Name: Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 6 s
Description: Öğrenin fare retina ganglion hücrelerinde gen ifadesi manipülasyonu için in utero ve ex vivo elektroporasyon yöntemlerini. Bu teknikler retinal gelişim ve görsel yolakları araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz bu protokol ile ilgili yorumlar için Dr. Richard Vallée ve Brikha Shrestha utero ve ex vivo retina elektroporasyon teknikleri ile ilgili yardım için teşekkür eder, ve Dr T. Sakurai . Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık Grants F31 NS051008 (TJP), Fondation pour la Recherche medicale ve İnsan Frontier Bilim Programı (AR) ve (CM) R01 EY12736 tarafından da desteklenmiştir.

Bölüm 1: utero ve ex vivo retina electroporations için ayarlama 1. Utero ve ex vivo retina electroporations her ikisi için <ul><li> Ince uçlu mikropipetler hazırlamak ve açılı bir noktaya yapmak için ucu (veya konik ucu) kırmak için bir elektrot çektirmesi kullanın. </li><li> Istenilen konsantrasyonlarda DNA çözümleri hazırlayın ve Hızlı Yeşil Boya (% 0.05) enjeksiyonları görselleştirmek için küçük bir miktar eklemek. Utero retina electroporations için annenin başına 5 ul DNA çözümü ve ex vivo retina electroporations için embriyonik başına 1 ul DNA çözüm öneriyoruz. Transfekte nöronlar görselleştirmek için bir GFP ifade oluşturmak (ya da diğer floresan protein) ekleyin. </li><li> Cerrahi aletler otoklav yoluyla sterilize edin. </li><li> 100 mcg / ml ketamin 1.0:0.2:4.6 hacimsel oranı: 100 mg / ml ksilizin: tuzlu aşağıdaki oranı (her hamile kadın için yaklaşık 0,2 ml) ile ketamin ksilizin anestezik karışımı hazırlayın. Diğer anestezikler kullanılabilir. </li></ul> 2. Sadece utero retina electroporations için <ul><li> Isıtma yastığı açın ve bir bebek bezi ped ile örtün. </li><li> Fosfat tamponu salin (PBS) ve ısıtma yastığı sıcak antibiyotik antimikotik çözüm (1:100) hazırlayın. Her baraj ~ 2 ml hazırlayın. </li><li> Sıcak su banyosu steril filtrelenmiş PBS yerleştirin. </li></ul> 3. Sadece ex vivo retina electroporations <ul><li> Kabarcık DMEM/F12 25 ml% 95 oksijen / ≥ 2 saat için% 5 karbon dioksit: retina inkübasyon için oksijenli serum serbest orta (SFM) hazırlayın. 25 ml oksijenli ortamda, 0.25 g sığır serum albumini (BSA), 250 ul ITS ek ve 50 ul Penisilin-streptomisin çözüm ekleyin. Steril filtre, sonra çözüm BSA çözmek için çözüm karıştırın. Bu çözüm, her bir elektroporasyon deney için taze olarak yapılmalıdır. </li><li> Otoklav bir heyecan mıknatıs ile 150 ml şişe metilselüloz 0.20 g: retina eksplant inkübasyon için SFM +% 0.4 metilselüloz orta hazırlayın. SFM (yukarıdaki gibi, köpüren olmadan) 50 ml hazırlayın ve otoklavlanmış metilselüloz şişe ekleyin. 4 ° C gecede bu çözüm karıştırın. Steril filtre bu çözüm ertesi gün, 4 ve mağaza ° C olan bu çözüm, yaklaşık 1 ay muhafaza edilebilir. </li><li> Retina eksplant hasat (Bölüm 5) günü, retina eksplant kaplama için yemekler hazırlamak: Kat cam alt kültür kaplarına poli-L-ornitin 250 ul ≥ 2 saat boyunca 37 ° C. (Alternatif olarak, önceki gün yemekleri poli-L-ornitin ile kaplı olabilir ve 4 ° C&#39;de bir gece inkübe) PBS, 10 mikrogram / ml laminin için DMEM/F12 200 ul kat yemekleri ile birkaç kez yıkayın yemekleri ≥ 2 saat 37 ° ° C. 37 bulaşık PBS ile birkaç kez yıkayın ° C ve eksplantlar kaplama için hazır olana kadar PBS bırakın. </li><li> Sınır testlerde, poli-ornitin kat yemekleri, yukarıdaki gibi, sonra bir floresan işaretleyici ile birlikte protein ile faiz çanağı kat yarısı 2 saat için sınır (BSA, 1:800 konjuge Alexa Fluor 555) görselleştirmek için 37 ° C PBS ile yıkayın, daha sonra yukarıda açıklandığı gibi laminin ekleyin. </li></ul> Bölüm 2A: utero retina elektroporasyon in vivo E14.5 fare retinae içine DNA enjekte ve electroporating <ol><li> E13.5-E14.5 aşamada baraj içine 0.15 ml anestezik karışımı intraperitoneal (ip) enjekte edilir. Anne bir cerrahi anestezi düzlemine ulaşıncaya kadar 3-7 dakika sürer. Tam anestezi fare hindpaw sıkıştığı cevap olmamalıdır. </li><li> Bu süre zarfında, pipetlemeyin parafilm ve küçük bir parça kesip ~ parafilm üzerine DNA çözüm 5 ul. 90 ° derecelik bir açıyla (metal tel) bir dalgıç bükün ve çekti micropippette takın. Pistonu kullanarak, mikropipet (diseksiyon mikroskobu kullanılarak bu işlem yardımcı olabilir.) DNA çözüm aspirat. </li><li> Anne anestezi cerrahi düzlemine ulaştığında, daha sonra ısıtma yastığı onun dorsal yüzü aşağı, annenin karın ~ 2 inç bölge tıraş, elektrikli tıraş makinesi kullanın. Hazırlık alkol ped ile silerek traş alanı en az iki kez bir iyot ped izledi. Oftalmik Veteriner merhem annesi genel anestezi altında iken, gözlerde korneal ülserasyon önlemek için her gözün üzerine bir damla yerleştirin. <img src="/files/ftp_upload/1333/1333_v2fig1.jpg" alt="Şekil 1" /></li><li> Forseps, cilt kavramak ve periton açığa, karın kas ve deri yoluyla (yaklaşık 1 inç uzunluğunda) orta hat boyunca dikey bir kesi yapmak için makas kullanın. Forseps ile kaldırın ve periton karın boşluğunda (Şekil 1) ortaya çıkarmak için bu zarından benzer bir düşey kesi yapmak. Sonra iletişim kurmanızı ve saç ile kontamine olan karın içeriğini önlemek için gazlı bez ile cerrahi alanında asmakhayvan. </li><li> Forseps ile deri ve periton geri çekin ve kesiden bir embriyo (en erişilebilir embriyo seçin) ayıklamak için diseksiyon spatula kullanın. 