Name: 0.22 mcM Sterivex Filtreler ve Sezyum Klorür Yoğunluk Gradient Santrifüj DNA Ekstraksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-18T05:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Öğrenin, 0,22 mikrometre Sterivex filtrelerden planktonik biyokütleden yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA ekstraksiyonu ve sezyum klorür yoğunluk gradienti ile saflaştırma yöntemini. Bu protokol, deniz ortamlarında mikrobiyal topluluk yapısını ve metabolizmasını incelemek için yüksek kaliteli DNA sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu ve Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada Kanada Vakfı Biz, kıyı ve açık okyanus sularında düşük oksijen bölgelerde devam eden çalışmalar destek için teşekkür etmek istiyorum. JJW NSERC ve DAW burs tarafından desteklenen NSERC, Killam ve TULA vakıf Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim finanse Merkezi burs tarafından desteklenmiştir. SL Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim TULA vakıf tarafından finanse edilen Merkezi tarafından desteklendi.

Not: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler çalışma hisse senetleri bu DNA örnekleri ve laboratuar stoklarının kirlilik çapraz bulaşmayı önlemek için çok önemli küçük laboratuvar stokları aliquoted. Ayrıca, pipetleme, çapraz kontaminasyonu engellemek için her türlü ek için pipet uçları değiştirmek için emin olun. Part One: Hücre Lizis ve Sindirim <ol><li> Bu protokol, buz üzerinde önceden konsantre planktonik biyokütle içeren Sterivex filtreler çözülme başlayın. Basitlik için, burada ayrı bir filtre işleme prosedürü tarif. Uygulamada, bir defada işlem 16 veya daha az filtreleri tavsiye ederiz. </li><li> Filtre çözülmüş sonra, ilk iki inkubasyon başlar: biri olmuş akyuvarlar ve proteinleri yıkmak için, RNA, ve bir kaldırmak için. Ilk kuluçka dönemi için 100 ul lizozim (1000 ul TE 125 mg) ve 20 ml RNaz A (10 mg / ml), filtre ekleyin. Parafilm ile filtre Reseal ve hibridizasyon fırında ° C &#39;de 1 saat süreyle 37 ° döndürmek için bırakın. </li><li> Sonraki kuluçka için 100 ul proteinaz K ve 100 ul% 20 SDS, filtre ekleyin. 55 Reseal hibridizasyon fırında 1-2 saat daha fazla döndürmek için Parafilm kullanarak ve bırakın bu kez ° C </li><li> 5cc bir şırınga kullanılarak, 15 ml Falcon tüp içine Sterivex filtre lizat aktarın. 1 ml lizis tamponu ile filtre durulayın ve Falcon tüp içinde lizat 5cc şırınga ile sıvı durulama ekleyin. Şimdi size parçalanmış ve hücreleri sindirilir olduğunu, onların DNA ayıklamak için hazır. </li></ol> Bölüm İki: DNA Ekstraksiyon <ol><li> Bir sonraki adım sizin lizat DNA ayıklamak için fenol-kloroform yöntemi kullanmaktır. Çapraz kontaminasyonu engellemek için her ek için pipet uçları değiştirmek için emin olun, lizat tüp izoamil Alkol (IAA): Kloroform: Fenol eşit hacmi (3ml hakkında) ekleyin. 10 saniye iyice karıştırın vorteksleyin. </li><li> 5 dakika 2500 g santrifüj dengeli olduğundan emin Spin tüp. Alt örnekten fenol, kloroform ve protein içeren bir organik katmanı, DNA, su, sulu bir tabaka, ve diğer: santrifüj sırasında, fenol-kloroform-lizat karışımı iki kat ayırmalıdır üstüne daha hidrofilik molekülleri. </li><li> Sulu tabaka (DNA içeren) yeni bir 15 ml Falcon tüp içine aktarın. Pipet ucu (her zaman arkasında sulu tabakanın küçük bir miktar terk) ile arayüz dokunmamaya dikkatli olun. </li><li> Çapraz kontaminasyonu engellemek için her ek için pipet uçları değiştirmek için emin olun, IAA: Bu yeni tüp, Kloroform eşit hacmi (yaklaşık 3 ml) ekleyin. 