Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama
14 Ağustos 2009
Coomassie Brillant Blue (CBB) poliakrilamid jeller G-250 ile protein boyanması için kısa bir protokol CBB ile klasik boyama işlemleri gibi organik çözücüler veya asetik asit kullanmadan açıklanmıştır.
Bu prosedüre başlamak için, Kumasi Brilliant Blue veya CBG two 50, iki ila dört saat boyunca karıştırılarak bir litre bi-distile su içerisinde çözülür. Daha sonra koyu mavi çözeltiye, bir dakika daha karıştırma işlemiyle hidroklorik asit eklenir ve çözelti ileride kullanılmak üzere karanlıkta saklanır. Protein numune hazırlama ve STS page işlemlerinin ardından, jel kaseti sökülür ve jel, bi-distile su ile gerçekleştirilecek üç ardışık yıkama adımı için bir kutuya yerleştirilir.
Üçüncü yıkama adımından sonra, su, kutudaki jeli kaplayacak kadar CBB boyama çözeltisi ile değiştirilir. Kutu mikrodalga fırında 10 saniye ısıtılır ve ardından jel bulunan kutu bir çalkalayıcıya yerleştirilir. Boyamanın tamamlanması için protein bantları bir dakika sonra gözlemlenebilir.
Merhaba, ben Heidelberg'deki Emblein protein ekspresyon ve saflaştırma tesisinden Amri Lawrence. Bugün size klorür jellerinde Coomassie Brilliant Blue G-250 ile protein boyama protokolünü göstereceğiz. Klasik boyama yöntemlerinin aksine, protokolümüzde herhangi bir organik çözücü veya asetik asit kullanılmamaktadır.
Bu protokolü, her saflaştırma adımından sonra proteinlerimizi analiz etmek için kullanıyoruz. O halde başlayalım. CBB boyama çözeltisini hazırlamak için, 60 ila 80 mg CBB, bir litre çift distile su içerisinde iki ila dört saat boyunca karıştırılarak çözülür.
CBV çözüldükten sonra çözeltiyi bir çeker ocaka aktarın. Çeker ocakta, koyu mavi çözeltiye dikkatlice üç mililitre konsantre hidroklorik asit ekleyin. Nihai çözeltinin pH değeri iki olacağından, bir dakika boyunca karıştırırken eldiven kullanılmalıdır.
Çözelti hazırlandığında, daha sonra kullanılmak üzere karanlıkta saklanır. Çözelti, boyama etkinliğini kaybetmeden haftalarca veya birkaç aya kadar saklanabilir. Protein örneklerini SDS-PAGE için hazırlamak amacıyla, uygun miktarlardaki protein örnekleri, son konsantrasyonu 1x yüklleme tamponu olacak şekilde yüklleme tamponu ile karıştırılır; protein örnekleri yüklenmeden önce yaklaşık beş dakika boyunca ısıtılır.
Numuneler ısıtılırken, jel elektroforez hücresi çalıştırma işlemi için hazırlanır. Çalıştırma tamponu olarak MES tamponu içeren bir mini hücrede hazır dökümlü jeller kullanıyoruz. Bununla birlikte, başka herhangi bir jel ve elektroforez sistemi de kullanılabilir.
Isıtılmış protein örnekleri daha sonra jele yüklenir ve 220 voltajda 50 dakika boyunca elektroforez işlemine tabi tutulur. SDS-PAGE tamamlandığında, jel kaseti sökülür ve jel, 100 mililitre çift distile su içeren bir kutuya yerleştirilir. Sonraki yıkama adımları için kutu, mikrodalga fırında 30 saniye boyunca ısıtılır.
Kaynama meydana gelmeden önce ısıtma işlemi durdurulmalıdır. Jel içeren kutu, bir çalkalayıcı üzerinde üç ila beş dakika boyunca mikrodalgada ısıtıldıktan sonra, bu yıkama adımı taze su ile iki kez daha tekrarlanır. Su ile yapılan üç yıkamanın ardından, kutudaki jeli kaplayacak şekilde CBB hazır çözeltisi eklenir ve kutu, kaynatılmadan 10 saniye boyunca mikrodalgada ısıtılır.