2 embriyolar arasında spatula yerleştirin ve karın boşluğuna doğru hafifçe dışarı embriyonik zincir çekin. Parmaklarınızla embriyonik zincir çekin. * Bu noktadan itibaren, embriyoların steril PBS ile sulu tutmak * </li><li> Diseksiyon mikroskobu ve masaj retina yukarı bakacak şekilde bir embriyo altında onun yerine anne tutun, ısıtma yastığı. Daha kolay olan embriyolar electroporated takip etmek, ya da en medial veya lateral embriyo ile başlamanızı öneririz. </li><li> Mikropipet baskın el atın ve diğer elinizle embriyo stabilize. Mikropipet ile delmek rahim duvarına ve amniyon kesesi yoluyla retina. Mikropipet keskinliğini bağlı olarak, adil bir miktarda rahim duvarına nüfuz baskı alabilir, ancak bir kez aracılığıyla mikropipet embriyo ve ideal retina girecek. Bu, embriyo girerken mikropipet derinliğini kontrol ve ölçmek için zor olabilir. Amniyotik sıvı kaçak ve embriyo ölümü ile sonuçlanan, giriş deliği genişleterek önlemek için zarı delinir sonra mikropipet hareket miktarını en aza indirin. Bu kanama ve embriyo ölümüne neden olacağı için, rahim duvarının delici kan damarlarının kaçının. </li><li> Mikropipet retina girdiğini eminiz, retina içine DNA çözüm sınırdışı etmeye hazırız. Pistonu yavaşça bastırın ve aynı anda bu DNA mikropipet yol boyunca enjekte edilir mikropipet genellikle retinanın derin nüfuz olarak sağlanması, mikropipet geri. Retina iseniz, dış retina tabakası ve retina pigment epitel (RPE) arasında extraretinal uzaya 0.5 ul sınırdışı (mikropipet 1 ul onay işaretleri ile ölçülen). Amniyotik sıvı (Şekil 1) içine retina ve sızıntıları doldurarak yeşil boya dikkat etmelisiniz. </li><li> Elektroporasyon kürekler ameliyat sırasında PBS-dolu bir Petri kabındaki tutulmalıdır. Yavaşça enjekte göz olarak aynı tarafta pozitif (+) kürek ile embriyonun baş tarafta kürekler. Bu embriyo ölüm amniyotik kese ve sonuç çıkacaktır, ılımlı bir miktar kafa stabilize etmek için basınç uygulayın, ancak çok sert basmayın. Elektrotlar yerine, 60 Hz frekansında 5 40 V, 50 ms kare bakliyat sunar. Anne mevcut deri ve kaslar için kaçan nedeniyle seğirme için alışılmadık bir durum değildir. </li><li> Tekrar enjekte electroporated her bir embriyo için 7-9 adımları. Ben genellikle 4-8 DNA miktarına bağlı anne ortalama embriyolar, embriyo sayısı, anne durumu ve anestezi altında süreyi electroporate. Alternatif olarak, birden fazla embriyoların enjekte edilir ve sonra electroporated enjekte ve ayrı ayrı her bir embriyo electroporating karşı. </li><li> Embriyoların electroporating sonra, karın boşluğuna geri embriyonik zinciri yerine forseps ve spatula kullanın. Karın boşluğuna ~ 2 ml antibiyotik antimikotik çözüm dökün. </li><li> Hemostat ve forseps kesi ön kısmında bir çift düğüm ile başlayan, periton sütür ve kesi arka kısmına basit sürekli dikiş deseni ile devam etmek için kullanın. Sütür ve trim fazla dikiş bağlamak için son döngü kullanın. </li><li> Kesi kapalı zımba, periton cilt ayırmak için dikkatli olmak, künt forseps ile kesi ön kısmı deri kaldırın. Cildin etrafında, zımba, dişlerin zımba yerleştirin ve bastırın. Kesi genellikle 5-7 zımba gerektirir arka sonu, kapalı zımbalama devam edin. Zımba etrafında yara alkol ped ile silin. </li><li> Anne ısıtma yastığı (genellikle onu uyandırmak için 15-90 dakika arasında sürer) kurtarmak ve onun üzerinde rulo başladığında, yeni bir kafes karın tarafında onun yerine. </li><li> Rahatsızlık devam ederse ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için, anne az sonra zaman noktalarında uyanış üzerine buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg, sc) alırsınız ve. Dehidratasyonu önlemek için, anne ile 1,0 ml serum fizyolojik subkutan (sc), akşam ve ertesi gün gerekirse ~-cerrahi sonrası 2-4 saat, ve tekrar enjekte edilir. Ameliyat sonrası 24 saat, annenin normal davranış yeniden ve içme ve düzenli yemek. </li></ol> Parça 2B: utero electroporated retinanın retina elektroporasyon Alma yılında E18.5 <ol><li> Embriyo başına ~ 5 ml PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) hazırlayın. Perfüzyonları yerçekimine dayalı bir infüzyon sistemi veya bir şırınga pompası ile yapılabilir. (Alternatif olarak, E18.5 başkanları sadece bir gecede% 4 PFA dalmış olabilir.) </li><li> Ile anne enjekte edilir.0.2 ml anestezik ip karıştırın ve o anestezi altında tam olduğundan emin olun. Zımba altındaki deri ve periton karın boşluğu ve rahim boynuzları maruz kesmek için bir makas kullanın. </li><li> Electroporated embriyo çıkarın ve ventral tarafta pin up. Kalp, göğüs kafesi ve karın cilt, periton, diyafram ve lateral kısımları üzerinden maruz kesin. Pierce perfüzyon kurulum bağlı kelebek iğne ile sol ventrikül ve sağ atrium bir microscissors kesmek. Perfüzyon başlatın ve PFA ~ 60 saniye boyunca akmasına izin; kan sağ atriyuma çıkmalısınız ve perfüzyon başarılı olursa embriyo soluk haline gelmelidir. Embriyonun başını kesmek ve 15 ml konik flakon% 4 PFA baş toplamak. Electroporated embriyolar için bu yordamı tekrarlayın. Birkaç gün sonra PBS içinde yıkayın 4 geceleme% 4 PFA ° C başkanları tutun ve. Tüm embriyolar toplanan servikal dislokasyon ile anne Euthanize. </li></ol> Retinanın çıkarma <ol start="=4"><li> PBS yıkar sonra, baş yukarı bakacak şekilde retina ile diseksiyon çanak pin ve PBS içinde batırmayın. RPE ortaya çıkarmak için retinanın tüm çevresindeki deri çıkarın. 26G1 / 2 iğne kullanarak, delinme lens RPE kavşakta ventral retina. Bu deliğin içine yerleştirin ve bir kenarı bir microscissors optik disk ventral retina ile dikey bir kesi yapmak. Bunu kaldırmak Bu yönlendirmek için retina sağlayacaktır. </li><li> Ince nokta forseps ile RPE çıkarın. RPE bir forseps ile ventral kesi alın ve RPE sıkıca tutturulmuş RPE lens kavşak, özellikle retinanın RPE kabuğu diğer forseps kullanabilir. RPE çıkardıktan sonra, ince forseps ile objektif kavramak ve lens çıkarmak için yukarı ve dışarı çekin. Retina, optik sinir başı çevresinde forseps koyarak çıkarın ve retina çimdik. Için retinanın transfer PBS dolu, iyi retinae geldi parça hangi tutarak hangi başları. </li><li> Kontralateral retinanın için 4-5 adımları tekrarlayın ve diğer tüm electroporated embriyolar. Olmayan enjekte retina immün için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. </li><li> GFP + hücreler (yeşil retinae) için tüm retinae tarama floresan bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Tüm GFP + retinae için elektroporasyon bu embriyo başarılı oldu ve bu retinae ve buna karşılık gelen bir beyin (görsel sistem bozulmamış) daha fazla analizi (yani kesit ve immün) (Şekil 1) işlenebilir . </li></ol> Bölüm 3a, ex vivo retina elektroporasyon enjekte ve in