10 saniye karıştırın. Bu adım, DNA örneği kalan herhangi bir fenol giderilmesine yardımcı olur. </li><li> Sulu açıktır kadar 5 dakika veya 2500 g dönerler. Yeni, etiketli Falcon tüp içine aktarın ve sulu tabaka, pH 8.0 TE 1 ml pipet ucu (her zaman arkasında sulu tabakanın küçük bir miktar terk) ile arayüz dokunmamaya dikkat ederek ekleyin. Bu sulu DNA özü içerir. </li></ol> Bölüm Üç: DNA Konsantrasyon ve Yıkama <ol><li> Bir sonraki adım, 15 ml Amicon Ultra santrifüj tüpüne DNA örneği yıkayın ve konsantre. Amicon tüpleri (süzüntü), akışı yakalamak için belirli bir molekül ağırlığına (retentate) ve bir tüp ya da yukarıda molekülleri tutar bir filtre oluşur. Bu durumda, filtre DNA (retentate) korur. Adım 2.5 DNA özü bir Amicon Ultra tüp filtre bölmesine aktarın. </li><li> 3500 g de 10 dakika boyunca dönerler. Amicon filtre muhafaza sıvı az 1 ml olduğundan emin olmak için kontrol edin. Daha retentate kalır, TE filtre dolum ve tekrar döndürebilirsiniz. Çapraz kontaminasyonu engellemek için her TE ek için yeni bir pipet kullandığınızdan emin olun. </li><li> Başka bir Falcon tüp akış yoluyla veya süzüntü çıkarın ve bir jel üzerinde son DNA ürün doğruladı kadar (Dördüncü Bölüm) buzdolabında saklayın. </li><li> 2 ml TE tampon Amicon filtre ekleyin ve çapraz kontaminasyonu engellemek için her TE ek için yeni bir pipet kullanmak için emin olun, 6 dakika için 3500 g döndürün. Havuz adım 3.3 ile süzüntü ve buzdolabında saklayın. </li><li> Üç yıkar (her zaman taze bir pipet kullanmak için emin olun) toplam TE DNA iki kez daha yıkayın ve (3.3 ve 3.4 gibi adım başı) süzüntü her zaman tasarrufu. Son yıkama, sıkma Amicon filtre retentate kalıntıların 200 ila 500 ml kadar. Son ses kaydetme ve etiketli 1.5 ml Eppendorf tüp (DNA içeren) retentate aktarmak. </li></ol> Dördüncü Bölüm: DNA Kalitesinin Belirlenmesi <ol><li> DNA kalitesini kontrol edin ve bir jel% 0.8 agaroz jel sta örnekleri tükeniyor DNA konsantrasyonu tahmingecede 1ml ethidium bromür (EtBr) ile incelendiği. (Kullanırken son derece dikkatli olun EtBr bilinen bir mutajen ve şüpheli kanserojen eldivenler sık ​​sık değiştirmek ve laboratuar geri kalanına ve cildinize EtBr transferini önlemek için emin olun.) Yük görevi, DNA merdivenler yanında örnekleri, büyüklüğü ve yoğunluğu standartları (sonraki adıma bakın). </li><li> İlk birkaç şeritli, çeşitli molekül ağırlıkları ve konsantrasyon bantları ile merdivenler yük. Ilk ve son şerit (dıştaki şerit), 10 ul 1KB 50ng/μl, yük + veya 2log merdiven: Biz aşağıdaki yükleme deseni öneririz. 2,3 ve 4 şeritli yükü 2 ul, 5, ul ve 50ng/μl λHindIII merdivenin sırasıyla 10 ul,. Son olarak, her bir örnek için boya ile DNA özü her kulvar için 5 ul yükleyin. </li><li> Jel, yaklaşık 16 saat için 15 volt (gece çalıştırmanızı öneririz) çalıştırın. </li><li> Ertesi gün, bir UV jel dokümantasyon sistemi kullanılarak jel fotoğrafı. DNA ve konsantrasyonu moleküler ağırlığı aralığı belirlemek için örnek bantları, merdiven bantları karşılaştırın. İyi kalitede DNA yüksek molekül ağırlıklı (&gt; 36KB) var ve çok az kanıt kesme / bozulma gösterecektir. Bkz: Şekil 1. </li></ol> Beşinci Bölüm: Sezyum Klorür Gradient Santrifüj <ol><li> DNA kalitesi iyi ve miktarı yeterli değilse, bir sezyum klorür (CSCL) gradient santrifüj yaparak DNA arındırmak için devam edebilirsiniz. Bu arıtma adım isteğe bağlıdır ve downstream uygulamalar (örneğin, sadece PCR reaksiyonları gerçekleştirmek istiyorsanız ise, arıtma genellikle gerekli değildir, arındırmak GEREKEN fosmid kütüphaneleri oluşturmak istiyorsanız) için gerekli olduğunu unutmayın. Öncelikle, her bir örnek için bir santrifüj tüpüne etiket. </li><li> Her bir santrifüj tüpüne, 160 CSCL mg, 178 ul genomik DNA ekleyin. Tüp CSCL ve DNA ekledikten sonra, parafilm tüpün üstüne küçük bir parça koyun ve bileşenleri karıştırmak için hafifçe tüp on ila yirmi kez ters çevirin. Pipetleme ile karıştırmayın, DNA kesme neden olabilir. Sonra bu tüp, 10 mikrogram / ul EtBr 10 ul aynı şekilde ekleyin ve karıştırın. (Kullanırken son derece dikkatli olun EtBr bilinen bir mutajen ve kanserojen şüpheli. Eldivenler sık ​​sık değiştirmek ve laboratuar geri kalanına ve cildinize EtBr transferini önlemek için emin olun.) </li><li> Tüpler arasındaki ağırlık farkı 1 mg daha az olduğu gibi santrifüj tüpleri ağırlığı önce dengeli olduğundan emin olun. </li><li> Rotor kullanarak hemostat tüplerin yerleştirin, kapağını kapatın ve ultrasantrifüjdeki içindeki rotor. </li><li> Ultrasantrifüjdeki kapağını kapatın. Vakum kapıya yakın olarak en kısa sürede yapılacaktır. 