Ardından, jelin bulunduğu kutu, boyamanın tamamlanması için bir çalkalayıcıya yerleştirilir. Protein bantları bir dakika sonra ve 15 ila 30 dakika sonra gözlemlenebilir. Boyama genellikle yeterince güçlüdür.
Boyama çözeltisi dökülür ve 50 ila 100 mililitre çift distile su eklenir. Bir çalkalayıcı üzerinde jelin açık mavi arka planını daha fazla gidermek için, boya giderme işlemine devam etmek amacıyla su taze su ile değiştirilebilir. Gerekirse jel şu anda taranabilir, fotoğraflanabilir veya uzun süreli saklama için kurutulabilir.
Bu prosedür takip edilerek boyanmış bir jel şu şekilde görünmelidir. Bu jelde, protein bantları iyi boyanmış ve net bir şekilde görünür durumdadır. Arka plan ise ihmal edilebilir düzeydedir.
Yıldızla belirtilen ilk şerit moleküler ağırlık markerlarını içerir. Buna karşılık, boyama öncesinde yeterince yıkanmamış bir jel şu şekilde görünecektir: Bu jelde yıkama adımları çok kısa tutulduğu için protein bantları yeterince iyi boyanmamıştır. Yıldızla belirtilen şeridin, önceki bir jelle aynı miktarda moleküler ağırlık markerı içerdiğine ancak daha az verimli bir boyama gösterdiğine dikkat ediniz.
Toksik veya yanıcı organik çözücüler kullanmak zorunda kalmadan, poliakrilamid jellerdeki proteinlerin Coomassie Brilliant Blue ile nasıl boyanacağını göstermiş olduk. Bu prosedürü gerçekleştirirken, yıkama basamaklarının proteinlerin verimli bir şekilde boyanması için kritik olduğunu hatırlamak önemlidir. İşte bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, poliakrilamid jellerde organik çözücüler veya asetik asit kullanmadan Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 ile protein boyama için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem, elektroforez sonrası protein bantlarının görüntülenmesi için basit bir yaklaşım sunar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Protein Analizi
- Elektroforez Teknikleri
Arka Plan
- Coomassie Brilliant Blue, protein boyama için yaygın olarak kullanılan bir boyadır.
- Geleneksel boyama yöntemleri genellikle organik çözücüler ve asetik asit içerir.
- Bu protokol, boyama işlemini basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
- Protein görselleştirme, çeşitli biyokimyasal analizler için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Protein boyama için basitleştirilmiş bir protokol sağlamak.
- Boyama sürecinde zararlı çözücülerin kullanımını ortadan kaldırmak.
- Protein analizinde araştırmacıların erişilebilirliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Coomassie Brilliant Blue'nin çift distile su içerisinde çözülmesi.
- Çözeltiye hidroklorik asit eklenmesi.
- Jelin çift distile su ile yıkanması.
- Jelin CBB çözeltisi ile boyanması ve mikrodalga fırında ısıtılması.
Temel Sonuçlar
- Protein bantları, bir dakikalık boyama işleminden sonra gözlemlenebilir.
- Yöntem, proteinlerin net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.
- Boyama işlemi, organik çözücü kullanımına gerek kalmadan etkilidir.
- Protokol basit ve tekrarlanabilirdir.
Sonuçlar
- Bu protokol, protein boyama için daha güvenli bir alternatif sunar.
- Etkili sonuçları korurken süreci basitleştirir.
- Araştırmacılar bu yöntemi, protein analizindeki çeşitli uygulamalar için kullanabilirler.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu çözücü içermeyen Coomassie boyama yöntemi, toksik organik çözücüleri ve asetik asidi ortadan kaldırarak protein analizindeki güvenliği ve iş akışı verimliliğini artırır. SDS-PAGE sonrası protein bantlarının hızlı ve tekrarlanabilir şekilde görüntülenmesini sağlayarak, protein saflaştırma süreçlerindeki rutin kalite kontrolünü destekler. Bu yaklaşım, sonraki analitik iş akışlarıyla uyumluluğu korurken laboratuvar risklerini azaltır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Her saflaştırma adımından sonra protein saflığının ve veriminin güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlayarak, tutarlı protein karakterizasyonu yoluyla hedef doğrulamasını destekler.