vitro E14.5 fare retinae içine DNA electroporating <ol><li> 0.2 ml anestezik karışımı ile E13.5-E14.5 aşamada anne anestezisi ve o anestezi altında tam olduğundan emin olun. Deri ve karın boşluğunda embriyolar maruz kesmek için makas kullanın. Forseps ile embriyonik zinciri yukarı kaldırın ve bağ dokusu tamamen anneden tüm embriyonik zinciri kaldırmak için kesti. DMEM/F12 ile buz üzerinde bir Petri kabındaki embriyonik zinciri yerleştirin. Servikal dislokasyon ile anne Euthanize. </li><li> Bir microscissors ile tüm rahim duvarından geçerek kesin. Sonra her bir embriyo, plasenta kapalı, amniyon kesesi ve tutam çıkarmak için forseps kullanabilir. Her embriyo başını kesmek ve buz üzerinde DMEM/F12 başka bir Petri kabındaki başkanları toplamak. </li><li> (Bkz. Bölüm 1), ağız pipetlemeyin veya piston pipetlemeyin kullanarak, istenilen miktarda DNA çözüm mikropipet doldurun. </li><li> Bu protokolde, DNA, periferik dorsal retina içine enjekte edilecektir. Bir DNA enjeksiyon yeri ve elektrot kürekler konumlandırma ayarlayarak diğer retina bölgelerinde hedefleyebilir. </li><li> PBS ile diseksiyon çanak bir kafa transferi ve baş sırt tarafında pin up. Retina üzerinde cilt kaldırmak için forseps kullanın. </li><li> Holding mikropipet ~ 10 ° yatay konumda (dorsal retinanın eğrilik aslında paralel), bu yüzden, ucu RPE ve dış retina tabakasının arasında olduğunu RPE ile mikropipet itin. Bu uzaya ~ 0.1-0.4 ul DNA çözüm sınırdışı tüm alan yeşil sıvı dolum ve RPE de delikten dışarı sızdıran izlenebilir olmalıdır. Kontralateral retina enjeksiyon tekrarlayın. </li><li> Dikkatlice ama hızlı bir şekilde başın ventral tarafta pozitif (+) kürek, pimleri kaldırmak ve başının etrafında (PBS dalmış tutmak baş) elektrot kürekler. 4 40-V, 60 Hz 50 ms darbe, sonra buz (Şekil 2) DMEM/F12 ile bir çanak içine başın arka tarafında yerde sunun. <img src="/files/ftp_upload/1333/1333_v2fig2.jpg" alt="Şekil 2" /></li><li> Tüm başkanları ve tüm DNA çözümleri için 5-7 adımları tekrarlayın. (Enjekte her biri farklı DNA çözümü için iyi bir) tamamladıktan electroporations sonra, 4-iyi bir çanak oksijenli SFM çözüm ~ 1.5 ml ekleyin ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Bir retina yukarı bakacak şekilde, bir baş DMEM/F12 ile bir diseksiyon çanak aktarın. (Ya da yan ters hedef bölge), ventral retina tutam ince forsepsve RPE bir delik gözyaşı. Özellikle lens retina kavşakta, retinanın RPE kabuğu forseps bir ucunu bu delikten. Bu inkübasyon sırasında kendi üzerine çökmeye retina neden olacaktır, çünkü retina kesmek ya da zarar vermeyin. (Lens dokunmadığınızdan), retina üssünde kıstırma, optik sinir retina pop RPE çıkardıktan sonra, forseps kullanabilir. Oksijenli SFM retinae aktarın. Başının üzerinde Flip ve kontralateral göz için tekrarlayın. </li><li> Tüm electroporated başkanları için adım 9 tamamlayın. 40-48 saat 37 ° C&#39;de oksijenli SFM retina inkübe edin. </li></ol> Bölüm 3b: ex vivo retina elektroporasyon Hasat ve GFP, kaplama + retina eksplantlar (2 gün sonrası elektroporasyon) <ol><li> DMEM/F12 bir Petri kabı kapağının içine iyi bir oksijenli SFM tüm retinae aktarın. Bir retina seçin ve retinanın GFP + (yeşil) bölümü görselleştirmek için floresan diseksiyon kapsamı kullanmak. </li><li> Microscalpel ve forseps kullanma, incelemek ve sadece bir GFP + yığın retinanın kalır böylece retinanın olmayan GFP + kısmını atmak. GFP + retinanın özellikle seçmek için diseksiyon boyunca sürekli floresan ve düzenli ışık arasında geçiş yapmak için yararlı olur. DMEM/F12 ile iyi GFP + retina aktarın. </li><li> Iyi bir tüm retinanın için 2. adımı tekrarlayın. Her bir DNA durumu (her biri farklı bir yanı), yeni bir Petri kabı ve DMEM/F12 orta kullanın. </li><li> Bu GFP + retinae kaplama için küçük retina eksplantlar içine disseke olmalıdır. Diseksiyon kapsamında microscalpel küçük eksplantlar GFP + retinanın büyük bir parça kesti. Eksplantlarındaki dikdörtgen olmalı, uzunluk ve genişlik ~ 200-300 mikron. DMEM/F12 ile iyi bir bütün eksplantlar toplayın. Bir GFP + yığın retina ~ 4-10 GFP + doku büyüklüğüne bağlı retina eksplantlar üretmek gerekir. Tüm GFP + toplandı retina bölgelerinde için bu adımı tekrarlayın. </li><li> Tüm GFP + retina eksplantlar hazırladıktan sonra, SFM 250 ul +% 0.4 metilselüloz kültür yemekleri laminin kaplı (bkz. Bölüm 1) (4 ° C&#39;de muhafaza) Transferi 4-8 GFP + kültür çanak ve hafifçe yarım çanağı merkezi ve kenar arasında yer eksplantlar bir çokgen, eksplantlar düzenlemek için forseps kullanabilir eksplantlarında. </li><li> RGC katman eksplant hangi tarafta belirleyin. Bazen RPE kristalleri karşı tarafa RGC katmanı olduğunu belirterek, dış retina tabakasının bağlı kalır. Buna ek olarak, RGC bir tarafı genellikle uygun eksplant yönde yardımcı olabilecek bazı hücresel enkaz vardır. </li><li> RGC aşağı tabakası ile forseps, cam lamel uyacaktır böylece eksplant merkezinde sıkıca bastırmak için kullanın. Forseps eksplant bir girinti görülebilir, bu normaldir. </li><li> Bir kültür çanak tüm eksplantlarında kaplama sonra, 37 transfer ° C inkübatör. Retina aksonlar kaplama sonrası ilk 4-6 saat gözlenir ve eksplantlar birkaç gün boyunca sağlıklı kalır, ama önemli üremesine yol 24 saat sonra ortaya çıkabilir. Eksplantlarındaki 30 dakika ile immunohistokimyasal (Şekil 2) için% 4 PFA ile sabit, çok sayıda in vitro tayinlerde için kullanılabilir. </li></ol> Sınır Testi <ol start="8"><li> Alternatif olarak, (bkz. Bölüm 1) sınır tayini için hazırlanmış olup, bir çanak 4 GFP + eksplantlar aktarın. Sınırın yerini yakın, çanak merkezi bir dikey çizgi eksplantlar düzenleyin. </li><li> Floresan diseksiyon mikroskobu, plaka altında eksplantlar floresan sınır ~ 50-150 mm böylece. RGC aksonlar için yeterli zaman sağlayan, sınır substrat ulaşmak için 24 saat 37 ° C&#39;de yemekleri inkübe edin. Eksplantlarındaki immün (Şekil 2) takip 30 dakika boyunca% 4 PFA sabit olabilir. </li></ol> Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/1333/1333_v2fig3.jpg" alt="Şekil 3" />

