Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

Çok bölmeli mikroakışkan nöron ko-kültür cihazı üretimi, bir frezeleme makinesi ile PMMA blok üzerinde rezervuarların tanımlanmasıyla başlar ve ardından bölmeleri birbirine bağlayan mikrokanal dizilerinin sıcak kabartma işlemi ile oluşturulmasıyla devam eder. PMMA kalıp hazırlandıktan sonra, PMMA kalıptan PDMS kalıp anahtarı kopyalanır ve trikloretilen ile kaplanır. Nihai cihaz, PDMS kalıp anahtarından kopyalanır ve PDL kaplı bir kültür plakası üzerine monte edilir.

Ardından, primer E 16 ila 18 sıçan nöronları soma bölmesine yüklenir ve ko-kültür için akson GGL bölmesindeki aksonal tabakaların üzerine P 1 ila 2 sıçan oligodendrosit hücreleri eklenmeden önce iki hafta boyunca kültüre edilir. Merhaba, ben Texas A&M Üniversitesi Elektrik ve Bilgisayar Mühendisliği Bölümü, Nano Biyo Sistemler Laboratuvarı'ndan J Par. Bugün size çok bölmeli mikroakışkan nöron ko-kültür platformu üretimi için bir prosedür göstereceğiz.

Laboratuvarımızda merkezi sinir sistemi nöron-glia etkileşimini in vitro incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, 3.5 milimetre derinliğinde bölmeler oluşturmak amacıyla bir mikro frezeleme makinesi kullanın.

A-P-M-M-A blokta bir soma kompartımanı ve altı akson ggl kompartımanı tanımlayın. Kompartımanları hazırladıktan sonra, kalıntıları gidermek için 10 dakika boyunca izopropanol ile sonike edin, geleneksel fotolitografi ve ıslak aşındırma işlemi kullanarak cam lam üzerinde mikro oluk yapıları oluşturun ve camdaki mikro oluk desenlerini sıcak baskı ile aktarın. Önce PMMA kalıba kaydırın, ardından PMMA kalıp anahtarını ve cam altlığı manuel olarak hizalayın.

Ardından, sıcak presle sıcaklığı 115 °C'ye yükseltin. Sıcaklık ulaşıldığında, beş dakika boyunca 0,5 ton ağırlık uygulayın. Beş dakika sonra, 40 °C'ye kadar soğutun ve basıncı serbest bırakın.

Şimdi PDMS kalıbını hazırlamaya başlayın. PDMS ön polimeri ile kürleme ajanını ağırlıkça 10'a 1 oranında karıştırın, PMMA kalıbını 50 milimetreye 50 milimetre boyutunda bloklar halinde kesin. Bir şerit testere kullanarak bloğu bir kabın içine yerleştirin ve PDMS karışımını PMMA kalıbının üzerine dökün; ardından kabı, vakum pompasına ve DGA'lara bağlı bir desikatöre 15 dakika boyunca yerleştirin.

PDMS karıştırma işlemi sırasında oluşan kabarcıkları gidermek içindir. Tüm kabarcıklar giderildiğinde, polimerizasyon için kabı düz bir şekilde yerleştirilmiş 85 degrees Celsius fırında bir saat bekletin. PDMS tamamen kürlendikten sonra, PDMS kalıbını PMMA kalıbından ayırın; PDMS kalıbını, içine iki ila üç damla trikloroetilen damlatılmış bir desikatörün içine yerleştirerek buharla kaplayın ve 15 dakika boyunca vakum uygulayın.

PDMS kalıbın kaplanması, nihai PDMS nöron ko-kültür cihazının PDMS ana kalıptan ayrılmasını kolaylaştırır. Kaplanma işleminden sonra, fazla trikloretilenin uzaklaştırılması için PDMS kalıp kısa bir süre izopropil alkol ile durulanır ve nitrojen gazı ile kurutulur. PDMS polimerinden nöron ko-kültür cihazının üretimi, önceki bölümde açıklanan PDMS ana kalıbın hazırlanmasına benzerdir. İşleme, PDMS ön polimeri ile sertleştirici ajanın ağırlıkça 10'a 1 oranında karıştırılmasıyla başlayın ve ardından PDMS karışımını PDMS ana kalıbın üzerine dökün. Kalıp üzerindeki 3,5 mm yüksekliğindeki PDMS yapının tamamen gömülmemesi için çok fazla PDMS dökmemek önemlidir.

DGA'lar, bir vakum pompasına bağlı bir desikatör içerisinde 15 dakika bekletilir. Tüm kabarcıklar giderildiğinde, polimerizasyon için PDMS, terazisi alınmış 85 °C'lik bir fırında bir saat boyunca tutulur; bir saatin sonunda PDMS fırından çıkarılır ve oda sıcaklığında soğumaya bırakılır. Ardından, PDMS nöron kültür cihazları, PDMS mastardan nazikçe soyulur.

PDMS cihazlarını toz veya kalıntılardan korumak için paraform ile sarın. Paraform ile sarılı PDMS'i, bıçak donanımlı bir sütunlu matkap kullanarak tekil parçalar halinde keserek işlemi tamamlayın; nöron ko-kültür PDMS cihazları hücre kültürü plakalarında kullanıma neredeyse hazırdır. Nöron ko-kültür PDMS cihazını hücre kültürü plakasına yerleştirmeden önce, cihazı plazma temizleyiciye yerleştirin ve yüzeyi hidrofilik hale getirmek için 90 saniye boyunca hava plazmasına maruz bırakın.

