Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Kas ve motor nöronlardan elektrofizyolojik kayıtlar, uygun şekilde hazırlanmış bir oph embriyo vücut duvarından elde edilebilir. 6, 7, 12 veya 13 numaralı kaslar, tüm hücre kayıt konfigürasyonundan kolayca kaydedilebilir ve nöromüsküler kavşaktan kayıt yapmak için bir giga ohm contası elde edildikten sonra sağlam minyatür genlik akımları ölçülebilir. Bir emme elektrodu, CNS çıkış noktasının yakınında bir motor sinir çekmek ve post-sinaptik kasta tüm hücre akımları ölçülürken pre-sinaptik stimülasyon sağlamak için kullanılabilir.

Alternatif olarak, iyontoforez veya basınç ejeksiyonu yoluyla kayıt elektrodunun yakınında uyarıcı nörotransmiterler vermek için bir pipet kullanılabilir. Merhaba, ben Chicago'daki Illinois Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'ndeki Dave Laboratuvarı'ndan Ton. Bugün size salat aşamasını, embriyonik nöro misk kavşağını ve merkezi nöronları elektrofizyolojik olarak kaydedeceğim.

Bu prosedürleri joof nöromüsküler sisteminin işlevini ve gelişimini incelemek için kullanıyoruz. Bu teknikler ilk olarak Kendall Brody tarafından geliştirilmiştir. David Fit Stone'a geçin ve sonra bugün bana ileteceğim.

Bu prosedür, embriyoların önceden uygun şekilde toplanmasını ve incelenmesini gerektirir Bunun nasıl başarıldığını görmek için, Brody Featherstone ve Chen Electrophysiological'ın eşlik eden Jo'suna bakın. Jossa embriyonik kaslarından ve nöronlarından alınan kayıtlar, standart tam hücre yaması sıkıştırma tekniklerini kullanır. İlk olarak, diseke edilen embriyo küçük bir pleksiglas kayıt odasına yerleştirilir.

Fizyoloji kayıt alanı, bir Faraday kafesi tarafından elektriksel olarak nemlendirilir ve titreşimle nemlendirilmiş bir masaya yerleştirilir. Oda, KY optikli dik bir bileşik mikroskop ve 40 x uzun çalışma mesafesi suya daldırma kullanılarak iletilen ışık altında görüntülenir. Objektif kayıtlar tipik olarak oda sıcaklığının altında yapılır, çünkü sıcaklıklar arttıkça kelepçe oph kaslarını yamalamak giderek zorlaşır.

Kayıt elektrodu, beş ila 10 mega ohm'luk bir nihai dirence sahip olmalı ve yaklaşık bir mikrometre iç çapa kadar ısıyla parlatılmalıdır. Uçta, kayıt elektrotları potasyum klorür ve sükroz içeren fizyolojik bir çözelti ile geri doldurulur. Embriyo diseksiyonunda da kullanılan standart salin içeren banyoya bir klorür gümüş topraklama teli yerleştirilir.

Sinyaller, daha sonra analiz edilmek üzere filtrelenen ve dijital olarak saklanan bir yama kelepçesi amplifikatörü kullanılarak yükseltilir. Bu ekipman ve axon yazılımı gibi yama kelepçesi deneyleri için uygun herhangi bir sistem kullanılabilir. Aletler: Embriyonik sinir sistemindeki üç farklı dokudan alınan hücreler artık NMJ'deki kas nöronlarından ve merkezi motor nöronlardan uyarılabilir ve kaydedilebilir.

Bu embriyo hazırlığı ile, çoğu deneyden herhangi bir embriyonik kas kaydedilebilir. Dört uzunlamasına ventral kas 6, 7, 12 ve 13 grubuna, özellikle ön karın bölgesindeki altıncı kasa, dorsal kaslardan kaydetmek için iki ila üçe odaklanın. Genç embriyolarda embriyo yapıştırılmalı, sırt tarafı aşağı bakacak şekilde ventral orta hat boyunca diseke edilmelidir.

Kas kaydından önce enzimatik tedaviye gerek yoktur. Bununla birlikte, gelişmiş kütikülleri olan daha sonraki embriyolarda, yama kaydından önce bir kas kılıfı da gelişir. Bu kılıf, bir kollajenaz içine kısa bir süre daldırılarak çıkarılmalıdır.

Kayıtların çoğu, hafif bir emme veya elektriksel bir vızıltı ile hücreye bağlı durumdan kolayca elde edilen tüm hücre kayıt konfigürasyonunda yapılır. Bu bir zap. Bildiğiniz gibi, hücre zarı kesiklerini yırtmak için bir elektro stimülasyondur.

Bütün hücre ayarı: Kas üzerindeki conta dirençleri tipik olarak bir giga ohm'dan daha büyüktür, tam hücre akımları genellikle conta oluşum serisinden üç dakikadan daha kısa bir süre sonra elde edilir. Çoğu durumda direnç belirgin şekilde artar ve hücrelerde artan bir sızıntı gelişebilir. Yama klempleme için mevcut olan, embriyoların daha erken gelişim aşamalarında en az 14 saatlik olması gerekir.

Myo tüpleri arasındaki geniş elektriksel bağlantı, kas liflerinin yama kelepçesi kayıtlarını yapmak için voltaj sıkıştırmasını yanlış hale getirecektir. Tipik tutma potansiyelleri negatif 60 ila negatif 80 milivolttur ve voltaj kelepçesi ve akım kelepçesi yöntemleri kullanılabilir. Negatif 60 milivoltluk başarılı tüm hücre kayıtlarına, burada gösterilenler gibi birkaç ila birkaç yüz pikoamper arasında değişen sağlam spontan sinaptik akımlar eşlik eder.