18 saat boyunca 100.000 rpm ve 20 ° C gece çalıştırın </li><li> Santrifüj tamamlandığında, bir tüp raf hemostat ve yer kullanarak rotor tüpleri almak. </li><li> Mavi ışık transilluminator&#39;de ile DNA görselleştirin veya kullanılamaz, karanlık bir odada, uzun dalga boylu UV ışığı kullanın. DNA bant görmek için kehribar filtre gözlük bir çift giyin. Bakınız Şekil 2. </li><li> 1 cc steril şırınga ve iğne (26g 5 / 8) kullanarak, DNA bandı çıkarın ve bir 1.5ml Eppendorf tüp içine koyun. </li><li> Şırınga içinde ölü bir alan içinde sıkışıp DNA en kurtarmak yardımcı olmak için, 100 ul TE şırınga ile yıkayın ve tüp durulanır çözüm ekleyin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için bir tüp numune başına 100 ul TE tampon ile hazırlayın. </li><li> DNA EtBr kaldırmak için, yavaşça borular on ila yirmi kez, 1 dakika 10.000 rpm&#39;de santrifüj invert tüpüne eşit hacimde su doymuş bütanol eklemek ve üst tabaka atın. </li><li> - 4 kez daha bütanol renk, 3 şeffaf kadar yıkama işlemi tekrarlayın. </li><li> Place 4 ml bir Amicon Ultra santrifüj tüpüne TE ve yukarıda DNA çözüm ekleyin. </li><li> DNA hacmi yaklaşık 100-500 ul (yaklaşık 6-7 dakika) azalır kadar, 3500 g oda sıcaklığında santrifüj ve flow-through atın. </li><li> 2ml TE Amicon filtre ekleyin ve çapraz kontaminasyonu engellemek için her ek için yeni bir pipet kullanmak için emin olun, 6 dakika için 3500 g santrifüj. Iki kez tekrarlayın. </li><li> Konsantre gerekli gibi ek santrifüj 50-100 ul son bir hacmi ve yeni bir 1,5 ml Eppendorf tüp filtre DNA çözümü transfer. </li><li> 40 ul TE Amicon filtre ekleyin ve kalan herhangi bir DNA yıkamak için her iki filtre membranlar boyunca yukarı ve aşağı pipetle. Bu çözüm, 5.15 tüp ekleyin. </li><li> 200 ul otoklava su ekleyerek ve 7 dakika 10.000 rpm&#39;de santrifüj Microcon tüp ve ön yıkama Microcon Microcon YM-30 filtre ünitesi yerleştirin. </li><li> DNA daha fazla konsantre 5.16 den DNA çözümü amacıyla prewashed Microcon ekleyin. 1 - 3 dakika 5000-10000 g santrifüjleyin. Sıvı miktarını kontrol edin, filtre ve tekrar santrifüj filtre üzerinde sıvı miktarı yaklaşık 50 ul azalır kadar. </li><li> , Yeni bir Microcon tüp içinde baş aşağı filtre ünitesi koyun ve 3 dakika 1000 g santrifüj. Konsantre çözüm ideal miktar 50-60 ul. </li><li> Ve bir Nanodrop DNA konsantrasyonu ölçün, kayıt ve zirve kalite kontrol (260nm olmalıdır). </li><li> DNA küçük bir kısım eksi 20 hisse senedi ve dondurma çalışmak için temiz bir Eppendorf tüp aktarın. DNA geri kalanı, eksi 80, ikinci bir temiz Eppendorf ve donma aktarın. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Bu protokol doğru yapıldığında, Şekil 1 &#39;e benzer DNA kalitesinin belirlenmesi 4.4 adım sonra bir jel görüntü göreceksiniz. Gerçek DNA konsantrasyonu özler örnek kaynağına bağlı olarak değişir. CSCL degrade santrifüj 5.7 adım sonra, mavi ışık ile aydınlatılan genomik DNA Şekil 2 &#39;e benzer bakmak gerekir. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 intercalating ajan etidyum bromür (10 mg / ml) ile boyandı güney kutup dairesine Pasifik Okyanusu (iki nüsha), dört derinliklerinde toplanan yüksek molekül ağırlıklı DNA% 0.8 agaroz jel elektroforezi görüntü. Jel 1X TBE jel çalışan tampon için 15V ~ 16 saat çalıştırıldı. Örnek bantları mekanik kesme (birden fazla bantları karşı tek bantlar veya smear gösterir) çok az kanıt gösteren kaliteli 10m özleri korumak rağmen bazı RNA (0,5 ila 2,0 Kb aralığında smear) üzerinde taşır. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 CSCL degrade santrifüj sonra mavi ışık ile aydınlatılan Genomik DNA bant.

