Dorsal önbeyin eksplantlar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk Yerleştirme

Kullanacağım ilk boncuk tipi bunlardır. Bunlar mavi jel boncuklardır. Yumuşak yapıdadırlar.

Bu boncukları X'lere yerleştirmek için ağız pipetinin ucuna havuzlanmış bir cam pipet takmam gerekiyor. Göstereceğim ikinci boncuk türü heparin akrilik boncuklardır. Bunlar sert tipte boncuklardır ve bu boncukları bir tungsten iğne kullanarak X eksplantlarının üzerine yerleştireceğim. Bunlar, önce bunzen beki kullanarak eriteceğim cam kılcal borulardır.

Ardından, daha ince bir uç oluşturmak için onları çekeceğim. Bunun için kapiler tüpü alevin ortasında tutuyorum ve tüp erirken onu döndürüyorum. Yumuşadığını hissedebiliyorum.

Alevi üzerinden kaldırıp çekeceğim. Güzel ve düz bir kesim elde edebilmek için bu elmas uçlu kalemle kılcal tüp boyunca bir çizik oluşturacağım. Ardından uçları temizlemek için alevle cilalayacağım.

Kılcal borunun ucunu cilalamak ve açıklığı küçültmek için boruyu alevden geçireceğim; böylece boncuğun kılcal borunun içinden geçip gitmesi yerine yakalanmasını sağlayacağım. Dikkat edilmesi gereken önemli bir nokta, kılcal boruyu alevde çok uzun süre tutmamanız gerektiğidir. Bu işlem aslında çok hızlı bir geçiş şeklinde yapılır, aksi takdirde boru kapanacaktır.

Bunlardan genellikle birkaç tane hazırlarım çünkü çoğunda uç kısmının alevle mühürlendiği görülür. Bunu kontrol etmek zordur, bu yüzden sadece birkaç tane hazırlarsınız. Bu, uç kısmının mühürlendiği bir örnektir.

Bu, iyi bir pipetleme örneğidir. Bu eppendorf tüpüne 250 µL agar boncuğu pipetledim ve içinde bulundukları azi çözeltisini uzaklaştırmak için bunları 1 mL PBS ile beş kez yıkayacağım. Boncukların çökmesi için yaklaşık üç dakika bekleyeceğim ve ardından fazla PBS'yi aspire edip bu işlemi dört kez daha tekrarlayacağım.

Boncuklar henüz tam olarak çökelmedi, boncuklar çökeldiğinde fazla PBS'yi aspire edeceğim ve bu işlemi dört kez tekrarlayacağım. Sonunda 300 µL PBS ekleyip boncuklarla çalışmaya başlayacağım. Bu standart bir ağız pipeti ve çektiğim kılcal boruyu yaklaşık üçte birine kadar içine iteceğim.

İlk olarak, pipetleri PBS ile doldurun. Genellikle sadece kılcal hareketle dolar. Burada 30 milimetrelik bir kültür kabının kapağı bulunmaktadır ve üzerine mavi renkli boncuklardan bir damla koydum.

Ve onun yanında küçük bir PBS damlası bulunmaktadır. Buradaki kapta ise beş mikrolitrelik protein çözeltisi damlaları yer almaktadır. Bu örnekte B ve P four kullanılmıştır, ancak mikro pipet kullanarak seçtiğiniz herhangi bir proteini kullanabilirsiniz.

Buradaki mavi daireden bir boncuk transfer edeceğim ve onu bir kez PBS damlasında durulayacağım. Ardından, ağız pipetiyle boncuğu alıp protein çözeltisi damlasına yerleştireceğim ve ya oda sıcaklığında yaklaşık bir saat ya da dört derecede birkaç saat inkübe edeceğim. Burada, PBS içindeki bir boncuk havuzu görüyorsunuz ve uygun boyuttaki boncukları seçmem gerekiyor.

Eğer çok küçüklerse, ağız pipetinden doğrudan geçerler. Sadece uç kısımda durmaları gerekir. Şimdi gördüğünüz üzere, orada birkaç boncuk seçtim; üç büyük boncuk ve üç küçük boncuk.

Deneyde daha büyük boncukları kullanacağım. Şimdi, PBS damlacığındaki büyük bir boncuğu protein çözeltisi damlacığına aktaracağım. Bunu yapmak için, dilimi ağız pipetinden nazikçe geri çekeceğim.

Bu bir emme hareketi değil, sadece biraz negatif basınç uygulamaktır. Ardından onu karşıya aktaracağım ve temel olarak dilimi tekrar ağız kısmının üzerine yerleştireceğim. Boru başlığına üflemiyorum, sadece boncuğu uçtan itmek için biraz pozitif basınç ekliyorum.

Şu an protein çözeltisi damlacığında beş boncuk var ve bunları dört derecede birkaç saat veya alternatif olarak oda sıcaklığında yarım saat ile bir saat arasında inkübe edeceğim. Bu, ortamda yüzen membranı ve halihazırda disseke ettiğim yumurtalıkları içeren kültür kabıdır. Pipetimin ucunu kullanarak ortamdan bir miktar sıvı çekeceğim.

Boncukları, X düzlemine yerleştirmeden hemen önce bir damla besiyerinde sadece bir kez durulayacağım. Bunlar, akrilik boncukları almak ve yerleştirmek için kullanacağım tungsten iğnelerdir. Bu tungsten iğnedir ve şu an tutucusunun içindedir.

Bunlar ise ince uçlu penselerdir. 45 derecelik bir açıyla, PBS havuzundan bir boncuk kaldırmak ve bu boncuğu bir protein çözeltisi damlacığına aktarmak için tungsten iğneli pensemi kullanacağım.

Algil boncuklarda yaptığım gibi, bu akrilik boncukları da beş kez PBS ile duruladım ve bir damlayı bu plakaya aktardım. Ardından, pensle tuttuğum tungsten iğneyi kullanarak bir boncuğu protein damlasına aktaracağım ve tıpkı jel boncuklarda yaptığım gibi inkübe edeceğim.

Şimdi boncuğu kaldırma işlemi yapılacak. Sağ elimi masaya sıkıca dayıyorum ve sıvıya doğru inerken iğneyi sabitlemek için sol işaret parmağımı kullanıyorum; bir boncuğa iğneyle hafifçe dokunup onu sıvıdan yavaşça yukarı kaldırıyorum. Bazen boncuk iğneden düşebiliyor, bu durumda sadece başka bir tane almak için geri dönün.

Şimdi sol elimle, 45 derecelik açılı pensi tutuyorum. Uçları aşağı bakacak şekilde, boncuğu ve iğneyi sıvıya değdiriyorum ve kullanıyorum. Pensin ucunu kullanarak, onu nazikçe aşağı doğru bastırıp ayırın.

Şu an protein içinde beş boncuğum var. Tamam, sağ elimle tungsten iğneyi boncuğun içinde tutuyorum ve sol elimle, pensimi yine dört tanesini ittiğim şekilde ucu aşağıya bakacak şekilde tutuyorum; aynı işlemi burada x explan üzerinde tekrar yapacağım. 37 °C'de inkübe edin; süre, spesifik deneye bağlıdır.