Name: Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Öğrenin, poliakrilamid jellerde Coomassie G-250 ile protein boyama yöntemini. Organik solvent ve asetik asit kullanmadan, bir dakikada net protein bantları elde edin. Bu güvenli protokol, biyokimyasal analizler için hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ines Racké teknik yardım kabul etmek istiyorum.

Bölüm 1: CBB boyama çözüm Hazırlık <ol><li> 60-80 mg CBB, G-250, 2-4 saat süreyle karıştırılarak 1 litre bidistile su içerisinde çözülür. Son olarak, bir dakika karıştırarak 3 ml konsantre HCl ile koyu mavi bir çözüm eklenir ve karanlıkta daha sonra kullanılmak üzere depolanır. Çözüm boyama verimliliği kaybetmeden birkaç ay hafta kadar saklanabilir. </li><li> Konsantre HCl olağan bakım ve davlumbaz altında ele alınmalıdır. Nihai çözüm pH yaklaşık 2 eldiven kullanılmalıdır olmalı ve herhangi bir cilt ile temasından kaçınılmalıdır. </li></ol> Bölüm 2: SDS-PAGE <ol><li> Protein örneklerinin uygun alikotları 1x yükleme tamponu nihai konsantrasyonu tampon yükleme ile karıştırılır. Biz Tris/H3PO4 125mm (25 ° C&#39;de pH 7.5), 2mm EDTA,% 4 SDS, 200mm DTT,% 0.02 Bromophenol Mavi ve% 50 gliserol ile 2x yükleme tamponu kullanın. SDS-PAGE Diğer yükleme tamponlar da kullanılabilir. </li><li> Protein örnekleri yüklemeden önce yaklaşık 5 dakika süreyle ısıtılır. Bu arada, jel elektroforezi odası çalıştırmak için hazırlanmıştır. Biz bir XCell SureLock © Bis-Tris jeller (Invitrogen) ® MES-tampon Mini-Cell (Invitrogen) yanı sıra çalışan tampon ancak başka herhangi bir jel elektroforez sistemi kullanılabilir prekast 4-12% NuPAGE kullanın. </li><li> Protein örnekleri 220V az 50 dakika süreyle çalıştırın jel ve elektroforez yüklenir. </li></ol> Bölüm 3: jel boyanması <ol><li> Jel kaset demonte ve jel, çamaşır sonraki adımlar için bir kutu yerleştirilir. </li><li> Bidistile su yaklaşık 100 ml jel eklenir ve 30 saniye süreyle mikrodalga fırında ısıtılır. Kaynama meydana gelmeden önce Isıtma kesilmelidir. Kutu jel ile 3-5 dakika sonra bir çalkalayıcı yerleştirilir. ve bu yıkama adım temiz su ile iki kez tekrarlanır. </li><li> Yeter CBB boyama çözüm kutuya jel ve 10 saniye süreyle mikrodalga fırında ısıtılır kutu kapsayacak şekilde eklenir. kaynama olmadan. Jel ile kutu boyama bitirdikten sonra bir çalkalayıcı yerleştirilir. Zaten 1 dakika sonra, 15-30 dakika sonra protein bantları gözlenebilir. boyama çoğu durumda yeterince güçlü. </li><li> Boyama çözüm dökülür ve 50-100 ml bidistile su daha açık mavi renkli bir çalkalayıcı üzerinde jel destain için eklenir. Gerekirse daha destaining için su, taze su ile değiştirilebilir. </li><li> Jel, taranmış fotoğraflandı veya uzun süreli depolama için kurutulur. </li></ol> Bölüm 4: Temsilcilik Sonuçları: Bkz: Şekil. 1 açıklanan prosedürü izleyerek düzgün lekeli bir jel. Bkz: Şekil. Boyama ve artık SDS önce yeterince uzun değil yıkanmamış bir jel için 2 verimli boyama engeller. Marker proteinlerin aynı miktarda marker şerit (*) içerdiğini unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig1.png" alt="" /> Şekil 1: Bir protein saflaştırılması örnekleri (moleküler ağırlık belirteci *) yükledikten sonra Temsilcisi jel boyandı. <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig2.png" alt="" /> Şekil 2: CBB boyama önce yeterince uzun yıkanmış olmamıştır CBB boyanan jel. Protein bantları (marker şeritli * Şekil olarak aynı miktarda protein 1 içerdiğine dikkat) zayıf görünür.

