Name: Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Öğrenin Saccharomyces cerevisiae maya hücrelerinden mitokondri saflaştırma yöntemini. Bu protokol, yüksek verimli ve saf mitokondri izolasyonu sağlayarak yapısal ve fonksiyonel bütünlüğü korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma CIHR ve Kanada NSERC hibe ile desteklendi. VIT CIHR Yeni Araştırmacı ve Genomik Concordia Üniversitesi Araştırma Başkanı, Hücre Biyolojisi ve Yaşlanma.

Gereç ve yöntem Maya suşları ve büyüme koşulları Yabani tip suşu BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) (% 1 maya özü,% 2 pepton,% 2 glukoz), zengin bir YEPD ortamda yetişmiştir . Hücreler, 30 ° C dönüş 05:01 &quot;balon hacim / orta hacimli&quot; oranı Erlenmeyer matara 200 rpm&#39;de sallayarak kültüre edildi. Ham mitokondrial fraksiyon izolasyonu <ol><li> 48 saat için 1 L yabani tip suşu BY4742 kültür büyütün </li><li> 500 ml Nalgene santrifüj tüplerine kültür dökün. 3000 xg&#39;de 5 dakika oda sıcaklığında santrifüj yoluyla yük ve hasat hücreleri Dengesi. </li><li> Durusu supernatant ve tekrar süspansiyon pelet hücreleri dH2O 250 ml. 3000 xg&#39;de 5 dakika oda sıcaklığında santrifüj yoluyla Pelet hücreleri. </li><li> Durusu supernatant ve tekrar süspansiyon pelet hücreleri dH2O 250 ml. 3000 xg&#39;de 5 dakika oda sıcaklığında santrifüj yoluyla Pelet hücreleri. </li><li> Hücre pelletini ıslak ağırlık belirleyin. </li><li> DTT tampon [2 ml tampon / g (ıslak ağırlık) hücreleri] pelet hücreleri tekrar </li><li> 50 ml Falcon plastik tüpler hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Tüpler, 30 ° C&#39;de 20 dakika için bir çalkalayıcı 70 rpm&#39;de Döndür </li><li> 3000 xg&#39;de 5 dakika oda sıcaklığında santrifüj Hasat hücreleri. </li><li> Zymolyase [tampon / g (ıslak ağırlık) hücreleri 7 ml] olmadan Zymolyase tampon pelet hücreleri tekrar </li><li> 3000 xg&#39;de 5 dakika oda sıcaklığında santrifüj yoluyla Pelet hücreleri. </li><li> Zymolyase [tampon / g (ıslak ağırlık) hücreleri 7 ml] olmadan Zymolyase tampon pelet hücreleri tekrar </li><li> Hücre süspansiyonu bir cam erlene aktarın. </li><li> Zymolyase-100T tozu ekleyin [1 mg Zymolyase-100T / g (ıslak ağırlık) hücrelerinin] hücre süspansiyonu. </li><li> , 30 ° C&#39;de 30 dakika için bir çalkalayıcı 70 rpm&#39;de hücre süspansiyonu ile şişesi döndürün </li><li> Transferi spheroplasts Zymolyase-100T için 50 ml plastik santrifüj tüplerine ile hücre duvarının sindirim nedeniyle kurdu. </li><li> Pelet 4 2200 xg&#39;de 8 dakika süreyle santrifüj spheroplasts ° C </li></ol> ** Sonraki tüm adımlar, 4 ° C veya buz üzerinde yapılmalıdır. Spheroplasts, Cezalar organelleri kırılma önlemek için kesme uçları ile hafifçe pipetler kullanarak ele alınmalıdır .** <ol start="18"><li> Buz gibi soğuk homojenizasyon tampon tampon / g (ıslak ağırlık) hücreleri 6,5 ml] pelet spheroplasts tekrar </li><li> Pelet 4 2200 xg&#39;de 8 dakika süreyle santrifüj spheroplasts ° C </li><li> Buz gibi soğuk homojenizasyon tampon tampon / g (ıslak ağırlık) hücreleri 6,5 ml] pelet spheroplasts tekrar </li><li> Buz cam homojenizatör önceden soğutulmuş hücreleri aktarın. </li><li> Sıkı bir havaneli kullanarak, havaneli 15 vuruş yaparak hücreleri homojenize. </li><li> Buz homojenizasyon tampon 1 hacim ekleyin. </li><li> 50 ml plastik santrifüj tüplerine homojenize spheroplasts aktarın. </li><li> Pelet 4 1500 xg&#39;de 5 dakika santrifüj kesintisiz hücreleri, çekirdek, büyük bir enkaz ° C </li><li> 4 3000 xg&#39;de 5 dakika süpernatant Santrifüj ° C. </li><li> 4 ° C&#39;de xg 12000 az 15 dakika boyunca ortaya çıkan süpernatant Santrifüj </li><li> Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet buz homojenizasyon tampon tampon / g (ıslak ağırlık) hücreleri 6,5 ml. </li><li> 3000 xg&#39;de 5 dakika santrifüj 4 ° C </li><li> 4 ° C&#39;de xg 12000 az 15 dakika boyunca ortaya çıkan süpernatant Santrifüj </li><li> Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet buz SEM tampon 3 ml. </li></ol> ** Bu süspansiyon mitokondri zenginleştirilmiş olmasına rağmen, aynı zamanda (mikrozomları) endoplazmik retikulum, golgi ve vakuollerde gibi diğer organelleri içerir. Saf mitokondri almak için, bu ham mitokondrial fraksiyon aşağıda açıklandığı gibi, daha fazla fraksiyonasyon tabi olabilir .** Kontaminasyon mitokondri yoksun diğer organellerin saflaştırılması <ol><li> Beckman Ultra Clear santrifüj tüpü içine EM tamponunda% 60 buz koyun 1,5 ml sakkaroz (w / v). </li><li> Yerleşimi% 60 (w / v) 4 ml% 32 ile sakaroz, 1.5 ml% 23,% 15 sakaroz (EM wt / v tampon) 1,5 ml. </li><li> 3 ml,% 15 (w / v) sakaroz üst SEM tampon ham mitokondriyal fraksiyonu yerleştirin. </li><li> 4 134000 xg (33000 rpm) 1 saat ° C Beckman SW41 Ti sallanan kovalı rotor içinde Santrifüj </li><li> % 60 /% 32 sakaroz arayüzü sağlam mitokondri formu kahverengi bir bant. </li><li> Mitokondriyal bant ulaşana kadar dikkatlice sakaroz çıkarın. </li><li> Bir kesim ucu ile bir pipet kullanarak mitokondriyal bandı çıkarın ve bir MLS-5 rotor için bir Beckman santrifüj tüpü içine yerleştirin. </li><li> SEM tamponu ile tüp doldurun. </li><li> Pelet, 4, 30 dakika süreyle 10000 xg (31000 rpm) &#39;de 30 dakika süreyle bir MLS-5 rotor santrifüj saf mitokondri ° C </li><li> Kullanarak Durusu süpernatantbir pipetle. </li><li> Mitokondriyal fonksiyonları, mitokondriyal proteom ve lipidome ve mitokondriyal DNA analizi için saf mitokondri kullanın. </li></ol> Reaktifler <ol><li> DTT tampon [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9.4), 10 mM dithiothreitol] (15 ml için) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1,5 ml 1 M Tris/H2SO4 tampon (pH 9.4) </li><li> 1 M DTT 150 ul </li><li> 15 ml hacim </li></ul></li><li> Zymolyase tampon [20 mM potasyum fosfat (pH 7.4), sorbitol 1,2 M] (100 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2 ml 1 M potasyum fosfat tamponu (pH 7.4) </li><li> Sorbitol 2 M 60 ml </li><li> 100 ml hacim </li></ul></li><li> Homojenizasyon tampon [10 mM Tris / HCl (pH 7.4), 0.6 M sorbitol, 1 mM EDTA,% 0.2 (w / v) BSA] (250 ml.] <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 M Tris / HCl tamponu (pH 7.4) 2.5 ml </li><li> Sorbitol 2 M 75 ml </li><li> 500 mM EDTA 500 ul </li><li> BSA 0.5 g </li><li> 250 ml hacim </li></ul></li><li> SEM tampon [10 mM MOPS / KOH (pH 7.2), 250 mM sukroz, 1 mM EDTA] (250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 M MOPS / KOH tamponu (pH 7.2) 2.5 ml </li><li> 31.25 ml 2 M sakkaroz </li><li> 500 mM EDTA 500 ul </li><li> 250 ml hacim </li></ul></li><li> EM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA] (250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 M MOPS / KOH tamponu (pH 7.2) 2.5 ml </li><li> 500 mM EDTA 500 ul </li><li> 250 ml hacim </li></ul></li></ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu yöntem, maya hücreleri saf mitokondri yüksek verimli izolasyon sağlar. Bu yöntemi ile saflaştırılmış Mitokondri kontaminasyon diğer organellerin aslında ücretsiz ve kendi arıtma sonrası yapısal ve fonksiyonel bütünlüğünü korumak. Temel mitokondriyal süreçlerin hücre sulandırıldıktan için uygun olan mitokondri açıklanan yöntem verim. Bu son derece saf mitokondri mitokondriyal yapı ve işlevleri, mitokondriyal proteom ve lipidome ve mitokondriyal DNA analizi için de kullanılabilir.

