Name: Hasat ve hazırlanması Drosophila Embriyolar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Öğrenin Drosophila embriyolarının hasat ve diseksiyonunu, elektrofizyolojik kayıt için. Bu yöntem, nöromusküler gelişimi ve kuluçka yapamayan mutantları incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

KB NIH hibe GM54544 tarafından desteklenmektedir.

Bölüm 1: Ekipman ve Malzemeleri <ol><li> Iyi bir diseksiyon mikroskobu, embriyo diseksiyonları için gerekli olan; 40X büyütme 25X göz adet ile maksimum büyütme artırmak için önerilmektedir. </li><li> Güzel forseps (sayı 5), embriyo ve embriyo devitellinization manuel seçimi için gereklidir. </li><li> Ekipman ince cam iğne yapmak ve değiştirmek için gereklidir. Çekti cam iğneler diseksiyon için gereklidir. Diseksiyon (uzun ömürlü) için sağlam bir cam tercih, ama standart kalın duvarlı cam tüp (dış çapı 1-1.5 mm) olarak iyi çalışır. Bazı insanlar 10 + Amp yapıldığında pil kullanarak 1M NaOH banyo istenen netlik elektroliz ince tungsten iğneler, kullanın. Bilenmiş tungsten diseksiyon iğneleri, onlar nispeten dayanıklı ve uzun ömürlü olduğunu yarar var. Çukur cam iğneler (kelepçe elektrotlar yama benzer oluşan), plastik boru bağlı ve tuzlu su emme ve kovulma diseksiyonu, tutkal gibi kontrollü teslimat sırasında kullanılır. Cam Elcikler çeşitli cam iğneler üretimi için kullanılabilir. Bilgisayar programlanmış Elcikler şekil ve büyüklükte çeşitli çekmek için önceden ayarlanmış olabilir. Brown Flaming modelleri (Sutter Instrument Co) yaygın olarak tercih edilmektedir. (20-40X objektif) bir bileşik mikroskop kullanmadan önce kontrol edin ve elektrotlar değiştirmek için mevcut olmalıdır. </li><li> İki tür çözümler banyo Diseksiyon sırasında embriyonik dokularda yaygın kullanılır: 1) &quot;standart&quot; (Jan Jan, 1976a) ya da değiştirilmiş standart &quot;(Broadie 2000) Salines kayıt için diğer omurgasız sistemlerinde yaygın olarak kullanılan çözümler dayalı , ve 2) &quot;haemolymph gibi&quot; (HL) Salines (Stewart ve ark 1994), standart tuzlu ve Drosophila haemolymph ölçülen iyon konsantrasyonları arasında bir uzlaşmadır. Bu Salines hiçbiri doğru in vivo haemolymph kimyasal bileşimi (Broadie 2000) taklit olduğu unutulmamalıdır. Standart tuzlu su içeren (mM): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 72 sakaroz, 5 TES, pH 7,2. Deneyciler de elektrofizyolojik kayıt için uygun değildir ancak maruz dokuların sağlığını korumak için büyük olasılıkla ticari olarak hazırlanan böcek tuzlu su (örneğin Schneider Böcek Medya), dikkate almak isteyebilirsiniz. </li></ol> Bölüm 2: Embriyo Sahneleme ve Diseksiyon <ol><li> En iyi yumurta toplama, genç (&lt;7 gün), sağlıklı erkek ve dişi sinekler (20-40) 2-3 gün taze döşeme tencere korumak. Döşeme tencere sık delikli 60 mm agar plaka kapsayan yeterli hava dolaşımı sağlamak için 100 ml plastik bardak (Tri-Pour) oluşur. Agar plakaları, elma veya agar ile sertleştirilmiş üzüm suyu içeriyor. Çeşitli tarifler vardır, ama aşağıdaki gibi bir örnek: 700 ml su, 25-30 gram agar, 300 ml meyve suyu konsantresi (üzüm veya elma), 0.5g metil paraben (p-hydroxymethylbenzoate), ve 30g şeker. Su ve agar Otoklav ve ayrı olarak, şeker ve suyu ile p-hydroxymethylbenzoate kaynatın. Agar ve meyve suyu çözümleri Mix ve hızlı kabarcıkları kaldırarak, 60 mm plakalar dökün. </li><li> Yumurta toplama öncesinde, en az iki gün boyunca günde en az iki kez taze plakalar üzerinde maya yapıştırın (7 gram ekmek mayası, 4 ° C&#39;de depolanan su 9 ml), sinekler ile beslenir. 3 gün, iyi bir pot saatte 100-200 yumurta üretmek gerekir. Daha iyi yumurtlama çizik plaka agar ile yan tutulan bir pot görülmektedir. Birçok embriyolar atılmıştır veya çizik yanında olacak. </li><li> Çok sayıda embriyo toplamak için, bir fırça kullanarak bir sepet içine yavaşça agar plaka embriyolar transfer. 