<ol><li>Process for fast visualization of protein. US patent. , 6319720 (B1) (2001).</li>
<li>Solution for fast visualization of protein. US patent. , 2001046709 (A1) (2001).</li>
</ol>

Çatışan çıkarları yok. Prosedür (Ref bakınız.) Yukarıda açıklanan başlangıçta EM Wondrak bir patent başvurusu yayımlandı.

<ul><li> Çamaşır adımlar proteinleri etkili bir şekilde boyanması için kritik. 2 dakika veya hacim azalması (&lt;50 ml) su altında bir azalma yıkama süresi, yüksek miktarda jel artık SDS nedeniyle büyük olasılıkla soluk mavi protein bantları, neden olabilir. </li><li> Proteinler, kütle spektrometresi ile analiz olacak ise, mikrodalga fırında ısıtma adımları atlanabilir, her adımda yaklaşık 10 dk ve grubun yoğunluğu kadar uzatıldı boyama süresi uzatıldı jel yıkama için yeterince güçlü . Kütle spektrometresi jel matriks ve böylece proteinleri tes...

<table><tbody><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td>herhangi bir diğer CBB G-250 de kullanılabilir</td></tr><tr><td>Konsantre HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organik solvent ve asetik asit olmadan jeller coomassie g-250 ile proteinlerin boyama

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coomassie Brillant Blue (CBB), toksik ve yanıcı organik çözücüler (Metanol, Etanol ve 2-propanol) ve asetik asit içeriği ile çözümler kullanarak klasik protein boyama protokolleri, fiksasyon için kullanılan boyama ve SDS sonra bir jel proteinlerin destaining -PAGE. Kısa bir süre mikrodalga fırında ısıtma, boyama çözüm prosedürü hızlandırmak için sık sık kullanılır. Bu genellikle toksik veya tehlikeli Metanol, Etanol ve 2-Propanol ve güvenliği ile ilgili hususlar nedeniyle kaçınılmalıdır laboratuar asetik asit güçlü bir koku buharlaşması sonuçlanır. EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)) tarafından iki patent başvurularının yayınlanan bir protokol, boyama çözüm alternatif bir kompozisyon solvent organik veya asit olduğu açıklanmıştır. CBB bidistile su içinde çözünmüş (CBB G-250 litre başına 60-80mg) ve 35 mM HCl boyama çözüm sadece bileşik olarak eklenir. Jel CBB staning bidistile su jel SDS-PAGE ve kapsamlı yıkandıktan sonra yapılır. Yıkama sırasında jel ısıtma ve adımları boyama, sürecin daha hızlı bitmiş olması ve herhangi bir toksik veya zararlı bileşiklerin buharlaşan. Proteinlerin boyama boyama çözüm jel ısıttıktan sonra 1 dakika içinde zaten ortaya çıkar ve tamamen lekeli protein etkilemeden, bidistile su ile boyanan jel uzun süreli yıkama tamamen destained bir hafif mavi arka plan ile 15-30 dakika sonra geliştirilen bantlar.

Coomassie Brillant Blue (CBB) poliakrilamid jeller G-250 ile protein boyanması için kısa bir protokol CBB ile klasik boyama işlemleri gibi organik çözücüler veya asetik asit kullanmadan açıklanmıştır.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

Coomassie Brilliant Blue (CBB) kullanılan klasik protein boyama protokollerinde, yüksek oranda toksik ve yanıcı organik çözücü içeren solüsyonlar...

Bu prosedüre başlamak için, Kumasi Brilliant Blue veya CBG two 50, iki ila dört saat boyunca karıştırılarak bir litre bi distile suda çözülür. Daha sonra koyu mavi çözeltiye, bir dakika daha karıştırılarak hidroklorik asit eklenir ve çözelti daha sonraki kullanımlar için karanlıkta saklanır. Protein numune hazırlama ve STS page işlemlerinin ardından, jel kaseti sökülür ve jel, bi distile su ile gerçekleştirilecek üç ardışık yıkama adımı için bir kutuya yerleştirilir.Üçüncü yıkama adımından sonra, su, kutudaki jeli örtecek kadar CBB boyama çözeltisi ile değiştirilir. Kutu mikrodalga fırında 10 saniye ısıtılır ve ardından jelin bulunduğu kutu bir sarsıcı üzerine yerleştirilir. Boyamanın tamamlanması için, bir dakika sonra protein bantları gözlemlenebilir.Merhaba, ben EMBL Heidelberg'deki protein ekspresyon ve saflaştırma tesisinden Amri Lawrence. Bugün size, klorür jellerdeki proteinleri Coomassie Brilliant Blue G-250 ile boyamak için bir protokol göstereceğiz. Klasik boyama yöntemlerinin aksine, protokolümüz herhangi bir organik çözücü veya asetik asit kullanmamaktadır.Bu protokolü, her saflaştırma adımından sonra proteinlerimizi analiz etmek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. C