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eye+Retina+and+the+Visual+Systems+of+the+Mouse%22">Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse</a>. Chalupa, L. M., Williams, R. W. , MIT Press. Cambridge. (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li>
<li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li>
</ol>

Bu video, embriyonik fare RGCs içine utero ve ex vivo gen teslimat için elektroporasyon teknikleri, göstermiştir. Utero retina elektroporasyon RGCs gen ekspresyonu işlemek için bir mekanizma sağlar ve in vivo olarak akson projeksiyonları görselleştirmek. Embriyoların hayatta kalmak için izin vermek postnatal hedef bu GFP + RGC projeksiyonları muayene izin verir, lateral genikulat çekirdeği (LGN) ex vivo, in vitro tayinlerde ile kullanmak için özel bir retina bölgeleri hedef retina elektroporasyon daha kontrollü bir yeteneği sağlar. In vivo ve in vitro analizler bu teknikleri türetilmiştir birleştiren, normal bir arka planda bir alt kümesi RGCs RGC gelişim ve akson projeksiyonları kapsamlı karakterizasyonu sağlar. Bizim gösteri utero ve ex vivo gen ekspresyonu etkisi RGC farklılaşma, dendritik morfoloji, elektrofizyolojik özellikleri, sinaps oluşumu ve düzgün tedirginlikler Böyle bir fesih bölgeleri hedefleyen eğitim retina electroporations için yararlı olabilir, hem optik kiazma RGC akson rehberlik odaklanırken LGN ve üstün colliculus.

<table><tbody><tr><td>BTX Electro Square Porator ECM 830 (ayak pedallı)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak cımbız elektrotlar</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY650-5 veya CUY650-7</td><td></td></tr><tr><td>İpek Süturlar</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>Pistonlu cam mikropipetler</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-antimikotik</td><td>Invitrogen</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 besiyeri</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITS takviyesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Metil selüloz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Cam Tabanlı Mikrokuyu Kapları</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr></tbody></table>