Motor sinirin emme elektrotları ile uyarılmasıyla büyük NMJ akımları uyarılabilir. Bunlar, çeşitli elyaf dolgulu cam elektrotlardan çekilebilir ve istenen konfigürasyonu elde etmek için ateşle parlatılmalıdır, pipet üzerinde hafif emme kullanılarak, CNS çıkış noktasına yakın uygun segmental motor sinirin küçük bir segmentinde çekilmelidir. Sıkı bir sızdırmazlık oluşturmak için, kısa stimülasyon, deneysel olarak belirlenmiş bir yoğunlukla en iyi sonucu verir, genellikle bir ila beş volt arasında. Güvenilir stimülasyon, uyaran gücünün deneysel olarak belirlenen eşiğin bir ila iki volt üzerine ayarlanmasıyla elde edilir.

Sinaptik sonrası NMJ glutamat reseptörleri, nörotransmitter uygulanarak aktive edilebilir, glutamat gibi yüklü moleküller iyontoforez kullanılarak NMJ'ye iletilebilir. Reseptörleri haritalamak için yüksek dirençli pipetler kullanılır ve toplam glutamat reseptör yanıtını tahmin etmek için daha düşük dirençli pipetler kullanılır. İyonofor pipetlerine 100 milimolar L glutamat çözeltisi yüklenir.

L glutamatı serbest bırakmak için, sızıntıyı önlemek için küçük bir pozitif destek akımı ile kısa bir negatif akım darbesi kullanın, glutamat veya herhangi bir yüksüz molekül de basınç ejeksiyonu kullanılarak NMJ'ye iletilebilir. Basınç tahliyesi için bir ila iki milimolar glutamat kullanın ve pipete beş ila 10 PSI dışa doğru kuvvet uygulayın. Bir pico spritzer kullanarak.

Negatif 60 milivoltta sinir stimülasyonu veya glutamat uygulaması ile uyarılan NMJ para birimi tipik olarak 1500 ila 2000 piko amperdir. Birçok embriyonik nöron, soma pozisyonuna ve projeksiyon morfolojisine dayalı olarak ayrı ayrı tanımlanabilir. Deneysel kayıtların çoğu, embriyonik ventral sinir kordonu içindeki beş yüzeysel dorsal nörondan oluşan bir grup üzerinde yoğunlaşmıştır.

Bu nöronlardan kayıt yapmak için, ventral sinir kordonu nöroma kılıfı proteaz ile kısa bir fokal tedavi ile çıkarılmalıdır, hücre gövdeleri, büyük çaplı bir yama pipeti kullanılarak kayıtta %0.5 ila %1 proteaz verilerek kılıf haline getirilir, kılıf malzemesini proteaz içeren pipete emdirir. Kılıfı pipetin içine ve dışına tekrar tekrar tekrarlamak için nazik ağız hareketi kullanılabilir. Bir ila iki dakika sonra kılıf yırtılacaktır.

Hücreler şimdi tüm hücre yaması klemplemesi için açığa çıkar. Bu kayıt paradigması, salinin sirküle edilmesini veya ısıtılmasını gerektirmez. Bu preparattaki harici kayıt salini, kaslardan kayıtta kullanılandan farklıdır.

Yama pipeti, daha sonra yama hücresinin konumunu ve morfolojisini görselleştirmek için Lucifer sarısı ile yüklenebilir. İşte Lucifer sarısı ile alınmış ve floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenen merkezi bir motor nöron. Tüm hücre voltajı kelepçe kayıtları, 18 santigrat derecede negatif 60 milivolt tutma potansiyellerinde yapılır.

Mevcut kelepçe kayıtları da mümkündür. Nöronlar, nörotransmiterler, asetilkolin veya gaba ile uyarılabilir. Bunlar, njs'den kayıt yapılırken olduğu gibi iyontoforez veya basınç ejeksiyonu kullanılarak hücre somasına uygulanır.

Bütün bir hücre bağlantısı kurulduktan sonra, ilk olarak spontan akımlar gözlenir. Bu, stimülasyon yokluğunda negatif 60 milivoltta kenetlenmiş embriyonik ventral uzunlamasına kas altı yamasından elde edilen bir dakikalık ham veridir. Sağlıklı bir preparat tipik olarak, burada birçok aşağı doğru akım sapması ile temsil edilen sağlam spontan sinaptik aktivite gösterir.

İşte aynı kastan elde edilen veriler ve o kasa giden motor sinir üzerinde bir emme pipeti kullanılarak uygulanan stimülasyon. Bu, uyarılmış bağlantı akımlarını veya e jc'leri temsil eden akımın birden fazla aşağı doğru sapmasına neden oldu. Bu, basınç ejeksiyonu kullanılarak uygulanan bir milimolar glutamat tarafından uyarılan aynı kastan elde edilen verilerdir.

Glutamat, aşağı doğru büyük sapmalara yol açan reseptörleri açar. Mevcut durumda, iki sonraki glutamat uygulamasını temsil eden iki iz gösterilmiştir. Az önce size, burada herhangi bir derinlikte açıklayamadığımız, genellikle standart yama avlama tekniklerini kullanarak, geç evre geo yumuşak embriyoların elektro teolojik kaydından nasıl elektro teolojik kayıt yapılacağını gösterdim.

İdeal olarak, yumuşatıcı embriyolarınızdan kayıt yapmak isteyen herkes, daha kolay bir hazırlık kullanarak yama kampanyasını zaten öğrenmiş olacaktır. Bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deney dakikalarınızda iyi şanslar.