15 veya 50 ml santrifüj tüp ile bir sepet yapılabilir. Kapak ve tüp üst (70 mikron mesh) arasında bir ekran yakalamak için yeterli yüzey alanını terk alt kesti. DH 2 0 embriyolar durulayın ve dış koryon kaldırmak için taze% 50 -% 100 ağartıcı bir Petri kabı koymak . Alternatif olarak, yumurta ince forseps kullanarak tek tek toplanır ve bir damla çamaşır suyu içine onları el koyarak dechorionated olabilir. De-chorionation 2 dakika 30 saniye (taze çamaşır suyu çok daha hızlı) alabilir ve diseksiyon mikroskobu altında izlenmelidir. Koryon kaldırılması, parlak, şeffaf vitellin membran ortaya çıkarır. Çamaşır suyu hızla devitellinized dokuları tahrip olarak Dechorionated yumurta kısaca durulanır, ya da tuzlu su yerleştirilmiş olmalıdır. </li><li> Dikkatli bir şekilde istenen gelişimsel yaş embriyo aşamasında kritik öneme sahiptir. Tanımlanan Drosophila embriyonik aşamalarında tüm fonksiyonel nöromüsküler gelişme (1-17; Campos-Ortega ve Hartenstein, 1985) geç dönem 16 veya 17 sahne oluştuğunda, yararlı değildir. Bu nedenle, embriyoların gelişim saat 25 sahnelenen ° C nemlendirilmiş bir inkübatör, gübreleme veya saat sonra, daha yaygın, yumurtlama (AEL). Bu koşullar altında, embriyogenez 21 sürer + / - 1 saat 25 ° C </li><li> Zamanlanmış bir yumurta yatıyordu (Yumurta 1-2 saatler) uygun yaş sonraki morfolojik kriterlerinin de izlenebilir. DH 2 O geniş yıkadıktan sonra, dechorionated yumurta görüntülemek için plastik bir kültür çanak (dH 2 O altında) yerleştirilir. Doğru evreleme bir diseksiyon mikroskobu (Campos-Ortega ve Hartenstein, 1985) ile yansıyan ışık kullanılarak morfolojik kriterlere göre teyit edilebilir. Manikür ve şişirilmiş trakea segmentasyonu kuluçka eşiğinde Olgun geç dönem embriyoların (22-24 AEL) genellikle kabul edilmektedir. Embriyolar GFP dengeleyici ve uygun filtreler ile floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak genotip olabilir. </li><li> Diseksiyon için dechorionated ve gelişimsel sahnelenen embriyolar serum fizyolojik damla (adım 1.5 &#39;e bakınız) altında bir lamel (yukarı sırt tarafı) bağlı. Embriyolar bir cam mikropipet veya tungsten iğne ile ön veya arka sonuna yakın membran delinmesiyle ve yavaşça membran embriyo kurtararak vitellin zarı kaldırılır. Diseksiyon için hazırlanmasında, embriyonun dorsal yüzeyi (diseksiyon ventral sinir sistemi ve deneyler için neuromusculature gösterecektir kadar Dorsal yan lamel yerleştirilmiş olmalıdır. Ancak, embriyo tabii ki diğer erişimini kolaylaştırmak için diğer şekillerde yerleştirilmiş olabilir dokular.) </li><li> Erken evre (&lt;16 saat AEL) embriyolar polylysine (Broadie ve Bate, 1993a, b poli-L-lisin hidrobromid) ile kaplı cam veya cam temizlemek için doğrudan takın. Kütikül oluşumunu takip Yaşlı embriyolar (&gt; 16 saat AEL), ideal Sylgard kaplı (Dow Corning) lamelleri, yapıştırılmış olmalıdır. Bir su polimerize siyanoakrilat cerrahi veya veterinerlik tutkal (Broadie ve Bate, 1993c, d) kullanılır. Yapıştırıcı, tutkal akışı ile ağız basıncı ile kontrol edilen bir lastik tüpüne bağlı küçük bir cam elektrot pipet (10-20 mikrometre iç çapı ucu) ile teslim edilir. Tutkal serum fizyolojik ile iletişime üzerine hızla polimerize olarak Bakımı, tutkal teslimat sırasında alınmalıdır. Bu yapıştırma, tutkal kalsiyum iyonları polimerize gerektirir, tuzlu su veya düşük kalsiyum iyon yoğunluğunun içinde yapılan olamaz unutmayın. Küçük miktarda tutkal ilk baş ve kuyruk sıkıca bağlamak için kullanılır. </li><li> Embriyo biter lamel yapıştırılmış sonra, bilenmiş bir cam elektrot veya tungsten iğne ile dorsal orta hat boyunca bir kesi yapılır. Bu hafifçe final cut yapmadan önce kesi hattı perforan tarafından daha kolay yapılır. Daha sonra kesi kenarları hafifçe embriyo düz yaymak için, daha fazla yapıştırıcı ile lamel bağlıdırlar. Bağırsak, yağ organları ve isteğe bağlı olarak, trakea sonra lastik borular (Broadie Bate 1993a-c) bağlı bir cam pipet kullanarak emme tarafından kaldırılır de dahil olmak üzere iç organlar. Embriyo artık ventral merkezi sinir sistemi ile epidermisin aşağı, periferik sinirler, lamel için düz bağlı ve somatik kas deneyler için açık olmalıdır. </li></ol>