<ol><li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+BAC+or+not+to+BAC%3A+marine+ecogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li>
<li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li>
<li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li>
</ol>

Işlenecek kaç örneklerindendir bağlı olarak, bu iki saatlik inkübasyon adımları ve tekrarlanan yıkama ve santrifüj adımları nedeniyle bir süre yoğun bir prosedür olabilir. Bol zaman terk etmek, bu işlem için iki tam gün planlamak için en iyisidir. Artık uygun hacmi kadar (Bölüm Üç tekrarlayın) ek TE yıkar ve santrüfüj yapmaya çalışın, DNA konsantrasyonu ve yıkama sırasında 200-500μl azaltmak için Amicon tüp nihai özü hacmi sorunları vardır. Ayrıca, eğer özü akut kloroform kokuyor, kokusu tüm kloroform kaldırılır emin ol...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<table><tbody><tr><td>1 cc şırınga (26G5/8 iğne)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga (26G5/8 iğne)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml eppendorf tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tüpler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>5 cc şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&amp;#174; Ultra-4 Santrifüj Filtre Cihazları</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801096</td><td>10,000 nominal moleküler ağırlık sınırı</td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-1</td><td>Suyla doyurulmuş hale getirin (butanol:su = 1:1)</td></tr><tr><td>Santrifüj rotoru, JA5.3 </td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj, Avanti&amp;#174; J-E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>369003</td><td></td></tr><tr><td>Sezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4036</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform:IAA (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25666-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür (EtBr)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon fırını</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10</td><td>37&amp;#x00B0;C &amp;amp; 55&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Lizis Tamponu</td><td></td><td></td><td>0,75 M sükroz, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8,3)</td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-5G</td><td>1000 &amp;#x03BC;l TE içinde 125 mg</td></tr><tr><td>Microcon&amp;#174; Ultracel YM-30 Santrifüj Filtre Ünitesi</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>50 bp kesme sınırı</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Kloroform:IAA (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>RNaz A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2539-100</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Safe Imager&amp;#8482; Mavi ışık transilüminatörü</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td>%20 SDS</td></tr><tr><td>Sterivex filtreler</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVG010RS</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>TE tamponu, pH 8,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma&amp;#174; bazı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj rotoru, TLA 100</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343847</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpü (7X20mm, PC)</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüp rafı</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>348302</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj, Optima&amp;#174; Max</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

0.22 mcm sterivex filtreler ve sezyum klorür yoğunluk gradient santrifüj dna ekstraksiyon

