Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Bu prosedür, tek hücreli zebra balığı embriyolarının bir mikroenjeksiyon plakasına dizilmesiyle başlar. Vitelluse floresan dekstrin çözeltisi mikroenjekte edin. Enjekte edilen hücrelerin hemen altındaki embriyolar, transplant donörlerinizdir.

Donör ve konak embriyoları kaplayın ve kalkan evresine kadar büyütün; DEC kaplı dekstrin enjekte edilmiş iki embriyoyu bir transplantasyon plağının tek bir kuyucuğuna yan yana yerleştirin. Bu işlemi her donör çifti için aşağıda tekrarlayın. Hücrelerin ön beynin gelecekteki diensefalon bölgesine transplantasyonu için her kuyucuğa bir konak embriyo ekleyin; hücreleri orta hat üzerinden transplantasyon bölgesine ve oradan dışarıya taşıyın.

Hayvan kutbu ile kalkanın tam ortası. Donör gaza'dan konak Gasa'ya hücre nakledin. 30 saate kadar büyütüp fikse edin.

Gerektiğinde immünokimya uygulayın, örneği hazırlayın ve görüntüleyin. Alternatif olarak, konakçıyı canlı olarak hazırlayın ve zaman ayarlı (time lapse) görüntüleme yapın. Merhaba, ben Northampton, Massachusetts'teki Smith College Biyolojik Bilimler Bölümü'nde Dr. Michael ESI'nin laboratuvarından Elizabeth De Shane.

Ben laboratuvarın baş araştırmacısı Dr. Michael Besi. Bugün size, zebrafish model sistemini kullanarak gastrula evresi hücre transplantasyonları yoluyla kimera embriyoların nasıl oluşturulacağını göstereceğiz. Laboratuvarımda bu prosedürü, belirli genlerin ön beyin komissür gelişimindeki işlevlerinin yanı sıra komissür oluşumu sırasındaki akson-glia etkileşimleri sürecini incelemek için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Başlangıç olarak, üç adet bir milimetrelik, dört inç uzunluğunda filamantsiz kapileri dikkatlice ortadan ikiye bölerek mikroenjeksiyon plakaları için oluk kalıplarını hazırlayın. Süper yapıştırıcı kullanarak, kapiler yarımlarından ikisini düz bir yüzey üzerine yan yana yapıştırın.

Bu ikisinin üzerine üçüncü kılcal boruyu yerleştirip oluğa oturtarak piramit şekli oluşturun. Üç kılcal boru varken kalıbın kurumasına izin verin. Her bir enjeksiyon plakası için yaklaşık üç ila beş kalıp hazırlamalısınız.

Ardından, 100 milimetrelik bir Petri kabına 20 ila 25 mililitre erimiş %1,5 aros embriyo ortamı dökerek enjeksiyon plakalarını hazırlayın. Hazırlanan oluk kalıplarından üç ila beşi, kalıbın düz tarafının Petri kabının tabanına değdiğinden ve tamamen aros ile kaplandığından emin olarak hemen plağın tabanına yerleştirin. Aros katılaştığında, kalıpları içeren geniş bir aros karesini kesip çıkararak oluk kalıplarını yerinden çıkarın.

Kesilen karenin çevresindeki agarı nazikçe yerinden çıkarın ve atın. Kare agar parçasını ters çevirin ve ince pens kullanarak oluk kalıplarını tamamen çıkarın. Yeni şekillendirilmiş kuyucukları sabitlemek için Petri kabındaki karenin etrafına ergimiş agar dökün.

Kurumaya bırakın. Plakalar parafilm ile mühürlenebilir ve dört derece Celsius'ta haftalarca saklanabilir. Agar içerisinde herhangi bir üreme belirtisi varsa plakalar atılmalıdır.