maya hücreleri mitokondri saflaştırılması

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitokondri, ATP üretimi ana site ökaryotik olmayan fotosentetik hücrelerde aerobik metabolizma sırasında<sup&gt; 1</sup&gt;. Bu kompleks organellere apoptotik hücre ölümü de önemli rol oynamaktadır<sup&gt; 2</sup&gt; Hücre sağkalım<sup&gt; 3</sup&gt; Memeli gelişme<sup&gt; 4</sup&gt; Nöronal gelişimi ve işlevi<sup&gt; 4</sup&gt;, Hücre içi sinyal<sup&gt; 5</sup&gt; Ve uzun ömürlü düzenleme<sup&gt; 6</sup&gt;. Mitokondri tarafından kontrol edilen bu karmaşık biyolojik süreçlerin anlayışımız, morfoloji, protein ve lipid bileşimi, onların DNA bütünlüğünü ve sayısız hayati fonksiyonlarını değerlendirmek için sağlam yöntemler dayanmaktadır. Maya<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Açıklamalı genomu ve iyi tanımlanmış proteom, genetik ve biyokimyasal manipulable tek hücreli ökaryot mitokondri temel biyolojik fonksiyonları altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları çalışmak için değerli bir model. Bu tür çalışmalar için, son derece saf mitokondri sahip olmak çok önemlidir. Burada mitokondri maya arıtma için hızlı ve etkili bir yöntemin ayrıntılı bir açıklama mevcut. Bu yöntem aslında diğer organeller tarafından kontaminasyon ücretsiz ve kendi arıtma sonrası yapısal ve işlevsel bütünlüğü korumak son derece saf mitokondri izolasyonu sağlar. Bu yöntem ile arındırılmış Mitokondri hücre sulandırıldıktan temel mitokondriyal süreçleri için uygundur ve mitokondriyal yapı ve işlevleri, mitokondriyal proteom ve lipidome ve mitokondriyal DNA analizi için kullanılabilir.

Biz maya mitokondri arıtma için hızlı ve etkili bir yöntem tarif<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Bu yöntem aslında diğer organeller tarafından kontaminasyon ücretsiz ve kendi arıtma sonrası yapısal ve fonksiyonel bütünlüğünü korumak saf mitokondri yüksek verimli izolasyon sağlar.

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Mitokondriler, ökaryotik fotosentez yapmayan hücrelerde aerobik metabolizma sırasında ATP üretiminin ana merkezidir1. Bu kompleks organeller aynı zamanda ...

