerinize parlak alan (brightfield) modunda odaklanın ve ardından uygun floresan ayarlarını değiştirerek enjekte edilmiş hücrelerinizi bulun. Fotobezmeyi (photobleaching) azaltmak için floresan maruziyet süresini minimumda tutmaya çalışın. Sağlıklı ve kavisli ön kenarlara sahip enjekte edilmiş hücreleri arayın.

Aşırı enjekte edilmiş hücreler, çok sayıda filopoduyla benzerlik gösteren geri çekilmiş ve tırtıklı kenarlarla karakterize edilecektir. Bu hücrelerin görüntüsünü almayın. Görüntüleme ayarları; hücre tipine, işaretlenmiş aktinin kalitesine ve mikroskop bileşenlerine bağlı olarak değişecektir.

Bununla birlikte, pozlama ayarları iki saniyeden fazla olmamalı ve kareler arasındaki zaman aralığı beş ile 10 saniye arasında ayarlanmalıdır. Sinyal-gürültü oranını artırmak için kameradaki kazanç (gain) ayarları yükseltilebilir. İdeal benekleme (speckle) karakteristiklerinde, her bir beneğin komşu beneğe olan uzaklığı yaklaşık iki benek çapı kadar olmalıdır.

Epitel hücreler için benekli aktin ağı homojen görünecektir ve benekler eşit şekilde dağılmış olacaktır. En iyi benekli görüntüleri elde etmek için pozlama ayarları düzenlenmelidir.

Kaliteli benekleme (speckle) videoları elde etmenin anahtarı, odağın korunmasıdır. Bu durum, özellikle benek akışı ve devir daim ölçümlerini içeren analiz sonrası işlemler için büyük önem taşır. Dolayısıyla, kantitatif analizin kalitesi, zaman atlamalı çekim süresince odağın sabitlenmesine bağlı olacaktır.

Odaklamayı korumak için çeşitli stratejiler metinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır; bu gösterimde Nikon Perfect focus sistemi kullanılacaktır. Burada mikroenjeksiyon uygulanmış hücrelerin çeşitli örnekleri yer almaktadır. Sol panel, düşük konsantrasyonlu benekli bir görüntüye sahip, mikroenjeksiyon uygulanmış bir hücreyi göstermektedir.

Orta panel, çok yüksek konsantrasyonla mikroenjeksiyon yapılmış bir hücrenin speckle (benekli) görüntüsünü, sağ panel ise optimal şekilde enjekte edilmiş bir hücreyi göstermektedir. İyi bir speckle görüntüsüne sahip FSM için; floresan işaretli aktini, floresan speckle mikroskobisi amacıyla epitelyal hücrelere nasıl mikroenjekte edeceğinizi göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken, işaretlenmiş aktinin kalitesinin ve mikroenjeksiyon tekniğinin, benekli görüntülerin genel kalitesini belirleyeceğini hatırlamak son derece önemlidir. Hepsi bu kadar, deneylerinizde başarılar dileriz.