Son olarak, enjeksiyon iğnelerini hazırlamak için, mikroenjeksiyon plakası ve iğneler hazır hale getirilene kadar, iç filamentli bir milimetre dört inçlik cam kapilerlerden iğneler oluşturmak amacıyla bir mikro pipet kapiler çekici kullanın. Şimdi embriyoların toplanmasına ve mikroenjeksiyon düzeneğinin kurulmasına bakalım. Döllenmiş yumurtalar, yumurtlama işleminin hemen ardından toplanır ve embriyo medyumu ile doldurulmuş bir Petri kabında muhafaza edilir.

Geniş uçlu bir cam pipet kullanarak embriyoları, embriyo medyumu ile doldurulmuş oda sıcaklığındaki bir enjeksiyon plakasının kuyucuklarına aktarın. Embriyoları olukların tabanına nazikçe yerleştirmek için kilitli küt uçlu pens kullanın; koriyonu veya vitellusu hasar görmüş embriyolar elenmelidir.

Ardından, enjeksiyon iğnesini bir ila iki µL seyreltilmiş floresan Alexa 594 dekstrin çözeltisi ile doldurun. Dekstrinin kılcal hareketle enjeksiyon iğnesinin ucuna kadar ilerlemesini bekleyin. Enjeksiyon iğnesini bir stereotaktik mikro manipülatörün kapiler tutucusuna takın ve başlangıç için mikro enjektör cihazındaki basıncı ayarlayın.

40 ila 50 PSI ve 500 milisaniyelik bir darbe süresi. Enjeksiyon iğnesinin ucundaki mühürü kırmak için bir pens yardımıyla ucunu hafifçe sıyırın veya kesin. İdeal olarak, çap 0,05 ila 0,15 milimetre olmalıdır.

İğneyi kalibre etmek için bir stereo mikroskop kullanın ve dekstrini, üzerine mineral yağ eklenmiş bir mikrometre üzerine püskürtün. Pulsun hava basıncı süresini ve iğne boyutunu ayarlayarak bolus boyutunu değiştirin. İpucu. Enjeksiyonlar boyunca 0.8 ile 1 nanolitre hacme eşdeğer bir bolus boyutu korunmalıdır.

Artık bir stereo mikroskopta yaklaşık 3.2x büyütme kullanarak dekstrin mikroenjeksiyonuna başlayabiliriz. Embriyo enjeksiyonlarına, korion ve hücre membranını yumurtaya girmek için yumuşakça delerek oluğun bir ucundan başlayın. Dekstrin çözeltisini hücrenin hemen altına enjekte edin.

Enjeksiyon iğnesini, embriyoya girerken kullanılan yumuşak hareketin aynısıyla çıkardığınızdan emin olun. Sıradaki embriyoyu konumlandırmak için Petri kabını hareket ettirin ve oluğun uzunluğu boyunca enjeksiyona devam edin. Basıncı ve bolus boyutunu periyodik olarak kontrol edin.

Şimdi, embriyoları oluklardan nazikçe itmek için pens kullanın. Embriyoları antibiyotikli embriyo besiyeri ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Embriyoları 28,5 °C'de inkübe edin ve döllenmemiş yumurtalar veya ölümler açısından takip edin.

Embriyolar artık gelecekteki transplantasyonlar için hazırdır. Polinizasyon tamamlanmadan önce, vitellüsün bazı kısımları açıkta kalır. Vitellüs son derece hassastır ve Petri kabının plastiğine yapışarak kolayca yırtılabilir.

Bu nedenle, transplantasyonlar gerçekleşmeden bir gün önce embriyolar kaplamalı plakalar üzerine yerleştirilmelidir. Bu dekorasyon plakalarını, bir 100 milimetrelik Petri kabına beş ila 10 mililitre erimiş agaroz dökerek hazırlayın. Dekorasyon sırasında embriyoları desteklemek için yaklaşık iki ila üç milimetrelik ince bir agaroz tabakası yeterlidir.