Bu protokol, hücre duvarının simul liase ile sindirilerek maya hücrelerinin sferoplastlara dönüştürülmesiyle başlar; ardından sferoplastlar cam Teflon homogenizatör kullanılarak homogenize edilir. Elde edilen homogenat, bozulmamış hücreleri, çekirdekleri ve büyük kalıntıları çöktürmek amacıyla iki kez santrifüj işlemine tabi tutulur. Sonrasında, mitokondrileri çöktürmek için elde edilen süpernatant 12.000 Gs'de 15 dakika boyunca santrifüj edilir.Son olarak, hâlâ diğer organelleri içeren ham mitokondriyal fraksiyon, bir sükroz yoğunluk gradyanında 134,000 Gs'de 60 dakika boyunca santrifüj işlemine tabi tutulur; diğer organeller tarafından kontamine edilmemiş saf mitokondriler, %60 ağırlık/hacim ve %32 ağırlık/hacim sükrozun ara yüzeyinde geri kazanılır. Merhaba, ben Concordia Üniversitesi biyoloji bölümündeki Dr. Vladimir Tko laboratuvarından Dr. Christopher Greg. Bugün size, yeast scro mysia'dan mitokondrilerin nasıl izole edileceğini göstereceğim.Bunu, mitokondrilerde meydana gelen dinamikleri ve yaşa bağlı değişiklikleri incelemek için yapıyoruz. Hücreler yaşlandıkça, mitokondrinin proteomundaki, lipidomundaki ve DNA'sındaki değişikliklere bakacağız. Öyleyse başlayalım.Bu protokole, maya suşunu on adet 250 ml'lik erlenlerde büyüterek başlayın. Her bir erlen 30 °C'de, 48 saat boyunca rotasyonel çalkalamalı olarak 50 ml YP medium içermelidir. Ardından, kültürü 500 ml'lik Nalgene santrifüj tüplerine aktarın.Hücreleri oda sıcaklığında, 3000 Gs'de beş dakika santrifüjleyerek hasat edin, süpernatantı dökün ve çökelen hücreleri 250 mililitre distile su içinde yeniden süspanse edin; hücreleri oda sıcaklığında, 3000 Gs'de beş dakika santrifüjleyin. Bu adımı tekrarlayın; çökelen hücreleri 250 mililitre distile su içinde yeniden süspanse edin ve beş dakika santrifüjleyin.Oda sıcaklığında 3000 Gs'de, elde edilen ıslak hücre peletini tartın, ardından peletlenmiş hücreleri DTT tamponu içinde yeniden süspanse ederek hücre süspansiyonunu 250 mililitrelik bir erlene aktarın. Erleni 30 °C'de 70 RPM'de 20 dakika boyunca döndürün. 20 dakikanın ardından, hücreleri oda sıcaklığında 3000 Gs'de beş dakika santrifüj ederek hasat edin, peletlenmiş hücreleri Xs içermeyen Xs tamponunda yeniden süspanse edin ve beş dakika boyunca santrifüjleyin.Oda sıcaklığında 3000 G'de, çöktürülmüş hücreleri Xs olmadan Zy tamponuyla tekrar süspande edin ve hücre süspansiyonunu cam bir erlene aktarın. Hücre süspansiyonuna zy liase 100 T tozunu ekleyin ve 30 °C'lik bir çalkalayıcıda 70 RPM'de 30 dakika boyunca döndürün; Zy liase 100 T, hücre duvarlarını sindirerek Sferoplastlar oluşturacaktır. Daha önce gösterilen X sindirimini takip eden tüm adımlar dört °C'de veya buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.Organellerin parçalanmasını önlemek için splat süspansiyonları, uçları kesilmiş pipetler kullanılarak nazikçe taşınmalıdır. 30 dakikalık XMO sindirimi tamamlandığında, Sphero platları 50 mililitrelik plastik santrifüj tüplerine aktarın; dört derece Celsius'ta 2200 Gs'de sekiz dakika santrifüjleyin. Çöken S splatları buz gibi soğuk homojenizasyon tamponuyla yeniden süspanse edin. S splatlarını dört derece Celsius'ta 2200 Gs'de sekiz dakika santrifüjleyin.Peletlenmiş sferoplastları buz üzerinde soğuk homojenizasyon tamponu ile yeniden süspande edin ve hücreleri önceden soğutulmuş bir cam homojenizatöre aktarın. Sıkı bir havan eli kullanarak, havan eli ile 15 kez hareket yaptırarak hücreleri homojenize edin.Homojenize edilmiş S splatlarına, eşit hacimde buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu ekleyin ve bunları 50 mililitrelik plastik santrifüj tüplerine aktarın. Parçalanmamış hücreleri, çekirdekleri ve büyük kalıntıları çöktürmek için homojenize edilmiş