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Bu yöntem, depolama / lizis tamponu ile tedavi edilen ve -80 ° C&#39;de arşivlendi 0.22 mcM Sterivex filtreler üzerinde yoğunlaştı planktonik biyokütleden yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA ayıklamak için, ve sezyum klorür yoğunluk gradiyenti kullanarak bu DNA arındırmak için kullanılır. Protokol, hücrelerin DNA kurtarmak ve RNA kaldırmak için iki kez birer saat inkübasyon adımlar ile başlar. Sonra, bir dizi fenol: kloroform ve kloroform ekstraksiyon, proteinler ve hücre zarı bileşenleri, sulu DNA özü toplama, ve özü yıkayın ve konsantre birkaç tampon değişim adımları kaldırmak için santrifüj yoluyla takip yapılır. Beşinci Bölüm, isteğe bağlı arıtma sezyum klorür yoğunluk gradiyenti ile açıklanmıştır. Bu karışıklığı önlemek ve protokol süresini azaltmak için tek seferde en az 15 örnek ile çalışmak tavsiye edilir. Bu protokol için gerekli toplam süre çıkarılan numune sayısı bağlıdır. 10-15 örnekler ve uygun santrifüj ekipmanları mevcut olduğu varsayılarak, tüm bu protokol, 3 gün sürmesi bekleniyor. Hibridizasyon fırınlar sürecin başında ısıya ayarlanmış olduğundan emin olun.

Biz sezyum klorür yoğunluk gradiyenti santrifüj arıtma için 0.22 mikron Sterivex filtreler, konsantre planktonik biyokütle yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA çıkarılması için bir metodu tanımlar.

0.22 mcM Sterivex Filtreler ve Sezyum Klorür Yoğunluk Gradient Santrifüj DNA Ekstraksiyon

Bu yöntem, ... olan 0,22 &mu;M Sterivex filtreler üzerinde yoğunlaştırılmış planktonik biyokütleden yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA ekstraksiyonu yapmak için kullanılır.

Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Steven Hallam laboratuvarından Jody. Bugün size, deniz suyu örneklerinden 0,2 mikron STX filtrelere konsantre edilmiş genomik DNA'nın ekstrakte edilmesi ve bu DNA'nın sezyum klorür yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile saflaştırılması prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, deniz ortamlarındaki mikrobiyal topluluk yapısını, çeşitliliğini ve metabolizmasını inceleyebilmek için çevresel DNA elde etmek amacıyla bu prosedürü kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Bu protokole, daha önce planktonik biyokütle ile konsantre ettiğiniz, lizis tamponu ile işlemden geçirdiğiniz ve kolaylık sağlaması adına dondurduğunuz X filtre setini buz üzerinde çözdürerek başlayın. Burada, tek bir filtrenin işleme tabi tutulma prosedürünü açıklıyoruz.Pratikte, tek seferde 15 veya daha az filtrenin işlenmesini öneriyoruz. Filtre çözündükten sonra, iki inkübasyon aşamasının ilkine başlayın. Bunlardan biri hücreleri liz etmek ve RNA'yı uzaklaştırmak, diğeri ise proteinleri parçalamak içindir.İlk inkübasyon için filtreye 100 µL lizozim ve 20 µL RN a's a ekleyin. Filtreyi parafilm ile tekrar kapatın ve 37 °C'de bir saat boyunca döndürülmeye bırakın. Bir sonraki inkübasyon için filtreye 100 µL protein ace KN ve 100 µL %20 SDS ekleyin.Filtreyi parafilm kullanarak tekrar kapatın ve bir ila iki saat daha dönmeye bırakın. Bu seferki işlem 55 °C'de gerçekleştirilmelidir. Lizatı Stax filtreden 15 ml'lik bir falcon tüpüne aktarmak için 5 cc'lik bir şırınga kullanın.Filtreyi bir mililitre lizis tamponu ile durulayın ve durulama sıvısını falcon tüpünüzdeki lizata ekleyin. Hücrelerinizi lizise uğratıp sindirdiğinize göre, artık DNA'larını ekstre etmeye hazırsınız. Bir sonraki adım, lizatınızdan DNA ekstre etmek için fenol kloroform yöntemini kullanmaktır.Lizat tüpüne yaklaşık üç mililitre hacminde eşit miktarda fenol kloroform, izoamil alkol ekleyip vortekslenerek 10 saniye boyunca iyice karıştırın. Tüpü 2.500 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüj sırasında, fenol kloroform lizat karışımı iki katmana ayrılmalıdır.Alt kısımda, fenol kloroform ve örneğinizdeki proteinleri içeren bir organik tabaka ile genellikle üst kısımda bulunan, DNA'nız, su ve diğer daha hidrofilik moleküllerden oluşan bir sulu tabaka oluşur. DNA'nızı içeren sulu tabakayı yeni bir 15 mililitrelik Falcon tüpüne aktarın. Bu tüpe, eşit hacimde kloroform izoamil alkol karışımı ekleyin ve 10 saniye boyunca vorteksleyin.Bu adım, DNA örneğinizde kalan tüm fenolü uzaklaştırır. Örneği 2.500 ×g'de beş dakika veya sulu faz berraklaşana kadar santrifüj edin. Sulu fazı yeni ve etiketlenmiş bir falcon tüpüne aktarın ve pH 8'de bir mililitre TE ekleyin.Artık DNA ekstraktınız hazır. Bir sonraki adım, DNA örneğini 15 mililitrelik bir Amazon ultrasantrifüj tüpünde yıkamak ve konsantre etmektir. DNA örneğinizi bir tanesinin filtre bölmesine aktarın.Ultra tube filtre tüpleri, belirli bir moleküler ağırlıktaki veya üzerindeki molekülleri tutan bir filtreden, bir kapaktan ve süzüntü akışını toplamak için bir tüpten oluşur. Bu durumda filtre, DNA'nızı 10 dakika boyunca 3,500 ×g hızında santrifüj ederek tutar. Amikon filtresinde 1 mL'den daha az sıvı kaldığından emin olmak için kontrol edin.Eğer daha fazla tutulan madde (retentate) kalırsa, filtreyi TE ile tekrar doldurun ve yeniden santrifüjleyin. Geçen sıvıyı veya filtratı başka bir falcon tüpüne aktarın ve final ürününüzü jel üzerinde doğrulayana kadar buzdolabında saklayın; ardından filtreye iki mililitre TE tamponu ekleyin ve 3,500 ×g hızında altı dakika boyunca santrifüjleyin. Filtratı daha önce yaptığınız gibi uzaklaştırın.DNA'yı toplam üç yıkama olacak şekilde TE ile iki kez daha yıkayın; Amikon filtrede 200 ila 500 µL TE kalana kadar her bir yıkama santrifüjünden sonra filtratı saklayın. Final hacmi not edin ve etiketli bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Çalışma stoğu olarak kullanmak üzere, yıkanmış konsantre DNA'dan 70 µL'lik bir alikot hazırlayın.Çalışma stokunu -20 °C'de saklayın. Geri kalan DNA'yı -80 °C'de dondurarak saklayın. Numunelerinizi bir DNA merdiveni ile yan yana jel üzerinde koşturarak nihai ürününüzün DNA konsantrasyonunu ve kalitesini kontrol edin.Boyut ve yoğunluk standartları olarak hizmet eden markerlar için %0.8 AROS jel ve etidyum bromür hazırlanarak gece boyunca çalıştırılır. İlk birkaç kuyucuğa çeşitli moleküler ağırlıklarda ve konsantrasyonlarda bantlar içeren markerlar yükleyin; aşağıdaki yükleme düzenini öneririz. İlk iki kuyucuğa 10 µL 1 kb+ marker yükleyin; sonraki üç kuyucuğa ise sırasıyla 2 µL, 5 µL ve 10 µL 50 ng/µL Lambda H3 marker yükleyin.Son olarak, her kuyucuğa beş µL DNA ekstrakt örneği yükleyin. Jeli yaklaşık 16 saat boyunca 15 volt değerinde çalıştırın. DNA'nızın moleküler ağırlık aralığını ve konsantrasyonunu belirlemek için UV jel görüntüleme sistemini kullanarak jelin fotoğrafını çekin.