Embriyo kesin evreleme nedeniyle fonksiyonel özellikleri, sadece birkaç saat zaman boyunca hızlı bir şekilde olgunlaşması için çok önemlidir. Çeşitli konularda bu evreleme zorlaştırıyor. İlk olarak, pek çok araştırmacı dönem embriyoların zaman yumurta bırakır, ancak yumurtlama zamanı farklı koşullar (Broadie ve ark 1992), hayvandan hayvana çok değişebilir. Özellikle kısıtlı bir diyet, kadın, uzun süre önce döşeme döllenmiş yumurta korumak eğilimindedir. Bu nedenle en az 2 gün önce zengin bir maya diyet beslenme yumurta ...

<table><tbody><tr><td>Embriyo Toplama Kafesleri</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 (60 mm kap için; diğer boyutlar mevcuttur)</td><td>Kafesler, videoda gösterildiği gibi delikli üç ayaklı beherler kullanılarak ev yapımı şeklinde de hazırlanabilir</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>Çeşitli firmalardan temin edilebilir</td><td>Cerrahi yapıştırıcı, sylgard kaplı lamellere daha iyi yapışır</td></tr><tr><td>İnce cam boru, dış çap 1,0-1,5 mm</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Diseksiyon için ince cam iğneler ve yapıştırıcı iletimi için tüpler çekmek amacıyla kullanılır</td></tr><tr><td>Ağızla vakumlama ve yapıştırıcı uygulaması için cam pipete takılacak plastik boru</td><td>Tygon</td><td></td><td>Boru iç çapının, cam dış çapı ile uyumlu olması gerekir.</td></tr></tbody></table>

hasat ve hazırlanması drosophila</emelektrofizyolojik kayıt ve diğer İşlemler> embriyolar

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila, embriyonik gelişim ve fonksiyonel nörobilim çalışma için önde gelen genetik bir model . Geleneksel olarak, bu alanlar, büyük ölçüde bağımsız geçmişleri ve bilimsel topluluklar ile, birbirinden tamamen izole edilir. Ancak, bunlar genellikle birbirinden farklı alanlar arasında arayüz fonksiyonel elektriksel sinyal özellikleri ve nöral devre oluşumu son aşamalarında fonksiyonel kimyasal sinaps farklılaşma edinimi temel gelişim programları. Bu arayüz, soruşturma için son derece önemli bir alandır. Drosophila, fonksiyonel gelişimi bu aşamalarda son embriyogenez üçüncü sırasında &lt;8 saatlik bir süre (25 ° C) sırasında oluşur. Bu geç gelişim döneminde uzun, sert, geçirimsiz epidermal manikür birikimine soruşturma nedeniyle dirençli kabul edildi. Bir atılım önceden yerel kontrollü geç evre embriyo diseksiyonu etkinleştirmek için manikür uygulanabilir, su polimerize cerrahi yapıştırıcı uygulama oldu. Dorsal longitudinal insizyon ile deneysel olarak incelenmesi için embriyonun ventral sinir kablosu ve vücut duvarı kas açığa, düz belirtilen olabilir. Bu sistem, ağır embriyonik sinaps oluşumunu bozar ve dolayısıyla sinaps bağlantıları ve fonksiyonel sinaptik sinyalizasyon özellikleri şartname ve farklılaşmasını düzenleyen moleküler mekanizmaları ortaya genetik mutantları ve karakterize etmek için kullanılmaktadır.