fare retina ganglion hücreleri gen İfadesi utero ve ex vivo elektroporasyon

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Retina ve tek çıkış nöron, retina ganglion hücre (RGC), hücre farklılaşması, akson rehberlik, retinotopic organizasyon ve sinaps oluşumu [1] gibi biyolojik soruları incelemek için mükemmel bir model oluşturmaktadır. Bir dezavantajı, verimli ve güvenilir aksi erişilebilir fare görme yolları, özellikle, in vivo RGCs gen ekspresyonu işlemek için yeteneksizliği. Transgenik farelerin gen ekspresyonu işlemek için kullanılan, ancak bu yaklaşım, genellikle zaman alıcı pahalı ve istenmeyen yan etkilere neden olabilir. Civciv, ovo elektroporasyon, retina ve RGC kalkınma incelenmesi için RGCs gen ekspresyonu işlemek için kullanılır. Benzer elektroporasyon teknikleri yenidoğan fare Yavrularda geliştirilmiş olmasına rağmen, [2], yetişkin sıçanlarda [3], ve embriyonik fare retinae in vitro [4], in vivo RGC geliştirme ve akson projeksiyonları bu stratejilerin hiçbiri tam karakterizasyonu izin verir. Bu amaçla, özellikle embriyonik fare RGCs [5, 6], hedef elektroporasyon, utero ve diğer ex vivo bir iki uygulama geliştirdik . Utero retina elektroporasyon ile misexpress veya downregülasyon RGCs belirli genlerin ve rehberlik kararları, ara hedefler, bu optik kiazma ya da hedef bölgelerde, örneğin incelenmesi sağlayan, in vivo olarak görme yolları yoluyla akson projeksiyonları izleyin Lateral genikulat çekirdeği. RGCs bir başka vahşi-tip arka planda bir alt kümesi gen ekspresyonu rahatsızlık vermesini retina yol boyunca gen fonksiyon bir anlayış kolaylaştırır. Ayrıca, in vitro RGC akson büyüme analiz için bir arkadaşı tekniği geliştirdik. Biz, embriyonik kafaları ex vivo electroporate toplamak ve tüm retinanın inkübe, bu retinae birkaç gün sonra eksplantlar hazırlamak. Retina eksplantlar rehberlik ipuçları veya diğer faktörler electroporated RGC akson yanıt incelemek amacıyla bir dizi in vitro tayinlerde kullanılabilir. Özetle, bu teknikler genler RGCs misexpress veya downregülasyon ve RGC geliştirme ve akson projeksiyonları inceleyerek çalışmalar büyük ölçüde yardımcı olmalıdır yeteneğimizi arttırır.

Burada fare retina ganglion hücrelerinin (RGCs) gen ekspresyonu işlemek için iki teknik mevcut<em&gt; In utero</em&gt; Ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elektroporasyon. Bu teknikler bir gen ifadesinde değişiklikleri, RGC geliştirme, akson rehberlik ve fonksiyonel özellikleri nasıl etkilediğini incelemek için olanak sağlar.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

Retina ve onun tek çıkış nöronu olan retinal ganglion hücresi (RGH), hücre... gibi biyolojik soruların incelenebileceği mükemmel bir model teşkil eder.