Örnek bantlarını merdiven bantlarıyla karşılaştırın. Kaliteli DNA, yüksek moleküler ağırlığa sahip olacak ve parçalanma veya degradasyonun çok az belirtisini gösterecektir. DNA kalitesi iyiyse ve miktarı yeterliyse, sezyum klorür gradyanı uygulayarak DNA'yı saflaştırma işlemine geçin.Santrifüjleme aşaması için öncelikle, her örnek için bir santrifüj tüpü etiketleyin; her santrifüj tüpüne 160 mg sezyum klorür ve 178 µL genomik DNA ekleyin. Tüpün ağzını küçük bir parafilm parçasıyla kapatın ve bileşenleri karıştırmak için tüpü nazikçe 10 ila 20 kez alt üst edin. DNA'nın parçalanmasına neden olabileceği için pipetleme yoluyla karıştırmayın.Ardından tüpe 10 µL AUM bromür ekleyin ve tekrar karıştırın. Santrifüjlemeden önce tüplerin iyi dengelendiğinden ve tüpler arasındaki ağırlık farklarının 1 mg'dan az olduğundan emin olun. Tüpleri cımbız makas kullanarak ultrasantrifüj rotoruna yerleştirin.Ardından rotor kapağını kapatın ve rotoru ultrasantrifüjün içine yerleştirip kapatın. Kapıyı kapattığınız anda ultrasantrifüj kapı vakumu uygulanacaktır. 20 °C'de, 100, 000 RPM hızında toplam 18 saat boyunca gece boyu çalıştırın.Santrifüj işlemi tamamlandığında, tüpleri pens makası kullanarak rotordan çıkarın ve rafa yerleştirin. Tüpleri mavi ışık translüminatörüne götürün ve kehribar renkli filtre gözlükleri takın. Ardından mavi ışığı açın ve steril 1 cc şırınga ile iğne kullanarak DNA bandınızı gözlemleyin.Şırıngadaki ölü hacimde hapsolmuş DNA'nın çoğunu geri kazanmaya yardımcı olmak için DNA bandını çıkarın ve ardından 1,5 mililitrelik bir eppendorf tüpüne yerleştirin. Şırıngayı 100 mikrolitre TE ile durulayın ve durulama solüsyonunu tüpe ekleyin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her örnek başına 100 mikrolitre TE tamponu içeren bir tüp hazırlayın.AUM bromürü DNA'dan uzaklaştırmak için tüpe, eşit hacimde suyla doyurulmuş bütanol ekleyin. Tüpleri nazikçe 10 ila 20 kez altüst edin, bir dakika boyunca 10,000 RPM hızında santrifüjleyin ve üst tabakayı atın. Bütanolün rengi şeffaf olana kadar yıkama işlemini yaklaşık üç ila dört kez daha tekrarlayın.Bir ancon ultrasantrifüj tüpüne dört mililitre TE koyun ve yukarıdaki DNA çözeltisini ekleyip oda sıcaklığında 3.500 ×g'de, DNA hacmi yaklaşık 100 ila 500 µL'ye düşene kadar santrifüj edin ve süzüntüyü atın. Amazon filtreye iki mililitre TE ekleyin ve altı dakika boyunca 3.500 ×g'de santrifüj edin. TE ile toplam üç yıkama yapacak şekilde bu işlemi iki kez daha tekrarlayın ve gerekirse ek santrifüjleme ile konsantrasyonu 50 ila 100 µL nihai hacme getirin.Ardından filtre üzerindeki DNA çözeltisini yeni bir 1.5 mililitre eppendorf tüpüne aktarın. Filtreye 40 mikrolitre TE ekleyin ve kalan tüm DNA'yı yıkamak için her iki filtre membranı boyunca pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi yapın. Bu çözeltiyi konsantre DNA'nın bulunduğu tüpe ekleyin.Bir MicroCon YM 30 filtre ünitesini bir MicroCon tüpüne yerleştirin ve 200 µL otoklavlanmış su ekleyip 10.000 RPM'de yedi dakika santrifüj ederek MicroCon'u ön yıkamadan geçirin. DNA'yı daha fazla konsantre etmek için DNA çözeltisini ön yıkama yapılmış MicroCon'a ekleyin ve 1 ila 3 dakika boyunca 5.000 ila 10.000 ×g'de santrifüjleyin. Filtre üzerindeki sıvı miktarını kontrol edin ve filtre üzerindeki sıvı miktarı yaklaşık 50 µL'ye düşene kadar santrifüjleme işlemini tekrarlayın.Filtre ünitesini yeni bir MicroCon tüpüne ters şekilde yerleştirin ve 1000 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. İdeal konsantre çözelti miktarı 50 ila 60 µL'dir. DNA örneğinizi yeni bir 1,5 mL'lik eppendorf tüpüne aktarın.DNA konsantrasyonunu NanoDrop ile ölçün ve pik kalitesini kontrol edin. Temiz DNA için absorbans grafiği 260 nanometrede net bir pik göstermelidir. Kalan DNA'yı -80 °C'de dondurun.Bu protokol doğru şekilde uygulandığında, Şekil 1'e benzer bir jel görüntüsü elde etmelisiniz; ekstraktların gerçek DNA konsantrasyonu örneğin kaynağına göre değişiklik gösterecektir. Bu protokol doğru şekilde uygulandığında, tüpün ortasında net bir DNA bandı görmelisiniz. Şekil 2'de olduğu gibi, size sterex filtrelerden genomik DNA'nın nasıl ekstrakte edileceğini ve sezyum klorür yoğunluk gradyanı kullanılarak nasıl saflaştırılacağını göstermiş olduk.Bu prosedürü gerçekleştirirken, başlamadan önce gerekli tüm reaktif ve sarf malzemelerinin yanınızda olduğundan emin olmanız önemlidir. İkinci olarak, prosedürü dikkatle tamamlayabilmek için yeterli zaman ayırmak amacıyla en az üç tam gün planlayın. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