Plakaların soğumasını bekleyin. Ardından, 100 mm'lik bir Petri kabına 30 ml %1,5'lik agar çözeltisi dökerek ve bir nakil kuyucuğu kalıbı yerleştirerek ayrı nakil plakaları hazırlayın. Kalıp, her biri üç adet 90 derecelik kenar ve bir adet 45 derecelik açılı kenardan oluşan 104 adet üçgen oyuk içermelidir.

Kuyucuklar, iki embriyoyu yan yana tutacak şekilde tasarlanmıştır. Kalıbın altında hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin ve agrozun sertleşmesini bekleyin. Kalıp çıkarıldığında, eğimli kenarlara sahip kare kuyucukların bulunduğu çökük bir alan ortaya çıkar.

Konakçı ve donör embriyoları transplantasyona hazırlamak için, yaşa yakın eşleşmeler sağlamak amacıyla gelişimlerinin izlenmesi gerekir. Bunu yapmak için embriyolar, gelişimi yavaşlatmak veya hızlandırmak amacıyla 23 ile 31 degrees Celsius arasında değişen sıcaklıklarda yetiştirilebilir. Hem konakçı hem de donör embriyolar, istenen yaştan bir saat önce kaplanmış bir kaplama plakası üzerinde elle kaplanmalıdır.

Gastrula evresi nakilleri söz konusu olduğunda, işlemin döllenmeden sonraki beşinci saate kadar veya kalkan evresinden önceki 5.5 HPF'ye kadar tamamlanması gerekir. Konak ve donör embriyoları, antibiyotikli embriyo ortamı ile doldurulmuş bir nakil plakasına yüklemek için cam bir pipet kullanın. Burada ilk sıra, kuyucuk başına iki embriyo olacak şekilde donör embriyolarla; takip eden iki sıra ise kuyucuk başına tek bir konak embriyo olacak şekilde doldurulur.

Nakiller için, tamamen otomatik joystick kontrollü zoom ve odaklama manipülasyonuna sahip bir Zeiss luer floresan stereo mikroskop kullanıyoruz. Bu otomatik mikroskop gerekli olmasa da, özellikle çok sayıda nakil istendiğinde, bu hassas cerrahi nakillerin kolaylığını ve verimliliğini önemli ölçüde artırır. Nakil düzeneğini kurmak için, einor hava tramvayını ölçeğinin orta konumuna getirin, hava tramvayı tüpünü kapiler tutucuya bağlayın ve tutucuyu einor otomatik mikro manipülatöre sabitleyin. Embriyolar ve nakil düzeneği hazırlandıktan sonra, gastro evre hücre nakillerine geçebiliriz.

Gastrula evresi hücre nakillerini tamamlamadaki en kritik beceri, zebrafishlerde kalkan (shield) olarak da bilinen dorsal blast APO lip'in hücresel anatomisini tanıma yeteneğidir. Burada, gastrulanın farklı bakış açılarından çekilmiş bir dizi görüntüsünü sunuyoruz ve kalkanın bu yan görünümde nerede yer aldığını vurguluyoruz. Kalkan veya dorsal taraf, ön beyne nakledilecek hücrelerin hedeflendiği ve orta hatta yönlendirildiği kırmızı ana hattın sağ tarafında yer almaktadır.

Hayvan kutbu ile kalkanın tam ortasından başlayarak, önce hayvan kutbunu görmek için embriyoyu size doğru döndüreceğiz; bu sırada kalkan ve transplant bölgesi belirginleştirilecektir. Ardından, kalkanı alt konuma getirmek için embriyo kendi ekseni etrafında döner. Gastrula şimdi tekrar yukarı doğru dönerek size doğrudan bir dorsal görünüm sunar.