In utero retinal elektroporasyon, embriyonik zinciri ortaya çıkarmak için anestezi altındaki E 13.5 ila 14.5 evresindeki anneye abdominal insizyon yapılmasıyla başlar. Her embriyonun bir retinasına DNA enjekte edilir ve başlar elektropore edilerek DNA'nın RGC öncülleri tarafından alınması sağlanır. E 18.5 evresinde embriyolar perfüze edilir ve GFP pozitiftir.X vivo retinal elektroporasyon için retina ve görsel projeksiyonlar analiz edilir. E 13.5 ile 14.5 arasındaki başlar, bir kap içerisinde dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde sabitlenir ve DNA, her iki retinanın periferik dorsal bölgesine enjekte edilir; ardından elektroporasyon uygulanır. Tüm retina 40 saat boyunca kültüre edilir ve ardından in vitro kültür analizleri için GFP pozitif retinal eksplantlar ekilir.Merhaba, ben Columbia Üniversitesi Patoloji, Hücre Biyolojisi ve Nörobilim Bölümü'ndeki Dr. Carol Mason laboratuvarından Tim Petros. Bugün sizlere, in utero ve ex vivo retinal elektroporasyon yöntemlerini kullanarak embriyonik retina hücrelerine nasıl gen aktarımı yapılacağını göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, gen ekspresyonunun manipüle edilmesinin retinal ganglion hücrelerinin projeksiyon yolaklarını, özellikle optik kiyazma bölgesinde nasıl değiştirdiğini incelemek için kullanıyoruz.Tamam, başlayalım. Utero retinal elektroporasyon denemeden önce, uygun hazırlık yapılması gereklidir. Aletlerin ve ekipmanların anestezik sterilizasyonunun hazırlanması, enjeksiyon için DNA çözeltilerinin ve cerrahi sonrası için antibiyotik anti-mikotik çözeltilerin hazırlanması, cerrahi alanın hazırlanması ve uygun çözeltilerin ısıtılmasıyla ilgili ayrıntılı bilgiler için lütfen yazılı protokolümüze bakınız.İnce uçlu mikropipetler, cerrahi işlemden önce bir mikro elektrot çekici kullanılarak hazırlanmalıdır. In utero elektroporasyon için uç, açılı bir nokta oluşturacak şekilde kırın. İlk olarak, E 13.5 ila E 14.5 evresindeki bir anne fareye 0,15 mililitre anestezik karışımı intraperitonal olarak enjekte edin. Farenin anestezi altında olup olmadığını test etmek için annenin tamamen anesteziye girmesi üç ila yedi dakika sürmelidir.Hayvanın anestezi etkisine girdiği aralıkta arka patiyi sıkıştırın ve tepkisizlik durumunu kontrol edin. DNA solüsyonundan küçük bir parça kesin ve parametrenin üzerine beş mikrolitre pipetleyin. Metal bir tel pistonu 90 derecelik açıyla bükün ve çekilmiş bir mikro pipete yerleştirin; pistonu kullanarak DNA solüsyonunu mikro pipete aspire edin.Şimdi fare embriyolarını cerrahi olarak açığa çıkarın. Uygun teknik için lütfen Wal Inus ve ark. tarafından hazırlanan JoVE protokolüne bakınız. Artık elektroporasyon için hazırız.İlk adım retinayı uygun şekilde konumlandırmaktır. Ardından retinaya DNA enjekte edeceğiz ve sonrasında başa elektroporasyon uygulayacağız. Tamam, başlayalım.Tamam, ilk adım retinayı bunun gibi yukarı bakacak şekilde konumlandırmaktır. Ardından mikropipet ile amniyotik duvarı delerek DNA'yı ideal olarak doğrudan retinaya enjekte edeceğiz. Uterin duvarı deldikten sonra, DNA'yı retinaya püskürtecek olan pistonu aşağı itip ardından pistonu geri çekeceksiniz.Bu nedenle, DNA'yı enjekte ettiğinizde, yeşil boyanın amniyotik sıvıyı ve aynı zamanda retinayı doldurduğunu görmelisiniz. Tamam, enjeksiyonu gerçekleştirdiğimize göre artık elektroporasyon için hazırız. Elektroporasyon yapmak için, elektroporasyon pedlerini embriyonun etrafına, pozitif pedi elektroporasyon uygulanacak olan retinanın yanına gelecek şekilde yerleştireceğiz.Hazır olduğunuzda, basınca duyarlı ayak pedalı embriyoya akım iletecektir. Negatif yüklü pedalda kabarcıkların oluştuğunu göreceksiniz ve bu, elektroporasyonun başarılı olduğunu gösterir. Bu adımı tüm enjekte edilmiş embriyolar için tekrarlayacaksınız.İşte bir embriyonik retinaya DNA elektroporasyonu bu şekilde yapılır. Bu prosedürü istediğiniz kadar embriyo üzerinde tekrarlayabilirsiniz. Ancak unutmayın ki, ne kadar çok embriyoya elektroporasyon uygularsanız, annenin embriyoları düşükleterek atma olasılığı o kadar artar.Embriyoları elektro-paralize ettikten sonra, embriyolar yerine yerleştiğinde embriyonik zinciri parmaklarınızla masaj yaparak tekrar ana rahmine itin. Karın boşluğuna yaklaşık iki mililitre antibiyotik ve antimikotik solüsyon dökün. Hemostat ve forseps kullanarak, insizyonun ön kısmında çift düğümle başlayarak peritonyumu dikin ve insizyonun arka kısmına kadar basit sürekli sütür modelinde devam edin.Süturu bağlamak için son döngüyü kullanın ve fazla süturu kesin. Son olarak, insizyonu zımbalayarak kapatın. Bunu yapmak için, insizyonun anterior kısmındaki deriyi künt pensle kaldırın.Deriyi peritondan ayırmaya dikkat edin. Ardından, zımbalayıcının dişlerini derinin etrafına yerleştirin ve zımbalayıcıyı bastırarak insizyonu arka uca kadar zımbalamaya devam edin; bu işlem genellikle beş ila yedi zımba gerektirir. Zımbalama işlemi tamamlandığında, yaranın zımbalar etrafındaki bölgesini alkollü bir pedle silin.Damın ısıtıcı ped üzerinde kendisini toplamasını bekleyin ve ardından onu yeni bir kafese yerleştirin. Titremeye ve yuvarlanmaya başladığında, ağrıyı ve rahatsızlığı minimuma indirmek amacıyla uyanması genellikle 15 ila 90 dakika sürer. Anneler, uyandıktan sonra ve daha sonraki zaman noktalarında buprenorfine alırlar.Rahatsızlık hali dehidrasyonu önlemeye devam ederse, cerrahi işlemden yaklaşık iki ila dört saat sonra anneye deri altına bir mililitre salin enjekte edin. Cerrahi işlemden 24 saat sonra, annenin normal davranışlarına dönmesi, düzenli olarak yiyip içmesi gerekir. Analiz için elektropore edilmiş retinayı E 18.5'te hasat edeceğiz.Alternatif olarak, dişinin doğum yapmasına izin verebilir ve daha ileri yaşlardaki analizler için retinayı postnatal yaşlarda hasat edebilirsiniz. Hayvanı anestezi altına aldıktan sonra, zımbaların altındaki deri ve peritonu kesmek için makas kullanın. Karın boşluğunu ve uterus boynuzlarını açığa çıkarmak için, elektropore edilmiş bir embriyoyu çıkarın ve embriyoyu ekstremitelerinden bir diseksiyon kabına ventral tarafı yukarı bakacak şekilde iğneleyin; ardından karın derisini ve peritonu kesin ve kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesinin lateral kısımlarını kesin.Ardından, sol ventrikülü perfüzyon iğnesiyle delin ve sağ atriumu mikro makasla kesin. Şimdi perfüzyonu başlatın ve PFA'nın yaklaşık 60 ila 90 saniye boyunca akmasına izin verin. Doğru yapıldıysa, kan sağ atriumdan çıkmalı ve embriyo soluklaşmalıdır.Perfüzyon tamamlandıktan sonra, embriyoyu dekapite edin ve başları 15 mililitrelik konik bir tüp içindeki %4 PF'ye toplayın. Bu prosedürü tüm elektropore edilmiş embriyolar ve tüm dişler için tekrarlayın. Tüm embriyoların toplanması işlemi tamamlandığında, dişiyi servikal dislokasyon yoluyla sakrifiye edin.Başları %4 PFA içerisinde gece boyunca 4 °C'de bekletin ve ardından birkaç gün boyunca PBS ile yıkayın; PBS ile yıkama işleminden sonra, başarılı GFP ekspresyonu için retinayı incelemeye hazırsınız. İlk olarak, başı bir diseksiyon kabına, retina yukarı bakacak şekilde ve PBS'e daldırılmış olarak iğneleyin. 26,5 gauge bir iğne kullanarak, retinal pigment epitelyumunu veya RPE'yi açığa çıkarmak için retinanın etrafındaki deriyi temizleyin.Ventral retinayı lens RPE birleşim noktasından delin. Ardından, mikro makasın bir ucunu bu deliğe yerleştirin ve ventral retina boyunca optik diske kadar dikey bir insizyon yapın. Bu işlem, retinayı çıkardığınızda yönünü belirlemenizi sağlayacaktır.Bir pens yardımıyla ventral insizyondaki RPE'yi tutarak RPE'yi retinadan ayırın. Ardından, başka bir pens kullanarak RPE'yi retinadan, özellikle RPE'nin sıkıca yapışık olduğu RPE lens birleşim noktasından soyun. RPE'yi çıkardıktan sonra, lensi pensle kavrayın ve yukarıya, dışarıya doğru çekin.Lensi çıkarmak için, retinaltı kısmına pens yerleştirerek retinayı dikkatlice kaldırın ve retinayı serbest bırakmak için optik sinir başına hafifçe baskı uygulayın. Son olarak retinayı PBS dolu bir kuyuya aktarın. Hangi retinanın hangi baştan geldiğini takip ettiğinizden emin olun; aynı işlemleri karşı taraf retinası ve elektroporasyon uygulanan diğer tüm embriyolar için tekrarlayın. GFP pozitif retinaları taramak için floresan diseksiyon mikroskobu kullanın; bu durum, bu embriyoda elektroporasyonun başarılı olduğunu gösterir ve bu retinalar ile ilgili beyin dokusu ileri analizler için işleme alınabilir.Ex vivo retinal elektroporasyon prosedürü, in utero elektroporasyondan farklı olan birkaç ek hazırlık adımı gerektirir. Serumsuz ortamın hazırlanması ve oksijenasyonu ile kültür kaplarının ve kenar analizlerinin hazırlanması hakkında detaylı bilgi için lütfen yazılı protokole bakınız. Hayvan anestezi altına alındıktan sonra, daha önce gösterildiği gibi karın boşluğu açılır ve tüm embriyonik zincir çıkarılarak buz üzerinde D-M-E-M-F 12 içine yerleştirilir.Ardından, anne hayvan servikal dislokasyon yöntemiyle uyutulmalıdır. Uterus duvarını kesmek için makas kullanın, ardından embriyoları amniyotik keseden çıkarıp D-M-E-M-F 12 içine toplayın ve buz üzerinde tutun; embriyoların başlarını kesin ve buz üzerinde DMEA medyumunda saklayın, gövdeler atılabilir. Sonrasında, bir ağız pipeti veya itici pipet kullanarak, bir mikro pipete istenen miktarda DNA solüsyonu doldurun.Ardından bir tanesini PBS içeren bir diseksiyon kabına aktarın ve başı dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde iğneleyin. Enjeksiyonlar için diseksiyon mikroskobuna geçin.Tamam, şimdi elektroporasyon için hazırız. Her iki retinada da periferik dorsal bölgeye DNA enjekte edeceğim ve ardından baş bölgesine elektroporasyon uygulayacağım. Tamam, başlıyorum.