splatları dört santigrat derecede, 1500 Gs hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Elde edilen süpernatantı yeni tüplere boşaltın ve beş dakika boyunca santrifüjleyin.4 °C'de 3000 Gs'de santrifüjleyin. Bu santrifüj işleminin ardından, elde edilen süpernatantı 4 °C'de 12.000 Gs'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı dökün ve pelleti buz soğukluğundaki homojenizasyon tamponunda yeniden süspanse edin.Yeniden süspanse edilen peleti beş dakika boyunca 4 °C'de 3000 Gs'de santrifüjleyin. Son olarak, elde edilen süpernatantı 15 dakika boyunca 4 °C'de 12.000 Gs'de santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve peleti üç mililitre buz gibi soğuk çözeltide yeniden süspande edin.SEM tamponu. Bu süspansiyon, ham mitokondriyal fraksiyondur. Mitokondri açısından zenginleştirilmiş olsa da, saf mitokondri elde etmek için endoplazmik retikulum veya mikrozomlar, GOGI ve VAs gibi diğer organelleri de içerir.Süspansiyon, bir sonraki bölümde açıklandığı şekilde daha fazla fraksiyona tabi tutulacaktır. Saf mitokondriler elde etmek için ham mitokondriyal süspansiyonun fraksiyonlamasına başlamak için, 1,5 mililitre buz gibi soğuk, ağırlık/hacim cinsinden %60 sakkaroz içeren em tamponunu bir Beckman UltraClear santrifüj tüpüne yerleştirin.Ardından, %60 sukrozun üzerine yavaşça dört mililitre %32 sukroz, 1,5 mililitre %23 sukroz ve 1,5 mililitre %15 sukroz ekleyin (tümlemleri ağırlık/hacim oranında em. Buffer şeklinde). SEM tamponu içindeki üç mililitrelik ham mitokondriyal fraksiyonu, %15 ağırlık/hacim oranındaki sukrozun üzerine yerleştirin. Karışımı, Beckman SW 41 TI salınımlı kova rotorunda, 4 °C'de, bir saat boyunca 134.000 G veya 33.000 RPM hızda santrifüj edin.Santrifüjasyon sonrası, sağlam mitokondriler %60 ile %32 sükroz ara yüzeyinde kahverengi bir bant oluşturacaktır. Ucu kesilmiş bir pipet kullanarak sükrozu, mitokondri bandına ulaşana kadar dikkatlice çekin, mitokondri bandını alın ve bir Beckman santrifüj tüpüne yerleştirin. MLS beşli rotor için, tüpü SEM tamponuyla doldurun, saf mitokondrileri MLS beşli rotorda 4 °C'de 30 dakika boyunca 10,000 g veya 31,000 RPM'de santrifüj ederek çöktürün ve süpernatantı uzaklaştırın.Bu saf mitokondriler artık mitokondriyal fonksiyonların, mitokondriyal proteomun, lipidlerin ve mitokondriyal DNA'nın analizleri için kullanılabilir. Sol şeritlerdeki ham mitokondriyal fraksiyon ve sağ şeritlerde sükroz yoğunluk gradyanı santrifügasyonu ile saflaştırılmış mitokondriler, SDS-PAGE'e ve çeşitli organellerin protein markerlarına karşı antikorlarla immünoblotlamaya tabi tutulmuştur. Her iki preparasyonda da mitokondrilerin varlığı PO1p ve COX1p immünoreaktivitesi ile doğrulanmıştır; immünoblotlama ise ham mitokondriyal fraksiyonda sırasıyla endoplazmik retikulum, veziküler ve Golgi proteinlerini temsil eden DPM1p, FO13p ve VPS10p'nin varlığını göstermiştir.Buna karşılık, bu marker proteinler saflaştırılmış mitokondrilerde tespit edilmemiştir; bu durum, protokolün diğer organellerden kontaminasyon içermeyen mitokondriler sağladığını doğrulamaktadır. Böylece, yeast sace visier'den mitokondrilerin nasıl izole edileceğini göstermiş olduk. Bu deneyi gerçekleştirirken, hücrelerin zy lies 100 T içinde yarım saatten fazla inkübe edilmemesine dikkat edin; aksi takdirde hücrelerde bulunabilecek membran proteinlerinin veya organel proteinlerinin degrade olma riski oluşabilir.Bu durum, reajanda bulunan proteazlardan kaynaklanıyor olabilir. Ayrıca, mitokondrileri izole edip sakroz gradyanını hazırlayacağınız zaman, bu işlemi yapmadan önce mitokondrileri -20 °C'de dondurabilir ve ardından santrifüj aşamasını gerçekleştirmeye hazır olduğunuzda çözdürebilirsiniz. İşte bu kadar.Deneylerinizde başarılar dileriz.