Embriyo şimdi sırasıyla altı HPF'deki lateral görünüme geri döndürülür. Mikro manipülatörü kullanarak, embriyoyu hücre ekstraksiyonu için uygun bir konuma getirmek amacıyla kılcal borunun ucuyla nazikçe dokunun; böylece orta hattı ve kalkanı görünür olmalı ve kılcal borunun ucuna karşı konumlanmalıdır. Donör embriyolar, aydınlatma parlak alanlıdan floresan aydınlatmaya geçilerek kolayca doğrulanır. Burada gastrula hücreleri kırmızı floresan verir. Hücrelerin onlara zarar verecek olan hava-su ara yüzeyine temas etme olasılığını ortadan kaldırmak için kılcal boruya az miktarda embriyo medyumu aspire edin.

Donör embriyonun ektodermini, hayvan kutbu ile kalkanın tam ortasındaki orta hat boyunca nazikçe delin. Gasa örneğinde, yüzey ektodermi ile altındaki vitellus arasında yalnızca yaklaşık 20 mikrometre hücre bulunmaktaydı. Bu nedenle vitellusa saplamamaya dikkat edin, çünkü bu durum genellikle birkaç saat içinde ölümle sonuçlanır.

Hava tramini kullanarak hücreleri yavaşça kapiler içine aspire edin. Ucu hafifçe çalkalayarak su hattının görünürlüğünü daima koruyun. Donörün içindeyken yapılacak bu işlem, hücreler arası temasların gevşemesine yardımcı olacaktır.

Donör embriyodan yaklaşık 10 ila 50 hücre çıkarılmalıdır. Ardından, kapiler donörden geri çekilir. Konak embriyo benzer şekilde yönlendirilir ve hücreler konak embriyonun tam olarak aynı konumuna enjekte edilerek boşaltılır; aydınlatmanın parlak alan modundan floresan moduna geçirilmesi, kapiler iğne içindeki dekstrin işaretli hücrelerin konak embriyoya hareketini ortaya çıkarır.

Son olarak, transplantasyon sonrası donör ve konak embriyoları kuyucuklardan çıkarın. Embriyoları birbirinden ayırın ve antibiyotikli embriyo ortamı ile doldurulmuş, A kaplı bir Petri kabına nazikçe yerleştirin. Transplantasyon işlemi tamamlandığında embriyoları 28.5 °C'de inkübe edin.

Görselleştirme ve görüntüleme işlemine başlayalım. Embriyolar, görüntüleme için uygun evredeyken, immünokimya ile doğrulanmış bir koruyucu içerisinde fikse edilerek işleme başlanır. Bizim durumumuzda bu işlem, oda sıcaklığında iki saat boyunca veya dört derece Celsius'ta gece boyunca döndürülerek %4 formaldehit içerisinde gerçekleştirilir.

Ardından, fikse edilmiş embriyoları iki kez durulayın ve ardından üç ila beş dakika boyunca yıkayın. 0.1 molar pb içerisinde. Gerekiyorsa uygun immün işaretleme işlemini gerçekleştirin.

Embriyoları %75 gliserole yerleştirin, oda sıcaklığında çöktürün ve 4 °C'de saklayın. Bir lam üzerine, bir karenin iç çapına uygun iki adet vazelin kare çerçeve oluşturarak iki embriyoyu monte etmek için lamı hazırlayın. Embriyonun üzerine lameli kapatın ve ön beynin frontal görünümünü elde etmek için gerekli diseksiyonları gerçekleştirin.

Orta beyni dikine keserek ön beyni ayırın. Bu dokuyu, minimum miktarda gliserol ile birlikte petrol jeline yerleştirin. Dokuyu uygun konuma iyi şekilde yönlendirin ve örneğin üzerine bir lameli kapatın.

Alternatif olarak, canlı embriyolar için bunları %0,75'lik agro çözeltisi ile cam tabanlı kültür kaplarına monte edin. Agro katılaşmadan önce, embriyoyu görüntüleme için uygun yönlendirmeye getirmek amacıyla bir tungsten iğne kullanın. Hem fikse edilmiş hem de canlı konaklar görüntülenir.