İlk adım, retinanın üzerindeki deriyi çıkarmaktır. Bunu yapmak için, deriyi soyup uzaklaştırmak adına sadece cımbız kullanacağız. Artık her iki retinanın dorsal kısmını görebiliyoruz.Sıradaki adımda, her iki retinada da retinal pigment epitelyum tabakasının hemen altına DNA enjekte edeceğim. Bunun için elektrodu neredeyse yatay bir konumda tutacağım ve retinanın en periferik dorsal kısmından RPE'yi deleceğim. Yeşil boyanın retinal alanı doldurduğunu ve PBS çözeltisine sızdığını görmelisiniz.Tamam, şimdi elektroporasyon zamanı. Öncelikle başı sabitleyen pini çıkarın. Şimdi elektroporasyon pedlerini yerleştireceğiz ve pozitif pedin başın ventral tarafında olmasını istiyoruz.Başın pedalların arasına, pozitif pedal ventral yüzeyde olacak şekilde yerleştiriyoruz ve pedalı sabit tutmak için şu şekilde basınç uyguluyoruz. Şimdi elektroporasyon işlemini gerçekleştiriyoruz. Pedallar üzerinde ve başın üst kısmında kabarcıkların oluştuğunu görebilirsiniz.İşte bu kadar. Şimdi başı, besiyeri içeren bir kaba taşıyacağız. Ex vivo retinal elektroporasyon işlemi burada sona ermiştir.Bu prosedürü istediğiniz kadar embriyo ve DNA koşulu için tekrarlayın. Şimdi retinayı kültüre etmeye hazırlanacağız. Tüm elektrot hazırlıkları tamamlandıktan sonra, dört kuyucuklu bir kaba yaklaşık 1,5 milliliters oksijenle zenginleştirilmiş SFM çözeltisi ekleyin ve buz üzerinde tutun.Enjekte edilen her farklı DNA çözeltisi için bir kuyucuk ayırın. Ardından, elektropore edilmiş bir örneği transfer edin. Ventral retinada veya hedef bölgenin karşı tarafında bir retina yukarı bakacak şekilde, D-M-E-M-F 12 içeren bir diseksiyon kabına yerleştirin.RPE'de bir delik açmak için ince pens ile sıkıştırıp yırtın. Retinanın çevresindeki RPE'yi soyup kaldırmak için bu deliği başlangıç noktası olarak kullanın. Gözü kesmeyin veya zarar vermeyin; aksi takdirde inkübasyon sırasında retina kendi üzerine çökecektir.RPE çıkarıldıktan sonra, lensi yerinde bırakarak retinanın tabanındaki optik siniri sıkıştırıp pens yardımıyla retinayı dışarı çıkarın. Retinayı dört kuyucuklu kaptaki oksijenlendirilmiş SFM'ye aktarın. Başın yönünü değiştirin ve karşı göz için retina çıkarma işlemini tekrarlayın.Bu adımı elektropore edilmiş tüm başlar için tamamlayın ve retinayı oksijenle zenginleştirilmiş SFM içinde 37 °C'de 40 ila 48 saat inkübe edin. Tüm retinanın inkübasyonundan sonra, retinayı oksijenle zenginleştirilmiş SFM'nin bulunduğu kuyucuktan D-M-E-M-F 12 içeren bir Petri kabı kapağına aktarın. Floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak bir retina seçin ve retinanın GFP pozitif ekspresyon gösteren kısmını görüntüleyin.Ardından, bir mikro skalpel ve pens kullanarak, retinadan sadece GFP pozitif olan bir parçası kalacak şekilde GFP pozitif olmayan kısmı diseke edip atın. Diseksiyon boyunca floresan ve normal ışık arasında sürekli geçiş yapmak faydalıdır. GFP pozitif retinayı spesifik olarak seçmek için, GFP pozitif retina parçasını G-M-E-M-F 12 içeren bir kuyucuğa aktarın.Bu adımı tek bir kuyuktaki tüm retinalar için tekrarlayın; her DNA durumu için, GFP pozitif retina parçalarını ekim için daha küçük retinal explanlara ayırmak amacıyla yeni bir Petri kabı ve D-M-E-M-F 12 besiyeri kullanın. Büyük GFP pozitif retina parçasını bir mikro skalpel ile daha küçük explanlara bölmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Explanların uzunluğu ve genişliği yaklaşık 200 ila 300 micrometers olmalıdır.Bir GFP pozitif retina parçası, yaklaşık dört ila 10 GFP pozitif retinal eksplan üretmelidir. Tüm eksplanları D-M-E-M-F 12 içeren bir kuyucukta toplayın. Bu adımı, hasat edilen tüm GFP pozitif retina bölgeleri için tekrarlayın. Tüm GFP pozitif retinal eksplanlar hazırlandıktan sonra, laminat kaplı kültür kaplarına 250 microliters soğuk SFM ve %0,4 metilselüloz ekleyin.Ardından, dört ila sekiz adet GFP pozitif eksplantı kültür tabağına aktarın ve pens kullanarak X eksplantlarını, her bir X eksplantı tabağın merkezi ile kenarı arasındaki orta noktaya gelecek şekilde bir poligon oluşturacak şekilde nazikçe düzenleyin. X eksplantının hangi tarafının RGC tabakası olduğunu belirleyin. Bu işlem, bazen dış retina tabakasına yapışık kalabilen ve karşı tarafın RGC tabakası olduğunu belirten RPE kristallerini arayarak gerçekleştirilebilir.RGC tarafı da genellikle, RGC tabakası aşağı gelecek şekilde yapılan açıklamanın (explant) uygun şekilde yerleşmesine yardımcı olabilecek bazı hücresel kalıntılar içerir. Açıklamanın merkezini, kültür kabının tabanındaki cam lamelle yapışacak şekilde pens yardımıyla kuvvetlice bastırın. Tüm X açıklama kültür kabına ekildikten sonra, 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın.Retinal X eksplantları 24 saat sonra bol miktarda akson büyümesi gösterir ve çok sayıda in vitro analiz için kullanılabilir; ardından 30 dakika boyunca %4 PFA ile fikse edilirler. Sınır analizi (border assay) için immün boyama yapılır. 4G FP pozitif eksplantlar, sınır analizi için hazırlanmış bir kaba aktarılır.X eksplantlarını, kullandığınız substratın floresan sınırına yakın olacak şekilde düz bir hat boyunca düzenleyin. Floresan diseksiyon mikroskobu altında, eksplantları floresan sınırdan yaklaşık 50 ila 150 µm mesafede olacak şekilde yerleştirmek için pens kullanın. Yeşil eksplantı ve kırmızı sınırı görüntülemek için iki floresan kanal arasında geçişler yapın.Ardından, RGC aksonlarının sınır substrata ulaşması için yeterli süre tanıyarak plakları 37 °C'de 24 saat inkübe edin. Daha sonra X explan, 30 dakika boyunca %4 PFA ile fikse edilebilir ve ardından immün boyama uygulanabilir. İn utero retinal elektroporasyonu takiben.Retinadaki GFP pozitif RGC'leri görselleştirmek için yarı sağlam retinal delikli preparatlar hazırlanabilir. Optik sinir, optik kiyazma ve optik traktus boyunca GFP pozitif aksonları görselleştirmek için görsel sistemler hazırlanabilir. Alternatif olarak, retinadaki GFP pozitif RGC hücre gövdelerini ve optik sinir, kiyazma ve traktustaki aksonları görselleştirmek ve analiz etmek için retina ve RGC yolu boyunca frontal kriyoseksiyonlar alınabilir.Tüm retinal aksonlar nörofilament boyaması ile görselleştirilir. Ek olarak, P4 ile P10 arasındaki yavrular hasat edilerek, lateral genikulat çekirdek (LGN) içindeki RGC akson hedeflemesini incelemek için in utero elektroporasyon kullanılabilir. P8 aşamasında, ex vivo elektroporasyon ve retinal implantların ekilmesinin ardından tüm RGC projeksiyonlarını etiketlemek için ipsilateral retinaya CTB LOR 5 94 (kırmızı kanal) ve kontralateral retinaya CTB LOR 6 47 (mavi kanal) enjekte edildiğinde, LGN'de GFP pozitif aksonlar görünür hale gelir.RGC aksonlarının bir alt kümesi RGFP pozitiftir ve sırasıyla üstteki ve alttaki görüntülerde görüldüğü üzere hem düşük hem de yüksek büyütmede net bir şekilde görselleştirilebilir. GFP pozitif aksonların yanıtı, burada mavi ile gösterilen çeşitli substrat sınırlarının yanına XS ekilerek analiz edilebilir. Utero ve ex vivo retinal elektroporasyon kullanarak embriyonik ayna retinaya genlerin nasıl aktarılacağını göstermiş olduk.Analizimizi optik kiazmanın akson yönlendirmesine odaklamış olsak da, bu teknik RGC farklılaşmasını, dendritik morfolojiyi ve retinal ganglion hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini çalışanlar için faydalı olabilir. Bu prosedür uygulanırken, DNA enjeksiyonu sırasında retinaya verilen zararın minimize edilmesi ve deney boyunca embriyoların PBS ile her zaman nemli tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.