purification-of-mitochondria-from-yeast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ortak arıtma nükleazlar ve proteazlar tarafından geleneksel yöntemlerle saflaştırılmış ökaryotik ribozomlar hazırlıkları kontaminasyonu mansap biyokimyasal ve yapısal analizleri olumsuz etkiler. Maya ribozomlar bir model sistem olarak kullanarak bu sorunu çözmek için basit ve hızlı bir kromatografik saflaştırma yöntemi kullanılır.

Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma

Mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA'lar mitokondri dış membran ile ilişkilidir. Biz ilişkili mRNA'lardan ve ribozomlarla maya mitokondri izolasyonu amaçlayan bir hücre altı bölme prosedürü tarif. Bu protokol, mRNA lokalizasyonu mekanizmaları ve mitokondri yakın olarak lokalize çeviri ortaya çıkarmak için çeşitli koşullar altında yetiştirilen hücreler uygulanabilir.

Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

Burada hızlı, solubilize ve birçok ökaryotik Bor taşıyıcılar homoloji Maya kullanarak SLC4 taşıyıcı ailesi ile arındırmak için bir protokol mevcut. Ayrıca saf homomeric protein multimeric derleme için değerlendirmek için bir kimyasal cross-linking tahlil açıklar. Bu protokoller için zorlu diğer membran proteinlerinin adapte edilebilir.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

Baker mayası mitokondriyal genom sekiz polipeptid kodlar. Mevcut protokolün amacı, hepsini etiketlemek ve daha sonra bunları ayrı bantlar olarak görselleştirmektir.

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Proteom ölçeğinde protein keşfi ve nicelleştirmesi ile uyumlu yüksek kaliteli mitokondri izolasyonu için iki aşamalı bir protokol sunuyoruz. Protokolümüz genetik mühendisliği gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir birincil hücre ve dokudan mitokondri incelemek için uygundur.

Gelişmiş protein keşfi ve nicelleştirme için mitokondrinin iki aşamalı etiketsiz izolasyonu

Mitokondriyal temas bölgeleri, mitokondriyal iç ve dış zar proteinleri ile etkileşime giren protein kompleksleridir. Bu bölgeler, mitokondriyal membranlar arasındaki ve dolayısıyla sitozol ile mitokondriyal matris arasındaki iletişim için gereklidir. Burada, bu spesifik protein sınıfına uygun adayları belirlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Bu çalışma, maya mitokondrisinin biyolistik bir yöntem kullanılarak nasıl dönüştürüleceğini açıklamaktadır. Ayrıca, transformantların nasıl seçileceğini ve saflaştırılacağını ve mitokondriyal genom içinde hedef pozisyonda istenen mutasyonun nasıl tanıtılacağını da gösteriyoruz.

Baker'da Mitokondriyal Dönüşüm

Maya bütün hücrelerinde mitokondriyal solunum, hücre biyoenerjiğinin değerli bir göstergesidir. Burada, farklı maya türleri için geçerli olan bu fenotipi ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Maya Bütün Hücrelerinde Mitokondriyal Solunum Miktar Tayini

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe , mitokondriyi incelemek için çekici bir model olarak ortaya çıkıyor. Burada, S. pombe'deki mitokondriyal solunum komplekslerinin bolluğunu ve montajını analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu, korunmuş genlerin mitokondriyal solunum zincirindeki yeni işlevlerinin karakterizasyonunu sağlar.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe'deki mitokondriyal solunum zinciri proteinlerinin ekspresyon ve kompleks montajının analizi

Öğrenin Saccharomyces cerevisiae maya hücrelerinden mitokondri saflaştırma yöntemini. Bu protokol, yüksek verimli ve saf mitokondri izolasyonu sağlayarak yapısal ve fonksiyonel bütünlüğü korur.

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Daha fazla video keşfet