Leica SP beş lazerli taramalı konfokal mikroskop kullanılarak Z-serileri elde edilir ve embriyo içindeki astroglial popülasyonun bir kısmının genotip veya fenotip açısından farklı olduğu kimera embriyolar oluşturmak için velocity yazılımı ile üç veya dört boyutlu görüntü işleme gerçekleştirilir. Astroglianın işaretlenmesi için GFP transgenik embriyoların kullanımı ile klonlarımızı özellikle sefalona yönlendirmek için gastro evrelemiş hücre transplantasyonunun kullanımını birleştiren çok yönlü bir yaklaşım uyguladık. Hücreleri, hayvan kutbu ile kalkanın tam orta noktasındaki orta hattan seçici olarak çıkarmak için zebra balığı gastro kader haritasını kullandık.

Ekstrakte edilen bu hücreler daha sonra yabani tip bir konak gasa'nın aynı bölgesine nakledilmiş, ardından konak 30 HPF'ye kadar büyütülmüş ve ön beyin anatomisi için referans işaretçiler olan tüm aksonlar için immün markalanmıştır. Burada gösterilen örnekte, bir konak embriyosunun konfokal görüntülemesi, sefalon ve sefalon boyunca izole GFP pozitif hücreleri ortaya çıkarmaktadır. Bu GFP pozitif hücrelerin tam morfolojisi, bu klonal analizde gözlemlenebilir ve bu hücrelerin çoğunun, somanın ventriküler zonun bitişiğinde yer aldığı ve geniş bir uç ayağın radyal bir prosesi korteks yüzeyinde sonlandırdığı karakteristik radyal glial morfolojiyi benimsediği görülmektedir.

Toplanan bu optik kesitlerin üç boyutlu oluşturulması, bu hücrelerin işaretlenmiş aksonlara göre konumunu açıkça göstermektedir. Nakledilen hücreleri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir diğer yaklaşım da, başlangıçta tek hücre evresindeki yabanıl tip veya GFP transgenik bir embriyonun vitellusu içerisine floresan bir hücre soyu boyası mikroenjekte etmektir. Bu örnekte, yabanıl tip embriyolara Alexa 5 94 dekstrin enjekte ettik.

Tek hücreli evredeyken, kalkan evresi gastrula aşamasına gelmelerine izin verdik ve ardından yukarıda belirtildiği gibi dört beyin hedefli transplantasyon gerçekleştirdik. Ancak bunun yerine, döner hücreleri transjenik konak gastrulanın dorsal sefalonuna transplant ederek lazer tarama konfokal mikroskobu ile görüntüleme yaptık. Konfokal mikroskopi, ön beyin içerisindeki GFP pozitif çekirdekler arasında donör hücrelerden oluşan floresan kırmızı kümeleri ortaya çıkardı.

Lazer taramalı konfokal mikroskop ile iki saat boyunca her üç dakikada bir Z-yığınları (Z-stacks) toplayarak bu konakçıyı daha ayrıntılı analiz ettik. IMP tarafından sağlanan Velocity yazılımı kullanılarak bu zaman atlamalı görüntünün dört boyutlu render işlemi, rod baskın hücre membranlarının ve GFP pozitif çekirdeklerin dinamik hücresel hareketlerini göstermektedir. Zebrafish embriyolarında hücre transplantasyonları için gerekli tüm aparat ve reaktiflerin nasıl hazırlanacağını göstermiş olduk.

Özellikle, bu tekniği gastrula aşamasında gösterdik. Ancak, yöntem blastula aşaması transplantasyonları için de uygulanabilir. Bu prosedür kullanılırken, transplant edilen hücrelerin istenen nihai konumu ile bu hücrelerin gastrula aşamasındaki daha önceki kader haritası konumu arasında kesin bir korelasyon kurmak önemlidir; daha fazla rehberlik için Dr. Scott Frazier'ın 1995 tarihli Fate Maps of the Zebrafish Embryo başlıklı zebrafish kader haritaları üzerine yaptığı ayrıntılı çalışmaya başvurun.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.