in-utero-ex-vivo-electroporation-for-gene-expression-mouse-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir...

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Bu videonun genel amacı hedef retina enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği göstermek için...

Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Midgestation Fare Embryolarının Alt Rombik Dudak in vitro Elektroporasyon yılında

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine...

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Bu prosedür, in utero elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan fare ön beynindeki internöronların nasıl hedefleneceğini gösterir. Bu teknik, korteksin yüzeysel katmanlarına yönelik internöron alt tiplerinde seçici gen ekspresyonu elde etmek için özellikle etkiliydi.

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir Eski-ovo Elektroporasyon Yaklaşımı

İn ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikro-RNA dizilerinin civciv embriyolarına sokulmasını ve genomik entegrasyonunu içeren yeni bir fonksiyon kaybı yaklaşımı geliştirdik. Bu teknik, geliştirme sırasında gen fonksiyonu çalışmaları için sağlam ve kararlı bir gen yıkım metodolojisi sağlar.

Yapay mikroRNA'ların Tol2 Transpozon Aracılı Transgenik Ekspresyonu Kullanılarak Embriyonik Civciv Retinasında Fonksiyon Kaybı Yaklaşımı

Öğrenin fare retina ganglion hücrelerinde gen ifadesi manipülasyonu için in utero ve ex vivo elektroporasyon yöntemlerini. Bu teknikler retinal gelişim ve görsel yolakları araştırmak için kullanılır.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

Daha fazla video keşfet