- Operasyonel Değer: Özel havalandırma veya tehlikeli atık yönetimi gerektirmeden standart saflaştırma iş akışlarına entegre olan hızlı ve çözücü içermeyen bir boyama prosedürü sunar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Saflaştırma koşulları veya numune varyantları arasında karşılaştırmalı analize uygun, nicelendirilebilir protein bandı yoğunluğu verileri üretir.
- Operasyonel Değer: Boyamanın 15-30 dakika içinde tamamlanmasını hızlandırmak için mikrodalga destekli ısıtma kullanarak, yüksek frekanslı numune değerlendirmeleri için işlem kapasitesini artırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Proses geliştirme sırasında protein ekspresyon profillerinin boylamsal takibini destekleyerek laboratuvar ölçeği ile ölçeklendirilmiş üretim arasında tutarlılık sağlar.
- Operasyonel Değer: Metanol, etanol veya asetik asit buharlarına maruz kalmayı ortadan kaldırarak, çözücü kullanımının kısıtlandığı düzenlemeye tabi ortamlarda iş yeri güvenliğini artırır.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, protein saflaştırma sürecinin bir parçasıdır; özellikle sık protein kalite kontrollerinin gerektiği erken keşif ve süreç geliştirme aşamalarında, SDS-PAGE sonrası analizleri desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Kromatografik adımların ardından protein varlığının ve bağıl bolluğunun hızlıca doğrulanmasını sağlayarak fraksiyon seçimine ve havuzlama kararlarına yardımcı olur.
- Tarama: Farklı lizis, bağlanma veya elüsyon koşulları genelinde protein geri kazanımının karşılaştırılmasına olanak tanıyan tekrarlanabilir boyama sonuçları sunar.
- Analitik: Kayıt tutma ve parti karşılaştırması için görüntüleme yoluyla belgelenebilen kararlı protein bant sinyalleri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Standartlaştırılmış, çözücü içermeyen bir görselleştirme yöntemi sağlayarak teknoloji transferi sırasında tutarlılık kontrollerini kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yalnızca standart laboratuvar ekipmanları (mikrodalga, çalkalayıcı, su banyosu) ve reaktifler gerektirerek, yeniden validasyona gerek kalmaksızın farklı ekipler ve merkezler arasında geniş çaplı benimsenmeyi mümkün kılar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Minimum arka plan ile net ve spesifik protein bandı görselleştirmesi sağlayarak saflık değerlendirmelerindeki güvenilirliği artırır.
- Operasyonel Değer: Solvent kullanımı, çeker ocak gereksinimleri ve tehlikeli atık oluşumunu ortadan kaldırarak işlem süresini ve güvenlik yükünü azaltır.
- Stratejik Değer: Her adımdan sonra anında geri bildirim alınmasını sağlayarak protein saflaştırma optimizasyonunda daha hızlı iterasyona destek olur.
- Portföy Etkisi: Rutin kalite izleme için güvenilir ve erişilebilir bir yöntem sunarak protein üretim süreçlerindeki teknik riski düşürür.
Uygulama Hususları
- SDS-PAGE jel kullanımı ve protein örnek hazırlama konusunda temel yetkinlik.
- Çözelti ısıtma ve karıştırma işlemleri için mikrodalga fırın ve orbital çalkalayıcı erişimi.
- Kısa süreli mikrodalga ısıtmasına dayanıklı standart laboratuvar cam malzemeleri veya plastik kaplar.
- Kontaminasyonu veya arka plan gürültüsünü önlemek için yıkama ve boyama basamaklarında sürekli olarak çift distile su kullanımı.
- Boyama verimliliğini ve pH stabilitesini korumak için önerilen CBB G-250 konsantrasyonuna (60-80 mg/L) ve HCl hacmine (litre başına 3 mL derişik) uyum.