Bu teknik immünohistokimya veya elektrofizyolojik kayıt için Drosophila embriyonik neuromusculature ortaya çıkarır. Nöromüsküler gelişiminde erken olayları okuyan veya yumurtadan değil mutantlar elektrofizyoloji yapmak için yararlıdır.

Hasat ve hazırlanması Drosophila</emElektrofizyolojik Kayıt ve Diğer İşlemler> Embriyolar

Drosophila, hem embriyonik gelişim hem de fonksiyonel nörobilim çalışmaları için önde gelen bir genetik modeldir. Geleneksel olarak, bu alanlar oldukça...

Drosophila embriyolarında elektrofizyolojik kayıtlar gerçekleştirmek için, embriyoların öncelikle toplanması, koordine edilmesi ve diseksiyonunun yapılması gerekir; kontrollü diseksiyon, embriyoları lamlara sabitleyen ve suyla polimerize olan cerrahi yapıştırıcı sayesinde mümkün kılınır. Ardından, ventral MSS'yi, periferik sinirleri ve somatik kas sistemini açığa çıkarmak için sabitlenmiş embriyolardan iç organlar çıkarılır. Merhaba, ben University of Illinois at Chicago Biyolojik Bilimler Bölümü'nden Dave Featherstone.Merhaba, ben Chicago'daki Illinois Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nde bulunan Dave Featherstone Laboratuvarı'ndan Ton. Bugün size Joof'un geç evre embriyolarının nasıl toplandığını ve manuel olarak nasıl diseke edildiğini göstereceğiz. Bu prosedürü, gelecek bir Jo Ova sunumunda size göstereceğim joof nöromüsküler sistem gelişiminin ve fonksiyonunun elektro alternatif testlerine hazırlanmak için genel laboratuvar çalışması olarak kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Bu protokol, birçok joof deneyinde kullanılan yaygın bir prosedür olan embriyo toplama ile başlar; şimdi bunu inceleyeceğiz. Bir yumurtlama kabında 20 ila 40 genç erkek ve dişi sinekten oluşan bir karışım

harvesting-preparing-drosophila-embryos-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video midgastrula evre Drosophila embriyolar primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme kaplama 2 gün sonra bir bikarbonat tabanlı tanımlı bir ortamda büyüme ve farklı nöronlar sonra hücreler 1 saat gösteriyor. Nöronların elektriksel olarak uyarılabilen ve sinaptik bağlantıları formu.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

Drosophila embriyolar canlı görüntüleme analizi hazırlama, basit, ucuz ve etkili bir yöntem sunulmuştur. Bizim protokol nem ve gaz değişimi sağlar ve Drosophila embriyo sıkıştırmak değil. Bu yöntem, GFP tabanlı bir stereomikroskopta ya da dik bileşik mikroskop kullanarak Drosophila embriyoların canlı görüntüleme için uygundur.

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Biz fiksasyon, gömme, kesit, bir süreç tarif etmek, ve geç dönem...

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Bu protokolün amacı , orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması ve afinite saflaştırması-kütle spektrometresi (AP-MS) gibi protein proteini uygulamalarında kullanılabilen protein ekstraktlarının hazırlanması için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlamaktır ).

Orta Ölçekli Hazırlanışı<em&gt; Drosophila</em&gt; Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri

Bu eser bir protokolünü açıklar yüksek çözünürlüklü in situ Hi-C kitaplıklardan nesil sıkıca öncesi gastrulasyon Drosophila melanogaster sahnelenen için embriyo.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Aktomiyosin kontraktilitesi hücre ve doku morfogenezinde önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, aktomiyosin kontraktilitesini in vivo akut olarak manipüle etmek zordur. Bu protokol, Drosophila embriyolarında Rho1 aracılı aktomiyosin kontraktilitesini hızla inhibe eden ve aktomiyozinin in vivo inaktivasyonundan sonra epitel gerginliğinin ani kaybını ortaya çıkaran bir optogenetik sistemi tanımlar.

Drosophila Embriyolarında Epitelyal Gerginliğin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu

Öğrenin Drosophila embriyolarının hasat ve diseksiyonunu, elektrofizyolojik kayıt için. Bu yöntem, nöromusküler gelişimi ve kuluçka yapamayan mutantları incelemeye olanak tanır.

Hasat ve hazırlanması Drosophila Embriyolar

Daha fazla video keşfet