dna-extraction-from-022-m-sterivex-filters-cesium-chloride-density

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikrobiyal topluluk yüksek molekül ağırlıklı ve yüksek kalitede genomik DNA izole etmek için bir metodoloji tarif edilir.

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

DNA kararlı izotop problama özel substratlar kullanma yeteneğine sahip olan mikroorganizmaların aktif toplulukları tanımlamak ve karakterize etmek için bir kültür bağımsız bir yöntemdir. Ağır izotop zenginleştirilmiş substrat Asimilasyon etiketli atomların mikrobiyal biyokütle içine dahil yol açar. Yoğunluk degrade Ultrasantrifügasyon downstream moleküler analizler için işaretli DNA alır.

DNA Kararlı-İzotop (DNA-SIP) Probing

Biz hypersaline mikrobiyal paspaslar yüksek molekül ağırlıklı DNA ayıklamak için geliştirilmiş bir protokol sağlar. Mikrobiyal hücrelerin DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma mat matris önce ayrılır. Bu konsantrasyonları, kalite ve DNA boyutunu artırır. Bu protokol, diğer refrakter numuneler için kullanılabilir.

Mikrobiyal Paspas Yüksek Moleküler Ağırlıklı DNA çıkarımı

Bu videoda, taze veya donmuş dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması tekniği açıklanmaktadır. İzole edilen hücre dışı veziküller, hastalık patogenezindeki önemli rollerini ortaya çıkarmak için daha ileri analizler için kullanılabilir.

Hücre Dışı Vezikül Ekstraksiyonu: Diferansiyel Santrifüjleme Kullanarak Tüm Doku Örneklerinden Hücre Dışı Vezikülleri İzole Etme Tekniği

Bu video, karakterizasyon çalışmaları için uygun hücre dışı veziküllerin alt popülasyonlarını izole etmek için yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme tabanlı saflaştırma yöntemini göstermektedir.

Hücre Dışı Veziküllerin Alt Popülasyonlarının Saflaştırılması: Yoğunluk Gradyanlı Ultrasantrifüjleme Kullanarak Hücre Dışı Veziküllerin Alt Popülasyonlarını Saflaştırma Tekniği

Burada, küçük hücre dışı veziküller (EVs) tüm dokular, beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere gelen yalıtmak için detaylı bir protokol sağlar. Bu yöntem daha da aşağı akım analizleri için sağlam doku EVs ayıklamak için tekrarlanabilir bir teknik sunar.

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Mevcut protokol, siyanobakteriyel kültürlerden hücre dışı veziküllerin izolasyonu, konsantrasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı açıklamalar sunmaktadır. Vezikülleri farklı ölçeklerdeki kültürlerden arındırmaya yönelik yaklaşımlar, metodolojiler arasındaki ödünleşimler ve saha örnekleriyle çalışmak için dikkat edilmesi gerekenler de tartışılmaktadır.

Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu

Bu çalışma, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) yoluyla insan dışkısından zenginleştirilmiş bakteriyel hücre dışı vezikülleri (BEV'ler) izole etmek ve saflaştırmak için bir yöntemi açıklamakta, BEV'lerin fiziksel özelliklerini morfoloji, partikül boyutu ve konsantrasyondan tanımlamakta ve DGC yaklaşımının klinik ve bilimsel araştırmalardaki potansiyel uygulamalarını tartışmaktadır.

Yoğunluk Gradyanlı Santrifüj Kullanılarak İnsan Dışkısından Bakteriyel Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Burada, düşük moleküler ağırlıklı hücre dışı DNA oranını artırarak çevresel antimikrobiyal direnci (AMR) değerlendirmek için basit bir teknik sunuyoruz. % 20 -% 30 PEG ve 1.2 M NaCl ile önceki tedavi, hem genomik hem de yatay olarak transfer edilen AMR genlerinin saptanmasına izin verir. Protokol, ek optimizasyon ile kitsiz bir sürece uygundur.

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu 

Öğrenin, 0,22 mikrometre Sterivex filtrelerden planktonik biyokütleden yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA ekstraksiyonu ve sezyum klorür yoğunluk gradienti ile saflaştırma yöntemini. Bu protokol, deniz ortamlarında mikrobiyal topluluk yapısını ve metabolizmasını incelemek için yüksek kaliteli DNA sağlar.

0.22 mcM Sterivex Filtreler ve Sezyum Klorür Yoğunluk Gradient Santrifüj DNA Ekstraksiyon

Daha fazla video keşfet