staining-proteins-gels-with-coomassie-g-250-without-organic-solvent

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

, Jel proteinlerin elektroforetik yöntemlerle ayrılması ardından çeşitli boyama yöntemleri ile tespit edilebilir. Coomassie Mavi, Gümüş Boyama, SYPRO Turuncu, SYPRO Ruby ile proteinlerin Boyama Bu video gösterilmektedir.

Jeller içinde Proteinler Boyama

Bu video Kang göre kolloidal Coomassie G-250 boyama protokol sevdirmek...

Proteinler için Poliakrilamid Jeller Hızlı ve Hassas Kolloidal Coomassie G-250 Boyama

SDS-PAGE ile takip glikoproteinler şekerler kaldırmak için belirli glycosidases kullanarak protein örnekleri üzerinde glukanıdır değişiklikler tespit etmek için değerli bir yöntemdir ve ilk Glikobiyoloji çalışmaları için iyi bir seçimdir. Deglycosylation aşağıdaki değişiklikler, jel hareketlilik vardiya olarak veya glukanıdır duyarlı reaktifler boyama ile tespit edilebilir.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Bu videoda, sülfatlanmış glikozaminoglikan oligosakkarit fragmanlarının kombine Alcian mavisi ve gümüş boyaması için bir prosedür gösteriyoruz. Bu kombine boyama tekniği, poliakrilamid jellerdeki farklı uzunluklardaki glikozaminoglikan polimerlerinin bantlarını önemli ölçüde çoğaltır.

Sülfatlanmış Glikozaminoglikanların Gümüş Boyanması: Poliakrilamid Jellerde Sülfatlanmış Glikozaminoglikanların Görselleştirilmesi İçin Bir Boyama Yöntemi

O-bağlı glikanların çeşitliliğini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, permetilasyon ve hızlı bir faz bölme yöntemi ile birlikte jel içi indirgeyici β-eliminasyon için yeni bir prosedür, SDS-PAGE tarafından çözülen glikoproteinlerden doğrudan salınan O-bağlı glikanların analizine uygulanır ve kütle spektrometresi ile müteakip glikomik analize uygundur.

Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik

Burada, kütle spektrometresi (ayırmak ve bir iyi ve tekrarlanabilir 2DE desen sunar insan hipofiz adenom doku Proteom tanımlamak için MS) ile birleştiğinde bir iki boyutlu Jel Elektroforez (2DE) mevcut. Çoğu protein her 2DE yerde karmaşık kanser Proteom yüksek-duyarlı MS kullanımı ile analiz ederken gözlenir.

İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez

Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Burada, biz yeni bir floresan polyacrylamide jellerin toplam protein algılaması için teknik boyama özetleyen bir detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Ag+algılar bir gümüş iyon özgü Floresans tahrik sonda protokol kullanır-protein kompleksleri ve geleneksel chromogenic gümüş lekeler belirli sınırlamaları ortadan kaldırır.

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Bu protokol, proteotoksik antimikrobiyal ile tedaviden sonra Escherichia coli'den agrega ve çözünür proteinlerin çıkarılmasını ve görselleştirilmesini açıklar. Bu prosedürün ardından, farklı bakteri suşlarında ve/veya tedaviler arasında in vivo protein agrega oluşumunun nitel bir karşılaştırmasına izin verir.

Proteotoksik Stresör ile Escherichia coli Tedavisinden Sonra Protein Agregalarının Ekstraksiyonu ve Görselleştirilmesi

Bu protokol, sadece küçük miktarlarda numune mevcut olduğunda solunum süper komplekslerinin analizi için bir tekniği tanımlar.

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu 

Öğrenin, poliakrilamid jellerde Coomassie G-250 ile protein boyama yöntemini. Organik solvent ve asetik asit kullanmadan, bir dakikada net protein bantları elde edin. Bu güvenli protokol, biyokimyasal analizler için hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sunar.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

Daha fazla video keşfet