Bu işlem, poli-D-lisin kaplı plakalara monte edildikten sonra mikro kanalların kültür ortamı ile doldurulmasını kolaylaştıracaktır. Plazma işlemi uygulanmış cihazı sterilize etmek için 30 dakika boyunca %70 etanol içinde bekletin ve ardından kabı steril biyolojik güvenlik kabinine taşıyın. 30 dakika sonra cihazı çıkarın ve 0,2 mikronluk millipore filtre ile filtrelenmiş azot gazı ile kurutun.

Ardından, kurutulmuş cihazları poli D lizin kaplı polistiren altı kuyucuklu kültür plağının üzerine yerleştirin ve kültür plağının yüzeyi ile cihaz buzu arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlandığından emin olmak için hafifçe bastırın. Şimdi soma bölmesini kültür medyumu ile doldurun. Mikro kanallar içerisinde hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için bir veya iki dakika bekleyin.

Ardından altı akson glia kompartımanını doldurun. Son olarak, olası kalıntıları veya toksik artıklarını gidermek için kültür medyası ile doldurulmuş düzenekleri 37 degrees Celsius'lik bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, hücrelerin düzeneğe yüklenmesine hazırlık için kültür işlemi başlatılabilir.

Soma ve Akson bölmelerindeki kültür ortamını aspire etmek için bir pipet kullanın. Ardından, embriyonik gün 16 ile 18 arası sıçanlardan elde edilen primer ön beyin nöron hücrelerinden 40 µL'yi, milimetrekare başına 500 hücrelik bir yüzey yoğunluğunda, mikrokanal girişlerinin etrafındaki soma bölmesine yükleyin. Hücreleri yüklerken PDMS cihaza dokunmamak önemlidir; çünkü bu durum, cihaz ile hücre kültürü plakası arasındaki sızdırmazlığın bozulmasına neden olabilir.

Bu mikroskobik görüntüler, kalsiyum am ile boyanmış nöron hücrelerini göstermektedir. Soma bölmesindeki hücreler, bölme içerisine homojen şekilde yüklenmiş olup mikroakışkan kanallara yakın konumlanmıştır. Hücrelerin alt tabakaya yapışmasını artırmak için, hücrelerin yüklendiği cihazları 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca inkübe edin.

Bu inkübasyonun ardından, tüm bölmeleri kültür medyumu ile doldurun. Cihazda büyüyen hücreleri, nemlendirilmiş %5CO2 inkübatörde 37 °C'de muhafaza edin ve her üç veya dört günde bir kültür medyumunun sadece yarısını değiştirin. Akson glia bölmeleri içinde yoğun bir aksonal ağ oluşmalıdır.

14 günlük kültürleme süresinin ardından, in vitro primer nöronların üzerine CLIA hücreleri eklenir; hücreler yüklenmeden önce kompartımanlardaki kültür ortamının yaklaşık %60'ı aspire edilir. Oligodendrositler, postnatal 1. veya 2. gündeki Sprague Dawley sıçanların serebral hemisferlerinden diseke edilmiştir. Her bir akson-glia kompartımanına, milimetrekare başına 1000 hücrelik bir areal yoğunlukta beş mikrolitre oligodendrosit hücresi ekleyin. Yükleme sırasında pipetle alt substrata dokunmamaya dikkat edilmelidir, çünkü bu durum substrat üzerinde oluşmuş olan aksonal ağa zarar verebilir. Oligodendrositlerin eklenmesinin ardından, hücreleri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin ve ardından kompartımanları doldurun.

Kültür ortamı ile nöronları, CLIA eklenmesinden önceki gibi kültüre etmeye devam edin; memeli merkezi sinir sistemi çalışılırken, iki hafta boyunca her üç veya dört günde bir kültür ortamının sadece yarısını değiştirin. Deneyler düzgün şekilde yürütüldüğünde akson-glia etkileşimi gerçekleşir. Soma bölmesine yüklenen nöron hücreleri mikrokanal girişlerinin yakınına yerleşir ve akson Ggl bölmeleri içerisinde bir aksonal tabaka oluşmaya başlar.

Bir haftalık kültürlemeden sonra, soma bölmesi içinde nöron hücresi agregasyonu belirtileri, oligodendrositler yüklendiğinde hücrelerin sağlıklı olmadığının bir göstergesi olabilir. İki haftalık nöron kültüründen sonra, akson ggl bölmeleri yoğun bir akson tabakasıyla kaplanmış olmalı ve oligodendrositler bu aksonal tabakanın üzerine yüklenmelidir. Size çok bölmeli nöro-ko kültür platformunun nasıl üretileceğini ve in vitro MSS nöroglia etkileşimlerini incelemek için nasıl kullanılacağını göstermiş olduk.

Bu prosedür uygulanırken, cihazların tozdan korunması ve bağlanma özelliğinin bozulmaması için etanol ile çok uzun süre sterilize edilmemesi gerektiği unutulmamalıdır. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.